2. 中国科学技术大学附属第一 医院(安徽省立医院) 药学部，安徽 合肥 230001;
3. 中国科学技术大学生命科学与医学部，安徽 合肥 230001
2. Dept of Pharmacy, the First Affiliated Hospital of USTC, Division of Life Sciences and Medicine, University of Science and Technology of China;
3. Division of Life Sciences and Medicine, University of Science and Technology of China, Hefei 230001, China
阿霉素在临床上广泛用于抗肿瘤，对乳腺癌、肝癌和白血病等恶性肿瘤有一定的治疗效果，作用于脱氧核糖核酸化学结构，对各种生长周期的肿瘤细胞都有抑制作用[1]。然而其诱导的肾脏损伤不容忽视，阿霉素肾病是常见的药物诱导性继发性局灶节段性肾小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis，FSGS)，是常见的肾病综合征。足细胞即肾小球上皮细胞，是高度分化的上皮细胞，发挥肾小球滤过屏障功能[2]，足细胞损伤是阿霉素肾病的重要特征。目前治疗该病的一线药物以激素类、免疫抑制剂类为主，但效果不理想，因此，迫切需要新的治疗方法[3]。
2012年，Dixon等[4]首次发现了在有盖培养皿中生长的癌细胞中，使用erastin和柳氮磺胺吡啶抑制system χc-会导致一种不寻常的铁依赖细胞死亡方式，即铁死亡。它与细胞内铁平衡紊乱和脂质过氧化增加密切联系[5]。肾小球上皮细胞是富含铁离子和活性氧的部位。在糖尿病肾病，FSGS等多种肾脏病中肾小球足细胞内均出现大量的脂质代谢紊乱[6]，越来越多的研究发现，铁死亡与多种肾脏疾病的发生发展相关，如肾脏纤维化、多囊肾病、肾细胞癌和糖尿病肾病[7]等。最近的研究表明，铁死亡在不同的慢性肾病中起着关键作用[8-9]，且在足细胞损伤引发的疾病中，铁死亡是一个十分重要的干预靶点[10]。但是在阿霉素肾病足细胞损伤中鲜有报道，铁死亡是否参与到阿霉素诱导的足细胞损伤有待进一步研究。Fer-1是一种铁死亡抑制剂，据报道具有降低脂质过氧化和抑制铁死亡的作用[11]。本研究旨在探讨Fer-1是否通过抑制铁死亡在阿霉素诱导的足细胞损伤中发挥作用。
1 材料与方法 1.1 细胞培养MPC小鼠足细胞由Prof. Pin-Lan Li(Department of Pharmacology，Virginia Commonwealth University，USA)赠与。在33 ℃，10%血清，1%双抗，1×104 U·L-1 γ-干扰素条件下增殖，经37 ℃无γ-干扰素诱导10~14 d后分化成熟。
1.2 试剂BCA蛋白定量试剂盒、胰酶细胞消化液、细胞RIPA裂解液、CCK-8试剂盒、丙二醛(malondialdehyde, MDA)测定试剂盒、均购自上海碧云天生物技术有限公司；还原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)含量检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所；DMSO购自美国Sigma公司；阿霉素、Ferrostatin-1均购自上海陶术生物科技公司；双色预染蛋白Marker、PAGE凝胶快速制备试剂盒均购自上海雅酶生物医药科技有限公司；ACSL4、Desmin抗体均购自Proteintech公司；SLC7A11抗体购自Cell Signaling Technology公司；GPX4抗体购自英国Abcam公司；β-actin抗体及兔二抗购自武汉三鹰公司；RPMI1640培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；1%青霉素和链霉素双抗、PBS、耗材均购自合肥白鲨生物科技有限公司；去铁酮(Deferiprone)购自美国APE×BIO Technology LLC公司；钙黄绿素(Calcein-AM)购自美国MedChemExpress公司；总RNA提取试剂盒购自广州美基生物科技有限公司；逆转录试剂盒、SYBR qPCR试剂盒均购自TOLOBIO公司。
1.3 仪器CO2培养箱(Heal Force公司)；酶标仪(Molecular Devices公司); 凝胶成像系统(Peiqing公司); 荧光倒置显微镜(Leica公司)。
1.4 方法 1.4.1 CCK-8筛选Ferrostatin-1治疗浓度在96孔板中接种合适细胞密度分化成熟的足细胞，设置空白对照组，阿霉素模型组，阿霉素模型加入不同浓度Ferrostatin-1预处理(终浓度为1、5、10、15 μmol·L-1) 组，细胞密度达到50%~60%时加入刺激，24 h后加入CCK-8试剂，37 ℃孵育30 min后采用酶标仪测定450 nm处吸光度进行筛选；
