2. 安徽医科大学第一附属医院骨科，安徽 合肥 230088；安徽医科大学;
3. 安徽医科大学临床医学系，安徽 合肥 230032;
4. 安徽医科大学形态学实验中心，安徽 合肥 230032;
5. 安徽医科大学第三附属医院骨科，安徽 合肥 230061
2. Dept of Orthopedics, the First Affiliated Hospital Anhui Medical University, Hefei 230088, China;
3. Clinical Medical College, Anhui Medical University, Hefei 230032, China;
4. Microscopic Morphological Center Lab, Anhui Medical University, Hefei 230032, China;
5. Dept of Orthopedics, the Third Affiliated Hospital Anhui Medical University, Hefei 230061, China
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种病因不明的自身免疫性疾病，主要累及关节；此外，还可累及脑、肺以及消化系统等全身器官，即RA的关节外表现(extra-articular manifestations，EAMs)[1]。EAMs与RA致残和死亡率密切相关，越来越多的研究表明，氧化应激(oxidative stress, OS)是指体内氧化与抗氧化作用失衡的一种状态，活性氧(reactive oxygen species，ROS)失衡是RA发生发展的一个重要因素[2]。在胶原诱导型关节炎(collagen-induced arthritis，CIA)小鼠的肝脏中也发现有ROS的形成增加[3]。为了防止ROS的损伤作用，机体会激活核因子-E2相关因子2(nuclearfactor erythroidderived 2-like 2，Nrf2)对细胞氧化损伤和炎症的反应，而Kelch样ECH相关蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)是Nrf2的负调节器[4]。有研究表明，Nrf2/Keap1途径在肝脏损伤的预防及减轻中发挥着关键作用[5]。白藜芦醇(resveratrol，Res)是一种天然多酚，Res能够降低关节炎大鼠模型中的滑膜增生、炎症标志物和氧化损伤[6]。然而，Res是否同样能够减轻RA关节外损伤研究较少。本研究旨在探究Res通过Nrf2/Keap1途径减轻CIA小鼠肝脏炎症和氧化应激的内在机制，探究Res作为RA的保肝作用的可能性。
1 材料与方法 1.1 动物模型8周龄雄性C57/BL6小鼠, 体质量：(20~25) g，随机分为3组，每组5只：(1)Ctrl(对照组)，(2)CIA(关节炎模型组)，(3)CIA+Res(CR，CIA和Res处理的模型组，10 mg·kg-1)。雄性C57/BL6小鼠购自江苏集萃生物技术有限公司(南京，中国)，实验前在安徽医科大学实验室适应条件至少1周。CIA小鼠是由弗氏完全佐剂(complete Freund’s adjuvant，CFA，北京博雷德公司)和鸡Ⅱ型胶原(chicken Collagen Ⅱ，CCⅡ，北京博雷德公司)诱导的。将2 g·L-1的CCⅡ溶于0.05 mol·L-1的冰醋酸中，充分搅拌，然后在4 ℃下储存过夜。然后将CFA与等体积的溶解CCII混合，并在均质器中冰浴充分乳化，尾根注射给药。CIA+Res组的动物通过灌胃给药，Res(德国默克公司，纯度≥98.0%)溶解在0.5%的羧甲基纤维素钠(载体)中，最终浓度为1 g·L-1，每只动物服用0.01 mL·g-1，每天1次，共10 d。对照组通过尾根注射或灌胃相同体积的正常盐水作为阴性对照。Res的剂量是基于课题组前期研究成果[7]。在最后一次Res治疗后24 h后，取出小鼠肝组织并切下一部分进行病理学分析，取血清进行生化分析。其余的肝组织和血清立即冷冻在液氮中，用于后续的生物分析。
1.2 HE染色用4%中性多聚甲醛固定后，将小鼠肝脏组织包埋在常规脱水石蜡中。连续切片，厚度3.5 μm，将切片脱蜡并用梯度酒精和蒸馏水洗涤。苏木精染色15 s，用自来水冲洗20 min返蓝。用5%伊红染色3 min后，切片迅速脱水。最后使用中性树脂封片。
1.3 生物化学分析取小鼠新鲜血液，室温条件下静置30 min，待血液凝结，2 000 r·min-1离心10 min，取上层淡黄色澄清液体即为血清。在中国合肥安徽医科大学第一附属医院临床实验室使用自动化设备(Monach)测定血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)水平。采用商用试剂盒(中国南京建设生物工程研究所)测定肝组织还原型谷胱甘肽(GSH，A006-2-1)、丙二醛(MDA，A003-1-2)、和ROS(69-86537)含量。
1.4 细胞培养小鼠原代肝细胞(MPHs)按先前报道分离[8]，并在RPMI 1640培养基中培养(10%胎牛血清，1%青霉素和链霉素)。将细胞在含5%CO2的37 ℃培养箱培养。为了诱导CIA相关肝损伤的细胞模型，将重组TNF-α(德国默克公司)添加到细胞培养基中24 h。Nrf2抑制剂ML385购自MedChemExpress。Keap1过表达质粒购自擎科生物。
1.5 CCK-8细胞活力检测将MPHs细胞接种在96孔板中，密度为3×103每孔细胞数。6~12 h后，使用TNF-α诱导细胞24 h，然后在使用Res处理24 h，向每个孔中加入10 μL CCK-8溶液(北京白鲨生物公司)，将细胞孵育1~4 h。使用酶标仪测量细胞在450 nm处的吸光度，以确定Res对其活力的影响。
