2. 山西白求恩医院肾内科，山西 太原，030032;
3. 教育部慢性肾脏病医药基础研究创新中心，山西医科大学，山西 太原 030001
2. Dept of Nephrology, Baiqiu'en Hospital, Taiyuan 030032, China;
3. Innovative Center for Basic Pharmaceutical Research on Chronic Kidney Disease, Ministry of Education, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China
随着现代社会的发展和经济的提升，人们的生活水平得到了质的提高，但是随之而来了一些问题。在日常饮食中摄入过量的盐和糖类会导致心血管疾病和糖尿病等慢性代谢性疾病的增加[1]，其中Ⅱ型糖尿病(diabetes mellitus, type2，T2DM)的发病率的增加尤为明显。据统计，大约30%~40%的糖尿病患者将发展成糖尿病肾病(diabetic kidney disease，DKD)[2]。DKD的发病机制复杂，氧化应激、血糖水平升高、炎症、缺氧都可促进DKD的进展，其中血糖水平的升高是DKD的潜在关键原因，血糖升高会导致许多功能障碍，例如炎症发生、足细胞损伤、高血压的发生、肾脏缺氧、线粒体功能障碍，最终导致肾小球滤过率下降和蛋白尿的产生[3-4]。目前治疗DKD的方法十分单一，现在主要控制DKD的策略为降低体内血糖水平并且需要终身服药治疗，但控制效果不佳[5]，所以亟需对糖尿病肾病的潜在机制进行进一步研究。
焦亡是一种细胞程序性死亡过程，并且焦亡在固有免疫中发挥着重要的作用[6]。DKD的进展与焦亡有着密不可分的关系[7]。最近有研究证明，在DKD模型中，焦亡相关NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3, NLRP3)炎症小体的激活可促进DKD的进展[8]。这提示抑制NLRP3炎症小体介导焦亡可能是治疗DKD导致的肾脏损伤的一个新的靶点。
中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps，NETs)，是中性粒细胞受到细菌、真菌、原生动物、高糖等刺激后，中性粒细胞核内的致密的染色质发生解聚变成松散的染色质，之后核膜发生破裂，松散的染色质进入胞内，形成一种网状结构其松散的染色质上附着瓜氨酸化组蛋白3(cit-histone3，CITH3)、中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)和髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)等蛋白[9-10]。NETs和NLRP3炎症小体介导的焦亡有着紧密的关系。有研究证明，在化脓性肺损伤模型中，NETs通过调节NLRP3去泛素化诱导肺泡巨噬细胞焦亡，加重化脓性肺损伤的发生[11]。但是在DKD中，NETs与焦亡的的具体机制尚不明确。因此，本研究通过构建DKD模型，探讨NETs对DKD引起的肾脏组织损伤促进作用和潜在机制，为临床治疗DKD提供一个新的治疗方法。
1 材料与方法 1.1 实验动物在山西医科大学实验动物中心，SCXK(晋)2019-0004，购买SPF级4周龄雄性C57BL/6小鼠，体质量(7~19)g，饲养于山西医科大学实验动物中心SPF级环境中，所有动物实验操作均符合伦理原则。
1.2 主要试剂及仪器小鼠中性粒弹性蛋白酶ELISA试剂盒及小鼠髓过氧化物酶ELISA试剂盒购自上海爱萌优宁生物公司；MASSON、HE、PAS染色试剂盒均购自武汉塞维尔生物科技有限公司；肌酐(serum creatinine, Scr)测定试剂盒、尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)测定试剂盒和尿蛋白测定试剂盒购自南京建成生物科技有限公司；抗CITH3、MPO抗体购自英国Cohesion Biosciences公司；抗NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β、IL-18、GSDMD等抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；抗NF-κB抗体购自ABclonal公司，抗TLR4、IκB、p-IκB抗体购自武汉三鹰科技有限公司；SABC免疫组织化学试剂盒购自武汉博士德生物公司；DAB显色试剂盒购自北京中衫金桥生物技术有限公司；SDS-PAGE电泳系统购自美国Bio-Rad公司；倒置荧光显微镜购自日本Nikon公司；化学发光成像仪购自上海天能公司。
1.3 动物造模，分组及给药54只雄性C57BL/6小鼠按照随机数法将小鼠分为对照组和模型组，其中对照组小鼠18只给予低脂低糖对照饲料饲养，模型组小鼠34只给予60%高脂模型饲料饲养。持续饲养6周，在模型组中确认产生胰岛素抵抗的小鼠，持续两天腹腔注射小剂量的链脲佐菌素(streptozotocin，STZ), 65 mg·kg-1。在注射STZ后的d 3和d 10，对小鼠进行禁食后，测定小鼠空腹血糖, 如两次测定值均高于11.1 mmol·L-1，认定T2DM模型构建成功。将对照组的小鼠按照随机数法分为正常对照组和DNaseⅠ对照组，每组各9只，持续低脂喂养；将30只模型小鼠按照随机数法分为DKD组、DKD+DNaseⅠ组，每组各15只，持续高脂喂养。DNaseⅠ剂量为1 000 kU·L-1尾静脉注射，1周3次，200 U/次，注射16周；