1.4.2 细胞培养及分组足细胞复苏后，于37 ℃含5% CO2的培养箱中培养。取对数生长期的足细胞，Control组完全培养基处理24 h、阿霉素模型组用0.4 mg·L-1的阿霉素处理24 h；Fer-1组在应用0.4 mg·L-1阿霉素处理24 h的基础上再用10 μmol·L-1 Ferrostatin-1预处理1.5 h。
1.4.3 Western blot收集不同处理组的细胞，使用RIPA裂解液和PMSF提取细胞总蛋白，经BCA试剂盒蛋白定量后，通过SDS-PAGE凝胶电泳对蛋白样品进行分离后即转移至甲醇活化后的PVDF膜上。用5% 脱脂牛奶室温封闭2 h，一抗4 ℃孵育过夜，1×TBST漂洗3次，每次10 min；二抗(1 ∶ 10 000)室温孵育2 h，1×TBST漂洗3次后，ECL显影。蛋白条带使用ImageJ进行灰度分析，以β-actin为内参基因计算各组蛋白的相对表达水平。
1.4.4 RNA提取及RT-qPCR取处理好的细胞，按照总RNA提取试剂盒说明书收集细胞总RNA，酶标仪测定其浓度和纯度后保存于-80 ℃。按RT-PCR说明书设定反应程序: 42 ℃ 2 min，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃合成cDNA；产物立即用于实验或-20 ℃保存。取稀释后cDNA按照real-time PCR说明书进行反应，反应程序为: 预变性95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40个循环；溶解曲线为: 95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。β-actin上游引物为: 5′-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3′；下游引物为: 5′-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3′；SLC7A11上游引物为: 5′-GGCACCGTCATCGGATCAG-3′，下游引物为: 5′-CTCCACAGGCAGACCAGAAAA-3′；ACSL4上游引物为: 5′-ACTGGCGATATTGGAGAAT-3′，下游引物为: 5′-CACATAGGACTGGTCACTT-3′；GPX4上游引物为: 5′-CAGGAGCCAGGAAGTAAT-3′，下游引物为: 5′-CAGCCGTTCTTATCAATGAG-3′。每组设置3个复孔，运用2-ΔΔCT的方法进行数据统计。
1.4.5 MDA水平检测收集不同处理组的细胞，使用RIPA裂解液和PMSF提取细胞总蛋白，经BCA试剂盒蛋白定量后，按MDA检测试剂盒说明书配制反应体系，混匀后100 ℃加热15 min，水浴冷却至室温，1 000×g离心10 min，取200 μL上清加入96孔板中，随后用酶标仪在532 nm处测定吸光度，按说明书上的计算公式计算细胞内MDA的含量。
1.4.6 检测细胞内铁池收集不同处理组的细胞，用不含EDTA的胰酶消化，培基吹下收集于流式管中，1 500 r·min-1，5 min，弃上清，1 mL清洗3次，在37 ℃与1 nmol·L-1 CA-AM孵育15 min，上机，检测荧光值，再用0.5 mL PBS洗涤细胞2~3次，并在37 ℃的摇床中与100 μmol·L-1去铁酮孵育1 h，检测荧光值，计算细胞平均荧光值的差异。
1.4.7 GSH水平检测收集细胞，PBS清洗3次，加入PBS缓冲液0.5 mL, 超声研磨破碎，取破碎后的细胞悬液0.1 mL, 与试剂盒内试剂混匀，静置5 min，波长408 nm处测定吸光度，按公式计算GSH含量。
1.4.8 阿霉素小鼠模型的构建采用8周龄的C57BL/6J雄性小鼠[动物使用许可证编号：SYXK(皖)2022-008]，在适应性喂养1周后将其随机分成两组，空白对照组与阿霉素刺激组，阿霉素组尾静脉注射浓度为20 mg·kg-1的阿霉素，取肾脏做4-HNE染色。
1.4.9 统计学处理所有数据均以至少3个独立实验的 x±s表示。统计分析采用GraphPad Prism 9和ImageJ软件，其中多组间数据使用单因素方差分析，两组间数据使用Student’s t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 阿霉素对足细胞铁死亡标志蛋白GPX4、SLC7A11、ACSL4表达水平的影响阿霉素刺激(0.4 mg·L-1)MPC，Fig 1 Western blot结果表明，阿霉素刺激24 h，足细胞GPX4、SLC7A11的蛋白水平降低(P < 0.01)，而ACSL4的表达升高(P < 0.01)；RT-qPCR实验检测的mRNA水平，结果显示，阿霉素刺激足细胞GPX4、SLC7A11的mRNA水平降低(P < 0.01)，而ACSL4的mRNA升高(P < 0.01)。以上表明，阿霉素会诱导足细胞铁死亡的发生。
