2. 安徽医科大学第一临床医学院，安徽 合肥 230032;
3. 安徽医科大学第二临床医学院，安徽 合肥 230601;
4. 安徽医科大学生命科学院遗传学系，安徽 合肥 230032
2. the First Clinical College, Anhui Medical University, Hefei 230032, China;
3. the Second Clinical College, Anhui Medical University, Hefei 230601, China;
4. Dept of Genetics, School of Life Sciences, Anhui Medical University, Hefei 230032, China
围术期中急性肾损伤(acute kidney injury, AKI)与高死亡率相关，并易导致慢性肾脏疾病的进展[1]，影响患者的预后。而肾移植，心脏手术后不可避免发生的缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)损伤，是AKI最常见的原因之一[2]。尽管有文献揭示了I/R损伤的几种机制，然而尚未提出有效的治疗手段。研究表明在AKI过程中，肾近端小管上皮细胞发生了代谢重编程，表现为代谢模式由脂肪酸β-氧化转变为糖酵解来维持器官所需的ATP水平，而糖酵解已经被证实加重肾脏I/R诱发的损伤和纤维化[3-4]。葡萄糖转运蛋白1(glucose transporter 1, GLUT1)是一种转运葡萄糖的载体蛋白，广泛分布于各种组织中，已有文献表明GLUT1依赖性的糖摄入可以通过提高糖酵解而促进肿瘤侵袭[5]。而GLUT1是否参与调控肾脏I/R诱导的糖酵解暂无文献报道。右美托咪定(dexmedetomidine, Dex)作为临床上常用的镇静镇痛药，已经证实可以改善I/R损伤[6-7]，且Dex被证实可以通过抑制糖酵解改善脂多糖诱发的炎症反应而减轻损伤[8-9]。我们前期测序和预实验发现Dex可以降低小鼠I/R肾脏内GLUT1和糖酵解关键酶的表达，于是我们假设GLUT1依赖性的糖酵解信号通路可能参与Dex减轻人肾近端小管上皮(human kidney-2, HK-2)细胞氧糖剥夺-复氧复糖(oxygen-glucose deprivation-reoxygenation, OGD/R)损伤，这将为明确Dex的肾脏保护机制提供参考。
1 材料 1.1 实验动物与细胞株雄性C57/BL6小鼠18只，8周龄，体质量(18~22)g，购于斯贝福(北京)生物技术有限公司，生产许可证编号为SCXK(京)2019-0010，质量合格证编号为110324231104290 026，于安徽医科大学第二附属医院麻醉与围术期学科重点实验室动物房饲养。本研究动物实验已得到安徽医科大学伦理委员会批准，伦理编号：LLSC20232230。HK-2细胞购于武汉普诺赛公司，在含10%胎牛血清，1%青霉素-链霉素的依格尔改良培养基(dulbecco’s modified eagle medium, DMEM)低糖培养基中培养，并置于37 ℃, 5% CO2培养箱。待细胞生长至对数生长期，使用含0.02%乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)的0.25%胰酶消化细胞，将细胞悬液接种至细胞培养皿或孔板中进行后续实验。
1.2 试剂DMEM低糖培养基和无糖培养基购于武汉普诺塞公司；抗体GLUT1、己糖激酶2(hexokinase 2，HK2)和内参β-tubulin购于万类生物有限公司、6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3(6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 3,PFKFB3)购于武汉三鹰生物技术有限公司；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)、乳酸、肌酐(creatinine, Cr)和尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)试剂盒购于南京建成生物工程研究所；CCK-8试剂盒购于白鲨生物公司，细胞外酸化率(extracellular acidification rate, ECAR)试剂盒购于贝博生物公司，Dex购于扬子江药业；2-脱氧葡萄糖(2-Deoxy-D-glucose, 2-DG)购于美国MCE公司；BCA蛋白定量试剂盒购于碧云天科技公司；PCR引物购自上海生工生物工程有限公司；si-GLUT1、质粒和转染试剂购于苏州吉玛基因股份有限公司。
1.3 仪器CCK-8、乳酸、LDH、ECAR、BCA、Cr和BUN检测使用VarioskanTM LUX多功能微孔板读数仪(美国ThermoFisher公司)。qRT-PCR检测使用CFX96 Touch实时定量荧光PCR仪(美国Biorad公司)，Western blot检测使用全自动化学发光图像分析仪天能Tanon5200(上海天能生物公司)。