1.4 生化指标检测将小鼠麻醉后，迅速摘除眼球，收集血液样本于1.5 mL的EP管内，室温静止，离心机预冷到4 ℃以3 000 r·min-1的转速离心10 min，取血清按照测定试剂盒操作步骤检测相应生化指标。
1.5 PAS、MASSON、HE染色肾脏组织固定石蜡切片，进行脱蜡后，按照相应染色试剂盒说明书对小鼠肾脏组切片进行染色。
1.6 蛋白免疫印迹称取小鼠组织，浸泡于蛋白裂解中进行充分研磨，离心(4 ℃，12 000 r· min-1，15 min)，吸取上清，测定蛋白浓度，蛋白变性后，进行SDS-PAGE电泳，将蛋白转至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温后，按照相应抗体说明书配置抗体(CITH3, 1 ∶1 000;MPO, 1 ∶1 000;NLRP3, 1 ∶2 000;Caspase-1, 1 ∶1 000;ASC, 1 ∶1 000;IL-1β，1 ∶500;IL-18, 1 ∶2 000;NF-κB, 1 ∶500; TLR4, 1 ∶1 000;IκB, 1 ∶1 000;p-IκB, 1 ∶1 000), 4 ℃孵育过夜，TBST溶液洗涤，相应二抗孵育1 h, TBST溶液洗涤, 置好的化学发光液均匀覆盖于膜表面，进行曝光显影，保存条带图像并进行分析。
1.7 免疫组织化学石蜡切片脱蜡至水，滴加3% H2O2避光孵育，浸泡于柠檬酸钠缓冲液中煮沸，冷却后，滴加5%牛血清白蛋白(bovine albumin，BSA)封闭30 min，滴加PBS稀释的一抗(CITH3, MPO, NLRP3, Caspase-1, ASC, IL-18, IL-1β稀释比例均为1 ∶100)，4 ℃孵育过夜，放置于室温后，加生物素标记的二抗，滴加链霉亲和素-生物素-辣根过氧化物酶复合物，DAB显色，镜下观察，蒸馏水冲洗以停止显色。
1.8 统计学分析应用GraphPad Prism 8.3.0统计软件进行统计学分析，计量资料采用x±s表示，组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，两组间比较采用t检验，检验水准α=0. 05。
2 结果 2.1 DKD中有NETs的产生与对照组比较，DKD组小鼠血清中NE和MPO含量明显升高，与DKD组相比，DKD+DNaseⅠ组小鼠血清中NE和MPO含量明显降低(Fig 1A，P＜0.01)；免疫印记法、免疫组织化学法结果显示，DKD组小鼠肾脏组织中NETs的相关指标CITH3和MPO蛋白表达相较于对照组明显升高；与DKD组相比，DKD+DNaseⅠ组CITH3和MPO含量明显降低。这些结果再次验证了在糖尿病小鼠中有NETs的产生，并且DNaseⅠ可以降解NETs的含量((Fig 1B, 1C，P＜0.01)。
|
| Fig 1 Results of NETs in each group (x±s, n=3) A: Content of NE and MPO in serum; B: CITH 3 and MPO protein expression and semi-quantitative results; C: Immunohistochemical results and semi-quantitative results of CITH 3 and MPO (×400).**P < 0.01 vs NC group; ##P < 0.01 vs DKD group. |
为了探索在DKD中NETs是否可以促进肾脏功能异常，我们检测了肾功能的相关指标：血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)和尿液中的相关指标(尿蛋白和24小时尿蛋白)。结果显示，DKD组小鼠血肌酐、尿蛋白、血尿素氮相较于对照组明显升高，说明NETs促进了糖尿病小鼠肾脏损伤；与DKD组相比，DKD+DNaseⅠ组中上述有关肾功能的相关指标降低(Fig 2A-D, P＜0.01)，说明了DNaseⅠ通过降解NETs缓解了NETs对糖尿病小鼠肾功能异常。为了探究NETs是否可以促进糖尿病小鼠肾脏形态学的改变，我们通过HE染色、PAS染色和MASSON染色观察，光镜结果显示，对照组小鼠肾脏组织结构完整，肾小球和肾小管结构正常，无胶原纤维增生；DKD组小鼠肾脏结构为：肾小球肥大、肾小管基底膜增厚、肾小球弥漫性硬化和胶原纤维明显增多，与DKD组比较，DKD+DNaseⅠ组肾脏病变有明显改善。说明了DNaseⅠ降解NETs可逆转糖尿病导致的肾脏损伤(Fig 2E)。
|