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| Fig 1 The expression levels of ferroptosis marker GPX4, SLC7A11 and ACSL4 in podocytes treated with ADR (x±s) NC: Negative control; ADR: Adriamycin. A-D: Protein expression levels of GPX4, SLC7A11 and ACSL4, n=6;E-G: mRNA expression levels of GPX4, SLC7A11 and ACSL4, n=3. **P < 0.01 vs NC. |
阿霉素刺激MPC，CCK-8检测足细胞活性，结果显示阿霉素刺激组足细胞细胞活性明显下降，使用不同浓度Fer-1处理足细胞，Fig 2结果显示, 在浓度为10 μmol·L-1时，Fer-1对足细胞的保护效果最显著(P < 0.01)，后续实验选择10 μmol·L-1为给药浓度。
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| Fig 2 Effect of Fer-1on cell viability in ADR-stimulated podocytes (x±s, n=4) NC: Negative control; ADR: 0.2 mg·L-1 adriamycin; 1, 5, 10, 15: 0.2 mg·L-1 adriamycin+1, 5, 10, 15 μmol·L-1 Fer-1. *P < 0.05, **P < 0.01 vs ADR. |
阿霉素刺激足细胞，Western blot结果表明，与NC组相比，阿霉素刺激组足细胞GPX4、SLC7A11的蛋白水平降低(P < 0.01)，而Desmin、ACSL4的表达升高(P < 0.01)，与阿霉素组相比，加入Fer-1后足细胞GPX4、SLC7A11的表达升高(P < 0.05)，Desmin、ACSL4的表达降低(P < 0.05)；mRNA结果显示，与NC组相比，阿霉素刺激组足细胞，GPX4、SLC7A11的表达水平降低(P < 0.01)，而ACSL4的表达升高(P < 0.01)，与阿霉素组相比，加入Fer-1后足细胞GPX4、SLC7A11的表达升高(P < 0.01)，ACSL4的表达降低(P < 0.01)。提示Fer-1可通过抑制阿霉素诱导的铁死亡保护足细胞，见Fig 3。
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| Fig 3 Effect of Fer-1 on expression of ferroptosis marker protein in ADR-stimulated podocytes (x±s, n=3) NC: Negative control; ADR: 0.2 mg·L-1 adriamycin; ADR+Fer-1: 0.2 mg·L-1 adriamycin+10 μmol·L-1 Fer-1. A-E: Protein expression of SLC7A, GPX4, DESMIN, ACSL4;F-H: mRNA expression of GPX4, SLC7A, ACSL4. #P < 0.05, ##P < 0.01 vs ADR, **P < 0.01vs NC. |
MDA检测足细胞脂质过氧化水平，Fig 4结果显示，在阿霉素刺激下，足细胞MDA的含量上升；加入Fer-1以后，足细胞MDA水平明显降低(P < 0.05)。GSH检测结果显示阿霉素刺激组足细胞GSH水平降低(P < 0.01)，Fer-1组足细胞GSH水平明显恢复(P < 0.01)。试剂盒检测足细胞Fe2+，阿霉素明显提高了足细胞中的Fe2+水平(P < 0.01)，加入Fer-1以后，足细胞铁池水平降低(P < 0.01)。表明Fer-1可以降低阿霉素刺激下足细胞脂质过氧化水平，保护足细胞。
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| Fig 4 Effect of Fer-1 on lipid peroxidation and Fe2+ in ADR-stimulated podocytes (x±s, n=3) NC: Negative control; ADR: 0.2 mg·L-1 adriamycin; Fer-1: 0.2 mg·L-1 adriamycin+10 μmol·L-1 Fer-1. #P < 0.05, ##P < 0.01 vs ADR, **P < 0.01 vs NC. |
肾脏组织4-HNE免疫组化结果显示，与NC组相比，阿霉素模型组小鼠肾脏组织4-HNE水平明显增加(P < 0.01)，提示阿霉素诱导肾小球脂质过氧化水平增加，见Fig 5。