1.6 细胞ROS水平的检测DCFH-DA绿色荧光探针(上海碧云天生物公司)检测细胞ROS水平。细胞培养和处理同上，使用RPMI 1640将DCFH-DA稀释1 000倍配成工作液，加入1~2 mL工作液充分覆盖生长的细胞，37 ℃避光孵育20 min，PBS缓冲液清洗细胞3次，采用正置荧光显微镜摄片，ImageJ软件分析MPHs细胞的ROS变化情况。
1.7 Western blot使用制备的SDS裂解缓冲液从模型小鼠肝组织和经上述处理的MPHs细胞中提取总蛋白，用于蛋白质印迹分析。使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质并印迹到聚偏二氟乙烯膜上(PVDF，德国默克公司)。然后将膜在5%脱脂牛奶中密封2 h。使用特异性抗体进行Western blot检测，鼠抗β-actin、抗Keap1、抗Histone H3和兔抗Nrf2、抗HO-1抗体购自中国上海的Abmart公司，鼠抗TNF-α抗体购自中国武汉的Proteintech公司，按照其生产说明进行检测。
1.8 细胞转染与处理擎科生物设计和合成了针对Keap1的过表达质粒。根据制造商的说明，使用Lipo2000(美国赛默飞公司)将质粒的按照1 mg·L-1的浓度转染细胞。然后Western blot检测相关蛋白表达情况。
1.9 统计学方法本研究中所有的检测至少3份样本。应用GraphPad Prism 8.0软件进行数据分析。数据用x±s表示；组间比较进行t检验或单因素分析。检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 Res减轻CIA小鼠肝损伤首先建立Res治疗CIA小鼠模型，如Fig 1A小鼠肝脏HE染色表明，Res减轻了小鼠肝脏的损伤。如Fig 1B-1D所示，血清ALT、AST、ALP检测也表明Res减轻了CIA小鼠肝功能的损伤。
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| Fig 1 Res attenuated liver injury in CIA mice (x±s, n=5) Resveratrol inhibited the progression of CIA-associated liver injury in CIA mice. A: HE staining of mouse liver(×100, ×200); B-D: Serum ALT, AST, ALP assayed in mice. #P < 0.05, ##P < 0.01 vs Control group; *P < 0.05, **P < 0.01 vs CIA group. |
如Fig 2A结果显示，Res减少了CIA小鼠肝脏组织Keap1和TNF-α炎症相关蛋白的表达，而增加了Nrf2和HO-1的表达，结果表明Res减轻了CIA小鼠肝脏的炎症和氧化应激水平，同时激活了Nrf2/Keap1通路。如Fig 2B-2D结果所示，Res减轻了CIA小鼠肝脏的氧化应激水平。
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| Fig 2 Res attenuated inflammation and oxidative stress in liver of CIA mice (x±s, n=5) A: Western blot detection of protein expression levels of Nrf2, Keap1, HO-1, and TNF-α in each group; B-D: Mouse liver GSH, MDA, ROS levels detected by kit. #P < 0.05 vs Control group; *P < 0.05 vs CIA group. |
如Fig 3A显示，使用不同浓度的TNF-α刺激MPHs，24 h后CCK-8检测细胞活力，随着TNF-α浓度的增加，细胞活力逐渐下降，我们选择有效的最低浓度(5 μg·L-1)作为后续实验浓度。如Fig 3B显示，在加入TNF-α的基础上，使用同样的方法选择最合适的Res治疗浓度(20 μmol·L-1)，构建体外肝细胞受损和治疗模型。如Fig 3C的Western blot结果显示，Res减少了肝细胞Keap1和TNF-α炎症相关蛋白的表达，而增加了入核Nrf2和HO-1的表达。如Fig 3D所示，通过DCFH-DA探针检测了细胞模型中ROS的表达。结果表明，我们成功构建了CIA小鼠肝损伤体外细胞模型，并且Res能够减轻TNF-α诱导的MPHs炎症和氧化应激。
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| Fig 3 Res attenuated TNF-α-induced inflammation and oxidative stress in MPHs (x±s, n=5) A: MPHs were stimulated with different concentrations of TNF-α, and cell viability was detected by CCK-8 24 h later; B: TNF-α (5 μg·L-1) was added to MPHs, followed by different concentrations of Res, and cell viability was detected by CCK-8 after 24 h. C: Western blot detection of protein expression levels of N-Nrf2, Keap1, HO-1, and TNF-α in each group. D: DCFH-DA fluorescent probe utilized to measure intracellular ROS levels (×100). #P < 0.05, ##P < 0.01 vs Negative control group; *P < 0.05 vs TNF-α group. |