| Fig 2 Results of pathological damage detection of each group of mice A: Urinary protein level; B: 24-h urinary protein levels; C: Blood creatinine level; D: Blood urea nitrogen level(x±s, n=3); E: Effect of NETs on the pathological structure of the kidney in DKD mice (×400).**P < 0.01 vs NC group; ##P < 0.01 vs DKD group. |
最近诸多研究证明，NETs在许多疾病模型中起到了促进焦亡的作用。但NETs在DKD小鼠肾脏焦亡中的作用还未明确。所以我们探究了NETs是否促进DKD小鼠肾脏焦亡。免疫印记法结果显示，DKD小鼠肾脏中焦亡相关蛋白NLRP3、IL-18、Caspase-1、IL-1β、ASC、N-GASDMD的蛋白含量相较于对照组明显升高；与DKD组相比，DKD+DNaseⅠ组焦亡相关指标的蛋白含量明显下降(Fig 3A，P＜0.01)；免疫组织化学结果显示，DKD小鼠焦亡相关指标Caspase-1、IL-18、ASC、NLRP3、IL-1β的表达相较于对照组升高，与DKD组相比，DKD+DNaseⅠ组焦亡相关指标下降(Fig 3B，P＜0.01)。
|
| Fig 3 NETs promoted kidney pyroptosis in DKD mice A: Protein pression of NLRP3, IL-18, caspase-1, IL-1β, ASC, N-GASDAMD and semi-quantitative results(x±s, n=3);B: Immunohistochemistry results of caspase-1, IL-18, ASC, NLRP3, and IL-1β(×400).*P < 0.05, **P < 0.01 vs NC group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs DKD group. |
为了探究NETs是否促进DKD小鼠组织中NF-κB信号的激活。免疫印记法结果显示，相较于对照组，DKD组小鼠肾脏NF-κB信号通路相关蛋白TLR-4、NF-κB、p-IκB蛋白表达量升高，IκB表达量下降，而与DKD组相比，DKD+DNaseⅠ组逆转了上述趋势(Fig 4，P＜0.01)，提示DNaseⅠ降解NETs可以抑制DKD小鼠中NF-κB信号通路的激活。
|
| Fig 4 NETs promoted activation of NF-κ B pathway in kidney tissue ofDKD group mice (x±s, n=3) NF-κB signaling pathway related protein expression level and semi-quantitative results. *P < 0.05, **P < 0.01 vs NC group; ##P < 0.01 vs DKD group. |
糖尿病是一种以血糖升高为特点的慢性代谢疾病，其导致许多严重并发症，DKD作为糖尿病最严重的并发症之一。目前治疗DKD的方法十分有限且预后效果不理想，现在急需明确DKD的发病机制。中性粒细胞作为先天性免疫吞噬细胞，在先天免疫防御中起到了重要的作用[12]。研究证明，中性粒细胞在受到高糖刺激后形成NETs，促进DKD的进展[13]。在我们的研究中，同样发现在DKD小鼠血清中NETs的相关指标MPO、NE含量上升；DKD小鼠肾脏组织中NETs相关蛋白CITH3、MPO表达量上升。这说明了在DKD中有NETs的产生。
至今为止，NETs在DKD中的具体作用机制还未明了。在DKD主要病变为肾小球肿大、蛋白尿产生、系膜基质增多、晚期糖尿病肾小球硬化及肾脏纤维化[14]。在本研究中，DNaseⅠ对NETs降解后，DKD小鼠的肾脏损伤减轻，超微结构有所改善。这说明了在DKD中NETs可促进肾脏损伤，但对各组小鼠血糖和体质量没有明显改善，还需进一步探索NETs在DKD中具体作用机制。
焦亡是炎症小体触发的促炎性细胞程序性死亡的形式[4]。焦亡在正常情况下可以促进受损细胞死亡以发挥细胞内抗感染的作用，但是过度的焦亡导致细胞因子风暴和有害炎症的发生最终使机体组织和功能受到损伤[15]。在之前研究中，NETs与焦亡之间的联系十分紧密，NETs可促进急性肺损伤(acute lung injury，ALI)/急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)中肺泡巨噬细胞焦亡[16]。研究发现，NETs可导致肾小球内皮细胞功能障碍和细胞焦亡[2]，但是具体机制尚不明确; 在化脓性肺损伤模型中，NETs调节NLRP3炎症小体的激活，诱导肺泡巨噬细胞焦亡从而加剧化脓性肺损伤[17]。我们推测在DKD模型中，NETs激活NLRP3炎症小体促进肾脏焦亡，促进DKD的进展，我们的研究证实了这一推测。本研究中，我们发现DKD小鼠肾脏组织焦亡相关蛋白NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD表达量上升，DNaseⅠ降解NETs后可使焦亡相关蛋白表达量降低。
