2. 福建医科大学附属第一医院滨海院区 国家区域医疗中心泌尿外科，福建 福州 350212;
3. 福建医科大学泌尿外科研究所，福建 福州 350005;
4. 南平市第二医院泌尿外科，福建 南平 354200
2. Dept of Urology, National Region Medical Center, Binhai Campus of the First Affiliated Hospital, Fujian Medical University, Fuzhou 350212, China;
3. Fujian institute of Urology, the First Affiliated Hospital, Fujian Medical University, Fuzhou 350005, China;
4. The Dept of Urology, The Second Nanping Hospital, Nanping Fujian 354200, China
肾结石是一种在世界范围内高度流行的疾病，其在北美的发病率为7%~13%，在欧洲为5%~9%，在亚洲为1%~5%[1]。高钠饮食、缺乏体力活动、肥胖和糖尿病患者数量增长等因素都导致结石发病率的增加。内窥镜手术技术的快速发展大大提高了尿石症的治疗效果。然而，结石病的高复发率给社会带来沉重的经济负担。钙质结石仍是目前最常见的肾结石类型，占结石总数的80%以上。草酸钙(calcium oxalate, CaOx)结石比磷酸钙结石更为常见，一水草酸钙(calcium oxalate monohydrate, COM)是草酸钙结石的主要矿物成分[2]。结石形成的过程和结果高度依赖于肾小管细胞的反应。溶质的过饱和导致尿液中形成结石，并在肾小管的不同区域沉积，其中晶体表现出直接和间接的细胞毒性。吞噬小于10 μm的晶体会通过溶酶体流出钙引发细胞坏死。溶酶体的不稳定性以及由此引发的溶酶体酶的释放将导致严重的细胞应激，其特征是活性氧(reactive oxygen species, ROS)的产生。晶体沉积也可以通过分泌IL-1β或通过坏死细胞释放警报素(alarmins)、蛋白酶和损伤相关分子模式(damage-associated molecular pattern, DAMP)间接触发炎症[3]。
中药具有高效、低毒、多靶向性，在防治肾结石方面具有广阔的应用前景。姜黄属于姜黄科，是一种药食两用的传统药材，已有几千年广泛应用的历史，是常用的调味品和天然色素。我国传统医学典籍中关于姜黄的记载最早可追溯到唐代的《新修本草》[4]。姜黄根状茎中存在的主要生物活性化合物包括姜黄素(curcumin, CUR，含量约占60%~70%)、去甲氧基姜黄素(demethoxycurcumin, DMC，20%~27%)和二去甲氧基姜黄素(bisdemethoxycurcumin, BDMC，10%~15%)[5]。CUR是姜黄根茎中最丰富的活性成分，研究表明[6]，CUR具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗肿瘤、免疫调节和神经保护等生物活性。本文研究CUR在乙醛酸诱导的肾结石小鼠模型中，对肾小管细胞损伤的保护作用及其机制。探讨了CUR对晶体诱导损伤的抗炎作用及其机制，为新型尿石症治疗药物提供实验支持。
1 材料 1.1 实验动物与细胞36只雄性8周龄C57BL/6小鼠，体质量18~22 g，购于上海斯莱克实验动物公司[合格证号为2022000908563，生产许可证号为SCXK(沪)2021-0003]，于福建中医药大学实验动物中心[动物使用许可证号为SYXK(闽)2021-0006]，适应性喂养1周。HK-2肾小管上皮细胞系来自中国科学院细胞库。
1.2 主要仪器与试剂酶标仪(TECAN，Infinite M200 Pro)、凝胶成像分析系统(Bio-Rad，ChemiDoXRS+)；TLR4抗体(Abcam，ab22048)，NRF2抗体(Abcam，ab62352)，HO-1抗体(Cell Signaling Technology，#70081)，p65抗体(Abcam，ab32536)，p-p65抗体(Abcam，ab53489)，β-actin抗体(碧云天生物技术有限公司，H015)。乙醛酸购自Sigma，纯度98%。CUR购自Aldrich，纯度为97.5%~102.5%。COM购自Sigma，纯度98%。
2 方法 2.1 小鼠肾结石模型和分组小鼠经适应性喂养后，分为正常对照组(Normal组)(n=12)和肾结石形成模型组(n=24)。肾结石模型组每天腹腔注射75 mg·kg-1体质量的乙醛酸(glyoxylate)，连续注射6 d。造模的动物随机分为模型对照组(GLY组)(n=12)和CUR(GLY+CUR)治疗组(n=12)。
2.2 实验动物给药CUR治疗组在开始腹腔注射乙醛酸10 h后给予腹腔注射CUR，CUR给药剂量为50 mg·kg-1体质量，模型对照组腹腔注射等量的生理盐水，连续注射6 d。实验在第7天对小鼠实施安乐死，采集血清和肾脏组织样本进行分析。
2.3 COM的配制将10 mmol·L-1氯化钙与10 mmol·L-1草酸钠在含有90 mmol·L-1氯化钠(pH 7.4)的10 mmol·L-1 Tris-HCl缓冲液中混合，使COM终浓度的成分分别为5 mmol·L-1氯化钙和0.5 mmol·L-1草酸钠，然后在室温下孵育过夜。制备的COM经过滤收集，高压灭菌后用于后续实验[7]。
2.4 HK-2细胞HK-2细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液，置于37 ℃ 5% CO2培养箱中培养、传代。将细胞分为5组：正常对照组(Control组)、COM模型对照组(COM组)、COM+CUR(0.1、1.0、10 μmol·L-1)组。待细胞长到80%后，吸出培养基，用PBS清洗1遍，加入COM进行造模，之后给药组立即加入相应浓度的CUR，Control组加入相同的溶剂，细胞继续培养24 h，收集样品备用。