如Fig 4A所示，使用Nrf2抑制剂ML385处理细胞，通过Western blot检测Nrf2的蛋白表达，选择合适的浓度进行后续实验。如Fig 4B结果显示，TNF-α刺激组和Nrf2抑制组炎症和氧化应激水平明显升高，Nrf2的表达明显降低，而添加Res后，炎症和氧化应激水平降低，Nrf2的表达增加。
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| Fig 4 Inhibition of Nrf2 promoted inflammation and oxidative stress in MPHs cells (x±s, n=5) A: The cells were treated with different concentrations of ML385, and the changes of Nrf2 protein expression were detected by Western blot; B: The protein expressions of Nrf2, HO-1 and TNF-α were detected by Western blot. #P < 0.01 vs Control group; *P < 0.01 vs TNF-α group; ▲P < 0.01 vs Control group; ▽P < 0.01 vs ML385. |
有研究报道，Keap1负向调节Nrf2[9]，因此我们构建Keap1过表达质粒转染MPHs细胞。如Fig 5所示，Western blot结果表明，过表达Keap1和TNF-α刺激组的细胞核内Nrf2和细胞HO-1、SOD2表达明显降低，Keap1、TNF-α的表达增加，而Res可增加细胞核内Nrf2和细胞HO-1、SOD2表达，并减少Keap1和TNF-α的表达。
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| Fig 5 Overexpression of Keap1 promoted inflammation and oxidative stress in MPHs (x±s, n=5) The protein expressions of N-Nrf2, Keap1, HO-1 and TNF-α were detected by Western blot. #P < 0.01 vs Control group; *P < 0.01 vs TNF-α group; ▲P < 0.01 vs Control group; ▽P < 0.01 vs ML385 group. |
RA病因未明，主要累及关节[10]。此外，关节外肝脏也存在着损伤[3]。本研究采用了鸡Ⅱ型胶原与弗氏完全佐剂联合诱导关节炎小鼠模型，实验结果显示，CIA小鼠血清AST、ALT、ALP等肝功能指标升高；肝脏组织Western blot结果显示TNF-α蛋白表达水平升高，HO-1蛋白表达水平降低。这些结果表明CIA小鼠肝功能受损，肝脏炎症和氧化应激水平升高。为了从细胞层面进一步验证，我们使用TNF-α刺激MPHs细胞构建CIA小鼠肝损伤体外细胞模型。Western blot结果显示，细胞TNF-α的蛋白表达增加，HO-1的蛋白表达减少。DCFH-DA检测细胞ROS水平增加。实验结果表明细胞炎症和氧化应激水平升高，与动物实验结果相符。
Nrf2在诱导机体的抗氧化应答中起着重要作用，Keap1是Nrf2的负调节器，Nrf2/Keap1途径在肝脏损伤的预防及减轻中发挥着关键作用[11]。CIA小鼠肝组织Western blot结果显示，Nrf2蛋白表达水平降低，Keap1蛋白表达水平增加，表明CIA小鼠肝脏Nrf2/Keap1通路受到抑制。MPHs细胞实验结果与动物实验结果相符。
Res被认为是一种天然的抗氧化剂[12]，本研究通过管饲法对CIA小鼠予Res处理，实验结果表明，Res降低了小鼠血清ALT、AST、ALP等水平和肝组织TNF-α、Keap1的蛋白表达，增加了HO-1、Nrf2的蛋白表达，表明Res能激活Nrf2/Keap1通路，减轻CIA小鼠肝脏的炎症和氧化应激水平。向经TNF-α刺激的MPHs中加入Res，实验结果与动物实验相符。为了进一步探究Nrf2/Keap1通路在Res减轻CIA小鼠肝脏炎症和氧化应激中的作用关系，本研究使用Nrf2抑制剂和Keap1过表达质粒处理MPHs，Western blot结果显示，Nrf2的抑制和Keap1的过表达促进MPHs的炎症和氧化应激，Res通过激活MPHs细胞Nrf2/Keap1信号通路，从而起到抗炎抗氧化作用。
综上所述，Res通过Nrf2/Keap1途径恢复抗氧化能力减轻了CIA小鼠肝脏炎症和氧化应激。这为Res作为治疗RA相关肝损伤的有效药物提供了一种可能。此外明确了Res通过Nrf2/Keap1途径恢复肝脏抗氧化能力减轻RA相关肝损伤的内在机制，为更好的寻找肝损伤治疗靶点提供了理论依据。
然而，我们只研究了Res对小鼠肝细胞的影响，未研究Res对肝星状细胞等非实质性细胞的影响。对Res对Nrf2/Keap1信号通路的调控机制还需要进一步加深研究。
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