转录因子NF-κB在免疫、应激反应、细胞凋亡和分化中发挥了重要的作用[18]。当Toll受体4(TLR4)检测到微生物病原体的外源性病原体相关分子模式的刺激，之后IκB蛋白的特定丝氨酸残基被IKK多蛋白复合物快速磷酸化，磷酸化的IκB被多泛素化并被蛋白酶降解，使NF-κB进入细胞核，激活NF-κB信号通路[18]。许多研究证明，NF-κB与NETs所致的疾病有着密切的联系。在马兜铃酸肾病模型中，脯氨酸-丝氨酸-苏氨酸磷酸酶相互作用蛋白2 (proline-serine-threonine phosphatase interacting protein 2，PSTPIP2)通过抑制NF-κB信号通路的激活，抑制NETs的产生和细胞凋亡，减轻肾脏受损[19]。本研究中，DKD模型中，NF-κB、TLR4、IκB表达量升高，说明了NF-κB信号通路激活，DKD+DNaseⅠ组小鼠中发现NF-κB信号通路被抑制，这提示在DKD模型中，NETs的产生可导致NF-κB信号通路激活。
综上所述，在DKD中有NETs的生成，并且可以促进肾脏损伤和焦亡，激活NF-κB信号通路。虽然本研究已初步证实NETs对DKD肾脏的损伤作用，但NETs对DKD的其余潜在机制尚不明确，未来我们将进一步验证NETs在DKD中其余的作用效果及相关通路的具体作用机制，并进行体外实验深入探讨NETs对DKD模型中肾脏系膜细胞、肾小管上皮细胞、足细胞、内皮细胞的损伤作用和具体机制，以期为其临床DKD患者治疗提供新的研究方向。
| [1] |
Wang H, Liu D, Zheng B, et al. Emerging role of ferroptosis in diabetic kidney disease: molecular mechanisms and therapeutic opportunities[J]. Int J Biol Sci, 2023, 19(9): 2678-94. doi:10.7150/ijbs.81892 |
| [2] |
Kuto T, Kihara M. Modulation of the aortic baroreceptor reflex by neuropeptide Y, neurotensin and vasopressin microinjected into the nucleus tractus solitarii of the rat[J]. Naunyn Schmiedebergs Arch, 1990, 342(2): 182-8. doi:10.1007/BF00166962 |
| [3] |
Zhang X, Chao P, Zhang L, et al. Single-cell RNA and transcriptome sequencing profiles identify immune-associated key genes in the development of diabetic kidney disease[J]. Front Immunol, 2023, 14: 1030198. doi:10.3389/fimmu.2023.1030198 |
| [4] |
Lu Z, Zhong Y, Liu W, et al. The efficacy and mechanism of Chinese herbal medicine on diabetic kidney disease[J]. J Diabetes Res, 2019, 2019: 2697672. |
| [5] |
王雪, 黄硕, 杨羚, 等. 基于蛋白质组学探讨羟基-α-山椒素对糖尿病心肌病的作用机制[J]. 中国药理学通报, 2024, 40(3): 537-44. Wang X, Huang S, Yang L, et al. Study on mechanism of hydroxy-α-sanshool on diabetic cardiomyopathy based on proteomics[J]. Chin Pharmacol Bull, 2024, 40(3): 537-44. |
| [6] |
Li L, Jing M, Qi L, et al. Pyroptosis, a new bridge to tumor immunity[J]. Cancer Sci, 2021, 112(10): 3979-94. doi:10.1111/cas.15059 |
| [7] |
Xu X, Qin Z, Zhing C, et al. TRIM29 promotes podocyte pyroptosis in diabetic nephropathy through the NF-kB/NLRP3 inflammasome pathway[J]. Cell Biol Int, 2023, 47(6): 1126-35. doi:10.1002/cbin.12006 |
| [8] |
Sahzad K, Fatima S, Khawaja H, et al. Podocyte-specific Nlrp3 inflammasome activation promotes diabetic kidney disease[J]. Kidney Int, 2022, 102(4): 766-79. doi:10.1016/j.kint.2022.06.010 |