2.5 CCK-8检测细胞活力按照CCK-8检测试剂盒步骤，使用酶标仪检测570 nm处吸光度值。
2.6 LDH检测使用LDH试剂盒，在490 nm处测定每个孔的吸光度，测定LDH活性。
2.7 ROS检测采用ROS二氢乙锭(DHE；碧云天公司)荧光探针检测细胞内ROS。将细胞接种于96孔板中，并与10 μmol·L-1的DHE在37 ℃下孵育30 min。用Clariostar酶标仪在488 nm激发和525 nm发射条件下检测荧光。
2.8 血液生化指标检测各组动物取血，测血清尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)和血磷(P)含量。
2.9 ELISA法检测细胞因子水平离心0.5 h后，收集细胞上清液，使用ELISA试剂盒(碧云天公司)测定TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。用酶标仪检测450 nm处的光密度。
2.10 RT-qPCR法检测相关基因的表达提取总RNA，逆转录成cDNA[8]，参照GenBank中小鼠IL-1β、TNF-α、IL-6引物序列，PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，IL-1β引物上游序列5′-TAATGAAAGACGGCACACCCAC-3′，下游序列5′-GCTCTGCTTGTGAGGTGCT GA-3′；TNF-α引物上游序列5′-TCTACTGAACTTCGGGGTGAT-3′，下游序列5′-ACTTGGTG GTTTGTGAGTGTGA-3′；IL-6引物上游序列5′-AGATACAAAGAAATGATGGATGCTA-3′，下游序列5′-TCTTGGTTGAAGATATGAATTAGAG-3′。用RT-qPCR检测mRNA表达。以GAPDH为内参计算2-ΔΔCT值。
2.11 Western blot检测相关蛋白的表达提取总蛋白，经SDS-PAGE分离，转膜，封闭2 h，一抗4 ℃孵育，一抗的比例分别是：TLR4抗体(1 ∶ 1 000)，NRF2抗体(1 ∶ 1 000)，HO-1抗体(1 ∶ 1 000)，p65抗体(1 ∶ 800)，p-p65抗体(1 ∶ 800)，β-actin抗体(1 ∶ 3000)，TBS清洗，二抗孵育，ECL显色，凝胶成像系统检测，分析灰度值，以目标蛋白与β-actin的灰度值比值作为目标蛋白的相对量。
2.12 统计学分析SPSS 26.0统计软件分析，数据以x±s表示，各组数据间的差别用ANOVA分析。两组间比较用t检验，多组间比较用F检验。
3 结果 3.1 CUR对小鼠肾结石模型肾损伤的影响为评价CUR对小鼠肾结石模型晶体诱导肾损伤的影响，我们连续6 d腹腔注射乙醛酸建立结石形成小鼠模型。CUR治疗组在开始腹腔注射乙醛酸10 h后给予CUR。研究结果显示，给予CUR可保护肾结石引起的小鼠体质量减轻，通过血清BUN、P和Cr水平评估肾功能，结果显示，CUR给药可改善小鼠肾功能的下降(Fig 1)。
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| Fig 1 CUR alleviated tubular injury in mouse model of glyoxylate-induced nephrolithiasis (x±s, n=3) A: Body weight of mice; B: Level of blood urea nitrogen when sacrificed; C: Concentrations of serum creatinine when sacrificed; D: Concentrations of serum P when sacrificed. **P < 0.01 vs Normal group; #P < 0.05 vs GLY group. |
炎症反应被认为是调节晶体诱导肾损伤的主要病理因素。通过检测炎症细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA表达及浓度，本研究结果显示，与模型对照组比较，给予CUR可抑制肾组织中炎症细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA表达及浓度。TLR4/NF-κB信号通路在抑制炎症反应中发挥了重要作用，本实验检测了TLR4及其下游NF-κB在小鼠肾结石形成模型中的表达，研究结果显示，与空白对照组比较，模型组能够促进TLR4和MyD88的表达，增加IκB-α和p65的磷酸化水平，与模型对照组比较，经不同浓度的CUR作用后，能够逆转这一趋势，且具有显著性差异(Fig 2)。
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| Fig 2 CUR mitigated inflammatory responses in mouse model of glyoxylate-induced nephrolithiasis (x±s, n=3) A: The mRNA expression of inflammatory cytokines in the mouse model of glyoxylate-induced nephrolithiasis was detected by RT-qPCR; B: The concentration levels of inflammatory cytokines in the mouse model of glyoxylate-induced nephrolithiasis was determined by ELISA; C: The production of proteins in the TLR4/NF-κB signaling pathways of the mouse model of glyoxylate-induced nephrolithiasis treated with CUR. **P < 0.01 vs Normal group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs GLY group. |