2 方法 2.1 肾I/R模型与分组将C57小鼠饲养适应1周后将其分成3组：假手术组(Sham组)，缺血/再灌注组(I/R组)，Dex处理组(I/R+Dex组)。I/R组将其麻醉后游离出左右双肾，用血管夹夹闭双肾肾蒂45 min，之后松开血管夹并将肾脏归位，缝合肌肉层和皮层后待其苏醒。I/R+Dex组在术前30 min和松开血管夹两个时间点以50 μg·kg-1的剂量腹腔注射Dex。Sham组仅将双肾游离出后归位，再缝合肌肉层和皮层即可。待48 h后再灌注期结束，取材进行后续实验。
2.2 OGD/R模型与分组HK-2细胞分为7组：对照组(Control组)，OGD/R组，OGD/R+糖酵解抑制剂组(OGD/R+2-DG组)，OGD/R+Dex组，OGD/R+GLUT1干扰组(OGD/R+si-GLUT1组)，OGD/R+GLUT1干扰+Dex组(OGD/R+si-GLUT1+Dex组)，OGD/R+Dex+GLUT1过表达组(OGD/R+Dex+OE-GLUT1组)。将培养基更换为无糖培养基，放置于95% N2和5% CO2的缺氧小室中，在培养箱中培养12 h，之后更换回低糖培养基，转移至有氧环境中培养12 h。Dex组在细胞进行OGD/R之前24 h向细胞培养基中加入Dex，之后全程浓度维持在1 μmol·L-1。2-DG组在建模前24 h更换为含2-DG的培养基，浓度为25 μmol·L-1。转染组将HK-2细胞用含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养以6×104个·mL-1的密度接种于96孔板(100 μL/孔)、6孔板(2 mL/孔)或培养皿(6 cm)，待细胞于培养箱中达到30%融合度时进行si-GLUT1或质粒转染24 h，之后进行相应的分组处理。si-GLUT1序列为：5′-TGAGCATCGTGGCCAT CTT-3′。Control组仅在各处理组更换培养基的同时也更换新的低糖培养基。
2.3 细胞活性检测选择生长状态好的HK-2细胞，均匀种植在96孔板上，建立模型后每孔加入CCK-8试剂10 μL，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养1 h，选择450 nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值并计算。
2.4 乳酸、LDH、Cr和BUN检测取血清和细胞上清液进行实验，取20 μL的样本液加入至96孔板中，按照试剂盒的要求操作，并计算乳酸、LDH、Cr与BUN。
2.5 ECAR检测使用ECAR检测试剂盒提供的pH敏感的BBcellProbe P61荧光探针分析ECAR。在37 ℃的动力学模式下读取2 h (每3分钟读取1次，Ex488/Em580)。根据说明书计算ECAR。
2.6 蛋白检测加入裂解液后组织选择研磨，细胞选择超声破碎来提取总蛋白。离心后取上清液煮沸变性，采用BCA法检测蛋白浓度，将蛋白液加入SDS-PAGE凝胶泳道中电泳分离，之后转移至PVDF膜上，使用5%脱脂牛奶封闭2 h后在4 ℃孵育一抗过夜，d 2洗膜后，二抗与脱脂牛奶按照1 ∶ 10 000的比例孵育1 h，TBST洗膜3遍后，使用ECL显影液曝光，ImageJ分析蛋白条带的灰度值。
2.7 mRNA检测提取各组细胞总RNA, 经过孵育(37 ℃，15 min)和加热(85 ℃，5 s)逆转录成为DNA，使用SYBR qPCR Master mix进行qRT-PCR。扩增参数设置为95 ℃预变性(30 s，1个循环)接着，95 ℃(10 s)，60℃(30 s)共40个循环，以检测GLUT1、HK2、PFKFB3、白细胞介素6(interleukin-6, IL-6)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)的mRNA含量。相关引物序列为：(5′-3′)：GLUT1-F: GTGGATTGAGGGTAGGAGGTTTGG, GLUT1-R: GAGCAAGAGGACACTGATGAGAGG; HK2-F: GCC AGAGCATCCTCCTCAAGTG, HK2-R: TCACCACAG CAACCACATCCAG; PFKFB3-F: GGAGCGGAACAC CTGGCATC, PFKFB3-R: TGAAGAAGTGGCTGCGA GTGAG; β-tubulin-F: AAGTTCGCACTGGCACCTA CC, β-tubulin-R: CGGGCATAGTTATTGGCAGCATC; IL-6-F: TGGTGTTGCCTGCTGCCTTC, IL-6-R: GCT GAGATGCCGTCGAGGATG; TNF-α-F: GAGTCTGGG CAGGTCTACTTTGG, TNF-α-R: GAAGAGGTTGAG GGTGTCTGAAGG
2.8 统计学方法采用GraphPad Prism 8.0软件进行分析。正态分布的计量资料以x±s表示，多组之间的数据比较采用单因素方差分析。检验水准α=0.05。