| [9] |
Juha M, Molnár A, Jakus Z, Ledó N, et al. NETosis: an emerging therapeutic target in renal diseases[J]. Front Immunol, 2023, 14: 1253667. doi:10.3389/fimmu.2023.1253667 |
| [10] |
Masuda S, Nakazawa D, Shida H, et al. NETosis markers: quest for specific, objective, and quantitative markers[J]. Clin Chim Acta, 2016, 459: 89-93. doi:10.1016/j.cca.2016.05.029 |
| [11] |
Cui Y, Yang Y, Tao W, et al. Neutrophil extracellular traps induce alveolar macrophage pyroptosis by regulating NLRP3 deubiquitination, aggravating the development of septic lung injury[J]. J Inflamm Res, 2023, 16: 861-77. doi:10.2147/JIR.S366436 |
| [12] |
Papayannopoulos V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease[J]. Nat Rev Immunol, 2018, 18(2): 134-47. doi:10.1038/nri.2017.105 |
| [13] |
Zheng F, Ma L, Li X, et al. Neutrophil extracellular traps induce glomerular endothelial cell dysfunction and pyroptosis in diabetic kidney disease[J]. Diabetes, 2022, 71(12): 2739-50. doi:10.2337/db22-0153 |
| [14] |
Sandholm N, Dahlström E H, Groop P H. Genetic and epigenetic background of diabetic kidney disease[J]. Front Endocrinol (Lausanne), 2023, 14: 1163001. doi:10.3389/fendo.2023.1163001 |
| [15] |
Vasudevan S O, Behl B, Rathinam V A. Pyroptosis-induced inflammation and tissue damage[J]. Semin Immunol, 2023, 69: 101781. doi:10.1016/j.smim.2023.101781 |
| [16] |
Li H, Li Y, Song C, et al. Neutrophil extracellular traps augmented alveolar macrophage pyroptosis via AIM2 inflammasome activation in LPS-induced ALI/ARDS[J]. J Inflamm Res, 2021, 14: 4839-58. doi:10.2147/JIR.S321513 |
| [17] |
Turkmen K. Inflammation, oxidative stress, apoptosis, and autophagy in diabetes mellitus and diabetic kidney disease: the four horsemen of the apocalypse[J]. Int Urol Nephrol, 2017, 49(5): 837-44. doi:10.1007/s11255-016-1488-4 |
| [18] |
Kawai T, Akira S. Signaling to NF-kappaB by Toll-like receptors[J]. Trends Mol Med, 2007, 13(11): 460-9. doi:10.1016/j.molmed.2007.09.002 |
| [19] |
Du C, Xu C, Jia P, et al. PSTPIP2 ameliorates aristolochic acid nephropathy by suppressing interleukin-19-mediated neutrophil extracellular trap formation[J]. Elife, 2024, 13: e89740. doi:10.7554/eLife.89740 |