CUR具有较强的抗氧化作用，与正常对照组比较，模型对照组小鼠ROS明显增加，经CUR作用后，明显降低ROS。转录因子NRF2响应细胞应激信号，并调节基因表达以维持细胞氧化还原稳态。本实验检测了NRF2及其靶基因HO-1在小鼠肾结石形成模型中的表达，研究结果显示，模型对照组中NRF2和HO-1的蛋白水平降低，经CUR作用后，能够明显促进NRF2和HO-1蛋白水平(Fig 3)。
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| Fig 3 CUR activated NRF2/HO-1 and suppressed crystal-induced oxidative injury (x±s, n=3) A: DHE assay for intracellular ROS; B: The production of proteins in the NRF2/HO-1 signaling pathways of the mouse model of glyoxylate-induced nephrolithiasis treated with CUR. **P < 0.01 vs Normal group; ##P < 0.01 vs GLY group. |
COM诱导HK-2细胞，经CUR不同浓度作用24 h后，研究结果显示，与Control组比较，HK-2细胞经COM诱导后，细胞活力明显降低(P＜0.01)，与COM组比较，不同浓度的CUR能够促进细胞活力，且呈一定的剂量依赖性(P＜0.01)；同时，检测HK-2细胞LDH释放量，与Control组比较，经COM诱导后，LDH明显增加(P＜0.05)，与COM组比较，不同浓度的CUR能够抑制LDH，且呈一定的剂量依赖性(P＜0.05)，提示CUR可提高COM诱导的HK-2细胞的活力(Fig 4)。
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| Fig 4 CUR enhanced cell viability of COM-induced HK-2 cells (x±s, n=3) A: The cell viability of HK-2 cells after co-treatment with COM and various concentrations of CUR; B: The release of LDH in HK-2 cells treated with both COM and CUR. **P < 0.01 vs Control group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs COM group. |
RT-qPCR和ELISA结果显示，与Control组比较，COM组HK-2细胞TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表达水平和浓度明显升高(P＜0.01)，与COM组比较，不同浓度的CUR能够明显降低TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表达水平和浓度(P＜0.05)，提示CUR能够抑制COM诱导HK-2细胞的炎症反应(Fig 5)。
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| Fig 5 CUR mitigated COM-induced inflammatory responses in HK-2 cells (x±s, n=3) A: The mRNA expression of inflammatory cytokines in COM-induced HK-2 cells exposed to CUR was detected by RT-qPCR; B: The concentration levels of inflammatory cytokines in COM-induced HK-2 cells exposed to CUR was determined by ELISA. **P < 0.01 vs Control group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs COM group. |
研究结果显示，与Control组比较，COM能够促进TLR4和MyD88的表达，增加IκB-α和p65的磷酸化水平，与COM组比较，经不同浓度的CUR作用后，能够剂量依赖性的逆转这一趋势，且差异具有统计学意义(P＜0.05)；同时，与COM组比较，不同浓度的CUR能够促进NRF2从细胞质向细胞核的易位，促进了HO-1的表达，且差异具有统计学意义(P＜0.05)(Fig 6)。