3 结果 3.1 小鼠的Cr、BUN以及Western blot结果为了评价Dex对肾I/R过程中的作用，我们构建了小鼠肾I/R模型并且在术前30 min和再灌注开始时腹腔注射Dex。通过Cr和BUN评估肾功能，Western blot检测糖酵解相关蛋白。结果表明Dex能够有效改善小鼠肾功能(P < 0.01, Fig 1A，1B)，且与Sham组相比，I/R组GLUT1、HK2、PFKFB3蛋白水平上升(P < 0.01)；与I/R组相比，I/R+Dex组GLUT1、HK2、PFKFB3蛋白水平下降(P < 0.05, Fig 1C-1F)。
|
| Fig 1 Creatinine (Cr), urea nitrogen (BUN) and protein levels in mice (x±s) A, B: Cr and BUN level forassessing renal function after Dex treatment (n=6); C-F: Western blot analysis of GLUT1, HK2, PFKFB3 in the renal tissue (n=4). **P < 0.01 vs Sham group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs I/R group. |
我们在HK-2细胞上构建OGD/R模型来模拟肾I/R损伤，为了探讨糖酵解和GLUT1在肾I/R中的作用，加入了糖酵解抑制剂2-DG作为阳性对照，转染siRNA来敲低GLUT1。结果表明，与Control组相比，OGD/R组细胞存活率明显下降、LDH升高(P < 0.05)；与OGD/R组相比，OGD/R+2-DG、OGD/R+Dex和OGD/R+si-GLUT1组细胞存活率明显升高(P < 0.05)、LDH下降(P < 0.05)，而在敲低GLUT1后加用Dex发现，与OGD/R+si-GLUT1组相比，细胞存活率、LDH未出现明显改变(P>0.05)，见Tab 1。提示Dex可改善由GLUT1依赖性糖酵解加重的OGD/R损伤。
| Group | Cell viability/% | LDH (fold) |
| Control | 100.0±7.17 | 1.000±0.06 |
| OGD/R | 46.6±2.08 | 1.438±0.14 |
| OGD/R+2-DG | 62.8±0.90 | 1.144±0.06 |
| OGD/R+Dex | 65.7±3.35 | 1.117±0.06 |
| OGD/R+si-GLUT1 | 59.0±3.26 | 1.055±0.07 |
| OGD/R+si-GLUT1+Dex | 59.5±1.33 | 1.066±0.11 |
| F value | 122.30 | 16.36 |
| P value | < 0.01 | < 0.01 |
ECAR与糖酵解产物乳酸被公认为是反映糖酵解的指标。研究结果显示，与Control组相比，OGD/R组乳酸、ECAR水平上调(P < 0.05)；与OGD/R组相比，OGD/R+2-DG、OGD/R+Dex和OGD/R+si-GLUT1组乳酸、ECAR水平下降(P < 0.05)；与OGD/R+si-GLUT1组相比，OGD/R+si-GLUT1+Dex组乳酸、ECAR水平无显著性差异(P>0.05)，见Tab 2。说明Dex通过抑制GLUT1的表达来逆转OGD/R诱导的糖酵解增加。
| Group | Lactate/mmol·L-1 | Basic glycolysis/% | Glycolytic potential/% |
| Control | 1.626±0.09 | 100.0±10.20 | 100.0±10.35 |
| OGD/R | 4.868±0.65 | 384.8±9.88 | 327.0±5.27 |
| OGD/R+2-DG | 3.206±0.31 | 223.3±8.68 | 173.3±5.48 |
| OGD/R+Dex | 2.903±0.18 | 268.0±6.31 | 248.7±9.71 |
| OGD/R+si-GLUT1 | 3.843±0.40 | 217.8±6.89 | 156.1±4.02 |
| OGD/R+si-GLUT1+Dex | 3.184±0.24 | 224.8±6.23 | 157.4±6.35 |
| F value | 44.43 | 629.7 | 622.1 |
| P value | < 0.01 | < 0.01 | < 0.01 |
qRT-PCR检测糖酵解相关mRNA GLUT1、HK2及PFKFB3的表达，见Fig 2。结果显示，与Control组相比，OGD/R组GLUT1、HK2、PFKFB3 mRNA上调(P < 0.01)；与OGD/R组相比，OGD/R+2-DG、OGD/R+Dex和OGD/R+si-GLUT1组GLUT1、HK2、PFKFB3 mRNA下调(P < 0.01)；与OGD/R+si-GLUT1组相比，OGD/R+si-GLUT1+Dex组GLUT1、HK2、PFKFB3 mRNA无显著性差异(P>0.05)。这表明Dex降低了GLUT1 mRNA的表达，从而抑制了HK2、PFKFB3的mRNA水平。