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| Fig 5 Level of 4-HNE in ADR nephropathy mice (x±s, n=6) NC: Negative control mice; ADR: ADR nephropathy mice. **P < 0.01 vs NC. |
通过Western blot和RT-qPCR实验检测阿霉素模型组小鼠足细胞GPX4、SLC7A11、ACSL4的表达水平。Fig 6结果表明，与NC组相比，阿霉素模型组小鼠肾脏组织GPX4、SLC7A11的表达明显降低(P < 0.01)，ACSL4的表达明显升高(P < 0.01)。表明了阿霉素诱导小鼠肾脏发生铁死亡。
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| Fig 6 The expression level of GPX4, SLC7A11 and ACSL4 in ADR nephropathy mice (x±s, n=6) NC: Negative control mice; ADR: ADR nephropathy mice. A: Protein expression of SLC7A11, GPX4, ACSL4; E-G: mRNA expression of GPX4, SLC7A11, ACSL4. *P < 0.05, **P < 0.01 vs NC. |
蛋白尿是FSGS的主要临床表现，其中足细胞作为肾小球滤过屏障的重要组成部分，对维持肾小球功能至关重要。越来越多的研究表明足细胞足突融合消失、足细胞死亡在蛋白尿产生和肾小球硬化过程中具有关键性作用[12]。足细胞是高度分化的上皮细胞，具有难以修复的特点，深入探讨足细胞损伤机制，对肾小球疾病的防治具有重要意义。铁死亡是一种铁依赖性的受调控的细胞死亡方式，与铁积累和脂质过氧化这两个主要的生化特征有关。我们通过检测足细胞脂质过氧化产物，发现阿霉素刺激下足细胞MDA水平明显升高，而GSH水平明显降低，Fe2+水平增加。铁死亡的发生受多种基因表达和调控，并涉及不同的信号通路，包括氨基酸代谢、铁代谢、脂代谢等代谢途径[13]。GPX4被认为是清除脂质过氧化产物的重要酶，阻断SLC7A11受体可以降低其活性，发生类似Fenton反应，造成脂质过氧化物累积。本次实验中发现在阿霉素刺激下，足细胞GPX4、SLC7A11的表达降低，ACSL4的表达升高，而ACSL4作为是一种将CoA酯化为特定多不饱和脂肪酸的酶，可以将花生四烯酸合成为花生四烯酸酰CoA，进而促进磷脂过氧化导致铁死亡[14]。以上结果提示，铁死亡相关蛋白表达ACSL4升高，造成足细胞内脂质过氧化物累积，而去除脂质过氧化水平蛋白GPX4、SLC7A11降低，使得足细胞内GSH进一步被耗竭，ROS累积造成足细胞铁死亡。
Ferrostatin-1，一种小分子药物，是一种有效的铁蛋白酶抑制剂，也是一种广泛使用的铁死亡抑制剂，具有清除脂质过氧化物的能力[15]。本研究研究发现，在阿霉素诱导的足细胞中可检测到铁死亡的典型特征——抗氧化能力减弱、脂质过氧化产物积累和铁池超载，而加入Fer-1可以部分改善阿霉素刺激下足细胞活性，降低铁死亡蛋白ACSL4水平，减轻足细胞脂质过氧化物累积，同时提高足细胞铁死亡抑制蛋白GPX4、SLC7A11的表达，促进足细胞清除ROS的能力，改善足细胞铁池超载，降低Desmin的表达，提高足细胞的生存能力。
阿霉素是被认可的动物肾疾病模型的诱导剂，诱导的足细胞损伤表现为足细胞通透性增加，细胞骨架破坏，死亡增加。阿霉素诱导小鼠肾病是目前模拟人慢性肾病较好的造模方法，出现的蛋白尿、肾功能衰竭接近人类肾病[16]。本研究中小鼠造模4周后，其肾功能损伤进行性加重，而通过对铁死亡标志物4-HNE染色显示肾小球内出现脂质过氧化物累积，进一步Western blot和RT-qPCR实验显示阿霉素模型组肾皮质内铁死亡蛋白GPX4、SLC7A11的表达降低，ACSL4的表达升高，提示阿霉素可诱导肾小球发生铁死亡。
本文论证了阿霉素肾病足细胞内一种新型的细胞死亡方式铁死亡，既往的研究中表明病理条件下足细胞内存在多种死亡方式，不仅包括铁死亡还包括细胞凋亡、细胞自噬等[17-18]，这提示我们阿霉素肾病足细胞损伤中并非是单一的细胞死亡方式决定的，而可能是多种细胞死亡方式并存，因此在阿霉素肾病足细胞损伤的治疗研究中，对于不同的细胞死亡机制进行有选择性的针对性的干预策略十分重要。本研究发现阿霉素诱导足细胞铁死亡抑制GPX4、SLC7A11蛋白及mRNA水平均呈现出明显下降，而铁死亡蛋白ACSL4则相反，Fer-1可以有效逆转这一现象，从而减轻氧化应激和铁沉积，缓解阿霉素刺激下足细胞损伤。但是对于阿霉素诱导铁死亡蛋白及基因表达水平变化的具体调控机制仍需进一步研究。后续实验中拟通过小干扰RNA，腺病毒转染，基因敲除等技术针对铁死亡相关基因进行干预，以明确阿霉素诱导足细胞铁死亡的关键分子，从而进行精准干预，进一步为临床靶向足细胞治疗慢性肾病提供了新思路。
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