|
| Fig 2 Comparison of GLUT1, HK2 and PFKFB3 mRNA in HK-2 cells (x±s, n=6) A-C: Effect of Dex on glycolysis-related mRNAs 24 h after transfection of siRNAs. 2-DG was set as a positive control for inhibition of glycolysis.1:Control; 2:OGD/R; 3:OGD/R+2-DG; 4:OGD/R+Dex; 5:OGD/R+si-GLUT1; 6:OGD/R+si-GLUT1+Dex. **P < 0.01 vs Control group; ##P < 0.01 vs OGD/R group. |
Western blot检测糖酵解相关酶GLUT1、HK2及PFKFB3的表达，结果见Fig 3。研究发现，与Control组相比，OGD/R组GLUT1、HK2、PFKFB3蛋白水平上调(P < 0.05)；与OGD/R组相比，OGD/R+2-DG、OGD/R+Dex和OGD/R+si-GLUT1组GLUT1、HK2、PFKFB3蛋白水平下调(P < 0.05)；与OGD/R+si-GLUT1组相比，OGD/R+si-GLUT1+Dex组GLUT1、HK2、PFKFB3蛋白水平无显著性差异(P>0.05)。与qRT-PCR结果一致，这提示Dex通过抑制GLUT1表达，继而抑制糖酵解关键酶HK2、PFKFB3表达来逆转OGD/R诱导的糖酵解上升。
|
| Fig 3 The protein expression of GLUT1, HK2 and PFKFB3 in HK-2 cells (x±s, n=6) A-D: Effects of Dex on glycolytic proteins via GLUT1 24 h after transfection of siRNAs. 1:Control; 2:OGD/R; 3:OGD/R+2-DG; 4:OGD/R+si-GLUT1; 5:OGD/R+si-GLUT1+Dex; 6:OGD/R+Dex. **P < 0.0 1vs Control group; ##P < 0.01 vs OGD/R group. |
为了进一步评估GLUT1在Dex中的作用，我们在Dex处理的基础上通过质粒过表达GLUT1。结果表明，与Control组相比，OGD/R组细胞存活率水平降低(P < 0.01)，IL-6和TNF-α的mRNA水平上升，GLUT1、HK2、PFKFB3蛋白水平上调(P < 0.01)；与OGD/R组相比，OGD/R+Dex组细胞存活率上升(P < 0.01)，IL-6和TNF-α的mRNA水平下降，GLUT1、HK2、PFKFB3蛋白水平减少(P < 0.01)；与OGD/R+Dex组相比，OGD/R+Dex+OE-GLUT1组细胞存活率出现明显下降(P < 0.01)，IL-6和TNF-α的mRNA水平上升(P < 0.01)，GLUT1、HK2、PFKFB3蛋白水平上调(P < 0.05)，结果见Fig 4。与敲低GLUT1进行Dex处理得出的结论一致，以上结果提示Dex通过抑制GLUT1介导糖酵解减轻OGD/R诱导的炎症反应从而改善细胞损伤。
|
| Fig 4 The protein levels of GLUT1, HK2 and PFKFB3, inflammation, and cell survival after GLUT1 overexpressed by plasmid (x±s) A: Cell survival was determined by CCK-8 kit after GLUT1 overexpressed (n=6); B: The mRNA levels of IL-6 and TNF-α was determined by qRT-PCR analysis (n=6); C-F: Effect of overexpression of GLUT1 on Dex inhibition of glycolytic proteins was determined by Western blot analysis (n=4).1:Control; 2:OGD/R; 3:OGD/R+Dex; 4:OGD/R +Dex+OE-GLUT1. **P < 0.01 vs Control group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs OGD/R group; △P < 0.05, △△P < 0.01 vs OGD/R+Dex group. |
肾脏I/R损伤是急性肾脏损伤发生的主要病因，期间涉及多种机制包括炎症反应、线粒体损伤、内质网应激和焦亡等[10-11]。Dex已经被证实可以通过抑制糖酵解改善脂多糖诱发的细胞炎症，但是Dex能否通过抑制糖酵解改善OGD/R诱导的HK-2细胞损伤尚未见研究。本实验结果表明，Dex与糖酵解抑制剂2-DG均可以明显抑制GLUT1的表达并抑制OGD/R诱发的HK-2细胞糖酵解状态。然而，Dex无法进一步改善使用2-DG后细胞的糖酵解和损伤，这证明了Dex通过抑制糖酵解通路改善OGD/R诱发的HK-2细胞损伤。
肾脏是人体中最需要能量的器官之一，因而完成物质排泄和重吸收的肾小管，是能量代谢最活跃的区域。在缺氧环境下，真核细胞的代谢由线粒体呼吸转换为无氧糖酵解，以维持能量供给。虽然糖酵解的增强最初会节省氧气并维持ATP的产生，但从长远来看，糖酵解对线粒体功能有有害影响[12]。糖酵解的终产物乳酸已被证明可通过抑制自噬加重脓毒症诱发的AKI[13]，高乳酸环境同样也能促进Fis1乙酰化加重AKI[14]。GLUT1表达于细胞膜表面，能够促进葡萄糖向细胞内转运，在能量代谢中起着至关重要的作用，且在肾近端小管处表达量极高[15]。而且GLUT1介导的糖酵解被证实可以促进巨噬细胞的炎症激活[16]。因此，我们推测在OGD/R时，Dex可以抑制GLUT1介导的糖酵解来减轻其引起的细胞损伤。本实验结果表明，si-GLUT1可以抑制OGD/R后糖酵解能力以及相关mRNA和蛋白的表达，与OGD/R组相比，明显改善了细胞存活率，降低了LDH活性。并且在使用Dex之后，不能进一步的改善si-GLUT1所起到减轻细胞糖酵解和损伤的作用。因此这证明了Dex主要通过抑制GLUT1，抑制了HK-2细胞的糖酵解速率从而减轻OGD/R引起的细胞损伤。
综上所述，Dex通过抑制GLUT1依赖性的糖酵解减轻OGD/R诱发的HK-2细胞损伤。本研究结果有待后续体内实验进一步验证，为Dex在围术期麻醉中的运用提供理论依据。
| [1] |
Guo R, Duan J, Pan S, et al. The road from AKI to CKD: molecular mechanisms and therapeutic targets of ferroptosis[J]. Cell Death Dis, 2023, 14(7): 426. doi:10.1038/s41419-023-05969-9 |
| [2] |
Xiong M, Chen H, Fan Y, et al. Tubular Elabela-APJ axis attenuates ischemia-reperfusion induced acute kidney injury and the following AKI-CKD transition by protecting renal microcirculation[J]. Theranostics, 2023, 13(10): 3387-401. doi:10.7150/thno.84308 |
| [3] |
Jiang A, Liu J, Wang Y, et al. cGAS-STING signaling pathway promotes hypoxia-induced renal fibrosis by regulating PFKFB3-mediated glycolysis[J]. Free Radic Biol Med, 2023, 208: 516-29. doi:10.1016/j.freeradbiomed.2023.09.011 |
| [4] |
Yang Y, Zhan X, Zhang C, et al. USP25-PKM2-glycolysis axis contributes to ischemia reperfusion-induced acute kidney injury by promoting M1-like macrophage polarization and proinflammatory response[J]. Clin Immunol, 2023, 251: 109279. doi:10.1016/j.clim.2023.109279 |
| [5] |
Song X, Liu J, Kuang F, et al. PDK4 dictates metabolic resistance to ferroptosis by suppressing pyruvate oxidation and fatty acid synthesis[J]. Cell Rep, 2021, 34(8): 108767. doi:10.1016/j.celrep.2021.108767 |
| [6] |
赵万里, 张鹏举, 马启斌, 等. 右美托咪定调控DDR1对大鼠脑缺血/再灌注氧化应激的影响[J]. 中国药理学通报, 2021, 39(6): 1199-200. Zhao W L, Zhang P J, Ma Q B, et al. Effects of dexmedetomidine modulation of DDR1 on cerebral ischemia-reperfusion in rats[J]. Chin Pharmacol Bull, 2021, 39(6): 1199-200. |
| [7] |
Tao W H, Shan X S, Zhang J X, et al. Dexmedetomidine attenuates ferroptosis-mediated renal ischemia/reperfusion injury and inflammation by inhibiting ACSL4 via α2-AR[J]. Front Pharmacol, 2022, 13: 782466. doi:10.3389/fphar.2022.782466 |
| [8] |
Meng Q, Guo P, Jiang Z, et al. Dexmedetomidine inhibits LPS-induced proinflammatory responses via suppressing HIF1α-dependent glycolysis in macrophages[J]. Aging (Albany NY), 2020, 12(10): 9534-48. |
| [9] |
Meng F, Yu W, Duan W, et al. Dexmedetomidine attenuates LPS-mediated BV2 microglia cells inflammation via inhibition of glycolysis[J]. Fundam Clin Pharmacol, 2020, 34(3): 313-20. doi:10.1111/fcp.12528 |
| [10] |
Wang J, Yu Y, Zhang H, et al. Gypenoside XVⅡ attenuates renal ischemia-reperfusion injury by inhibiting endoplasmic reticulum stress and NLRP3 inflammasome-triggered pyroptosis[J]. Eur J Pharmacol, 2024, 962: 176187. doi:10.1016/j.ejphar.2023.176187 |
| [11] |
Ma N, Lu H, Li N, et al. CHOP-mediated Gasdermin E expression promotes pyroptosis, inflammation, and mitochondrial damage in renal ischemia-reperfusion injury[J]. Cell Death Dis, 2024, 15(2): 163. doi:10.1038/s41419-024-06525-9 |
| [12] |
Faivre A, Verissimo T, Auwerx H, et al. Tubular cell glucose metabolism shift during acute and chronic injuries[J]. Front Med (Lausanne), 2021, 8: 742072. |
| [13] |
Tan C, Gu J, Li T, et al. Inhibition of aerobic glycolysis alleviates sepsis-induced acute kidney injury by promoting lactate/Sirtuin 3/AMPK-regulated autophagy[J]. Int J Mol Med, 2021, 47(3): 19. doi:10.3892/ijmm.2021.4852 |
| [14] |
An S, Yao Y, Hu H, et al. PDHA1 hyperacetylation-mediated lactate overproduction promotes sepsis-induced acute kidney injury via Fis1 lactylation[J]. Cell Death Dis, 2023, 14(7): 457. doi:10.1038/s41419-023-05952-4 |
| [15] |
Vallon V, Nakagawa T. Renal tubular handling of glucose and fructose in health and disease[J]. Compr Physiol, 2021, 12(1): 2995-3044. |
| [16] |
Renaudin F, Orliaguet L, Castelli F, et al. Gout and pseudo-gout-related crystals promote GLUT1-mediated glycolysis that governs NLRP3 and interleukin-1β activation on macrophages[J]. Ann Rheum Dis, 2020, 79(11): 1506-14. doi:10.1136/annrheumdis-2020-217342 |