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| Fig 6 CUR modulated TLR4/NF-κB and NRF2/HO-1 signaling pathways in COM-induced HK-2 cells A: The production of proteins in the TLR4/NF-κB signaling pathways of COM-induced HK-2 cells treated with CUR; B: The production of proteins in the NRF2/HO-1 signaling pathways of COM-induced HK-2 cells treated with CUR. **P < 0.01 vs Control group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs COM group. |
为进一步验证CUR调控TLR4/NF-κB和NRF2/HO-1信号通路对COM诱导的HK-2细胞的影响，本实验分别采用TLR4激动剂(CCL-34)或NRF2抑制剂(ML385)，验证CUR在COM诱导的HK-2细胞中的调控作用。根据以上研究结果，选用CUR 1.0 μmol·L-1作为研究剂量。研究结果显示，与COM组比较，CUR能够促进COM诱导的HK-2细胞活力，经ML385或CCL-34作用后，CUR对COM诱导的HK-2细胞活力的作用被阻断，且具有显著性差异(P＜0.01)；CUR能够抑制COM诱导的HK-2细胞LDH的释放，经ML385或CCL-34作用后，CUR对COM诱导HK-2细胞的LDH作用被阻断，且具有显著性差异(P＜0.01)。同时，与COM组比较，CUR组抑制炎症因子，经ML385或CCL-34作用后，CUR对COM诱导的HK-2细胞的抗氧化应激和抗炎作用被阻断，且具有显著性差异(P＜0.01)。提示，CUR可以通过TLR4/NF-κB和NRF2/HO-1信号通路对COM诱导的HK-2细胞发挥作用(Fig 7)。
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| Fig 7 ML385 and CCL-34 reversed anti-inflammatory effects of CUR on COM-induced HK-2 cells (x±s, n=3) A, B: The cell viability and LDH release in COM-induced HK-2 cells treated with CUR and ML385 or CCL-34. C, D: The effects of ML385 and CCL-34 on mRNA and protein production of inflammatory cytokines in COM-induced HK-2 cells exposed to CUR. **P < 0.01 vs Control group; ##P < 0.01 vs COM group; $$P < 0.01 vs COM+CUR group. |
CUR是一种具有强抗炎和抗氧化特性的蛋白酶抑制剂[9]，其对肾脏损伤的保护作用已被广泛报道。因此，我们评估了CUR对乙醛酸诱导的小鼠结石形成模型的晶体沉积和肾损伤的影响，研究结果表明，经CUR治疗后，以肾功能丧失和肾小管损伤指数升高所表现的肾损伤得到了减轻；同时，选用不同浓度CUR(0.1~10 μmol·L-1)，用于评估其对HK-2细胞模型的作用及潜在机制，HK-2细胞经COM诱导后，细胞活力明显降低，经CUR不同浓度作用后，可逆转这一趋势。CUR能够抑制乙醛酸诱导的小鼠肾结石形成模型和COM处理后HK-2细胞的炎症反应，以上结果表明，CUR对肾结石具有抗炎作用。
TLR4是TLR家族成员，在先天免疫中起着关键作用[10]。NF-κB是TLR4的下游效应因子，是一个可以调节炎症因子表达的中心转录因子[10]。大量研究表明，TLR4/NF-κB信号通路在减轻一系列疾病的炎症反应中发挥了重要作用。炎症是一个复杂的生理过程，由多种刺激物和炎症因子诱导，通过激活NF-κB而发生[11]。本研究结果提示，CUR能够抑制体内肾结石形成小鼠模型和COM诱导的HK-2细胞TLR4/NF-κB信号通路的相关蛋白表达水平，为了进一步验证CUR对TLR4/NF-κB信号通路的调控作用，我们采用TLR4激动剂CCL-34干预HK-2细胞，再经CUR给药，值得注意的是，在COM诱导的HK-2细胞中，CUR降低了炎症相关蛋白的表达，而CCL-34阻断了CUR对上述炎症相关蛋白的作用，表明CUR通过调控TLR4/NF-κB信号通路抑制了HK-2细胞的炎症反应。
炎症和氧化损伤是紧密相关和相互关联的。氧化应激被认为是晶体诱导肾损伤进展中的一个关键因素。肾脏结石的形成通常与抗氧化剂的降低相关[12]。ROS的积累与肾脏沉积的形成有关[3]。在抗氧化方面，NRF2作为细胞抗氧化剂的主调节因子，并介导细胞存活的防御反应[13]。NRF2的激活可以调节HO-1的表达，HO-1是一种抗氧化酶，可以防止ROS的过度产生[14]。NRF2/HO-1信号通路是细胞抗氧化活性的关键调控因子，可缓解多种疾病引起的炎症反应。有研究表明，NRF2/HO-1信号通路的激活可以保护肾细胞免受顺铂诱导的急性肾损伤的影响[15]。本研究结果发现，CUR能够促进体内肾结石形成小鼠模型和COM诱导的HK-2细胞NRF2/HO-1信号通路相关蛋白的表达水平，为了进一步验证CUR对NRF2/HO-1信号通路的调控作用，我们采用NRF2抑制剂ML385干预HK-2细胞，再经CUR给药，值得注意的是，ML385能够阻断CUR对炎症相关蛋白的作用，表明CUR通过调控NRF2/HO-1信号通路抑制了HK-2细胞的炎症反应。
综上所述，CUR可减轻肾结石小鼠体内的氧化应激，从而改善炎症反应、肾结石沉积和肾小管损伤。CUR的这些保护作用可能是由于其抑制TLR4/NF-κB信号通路和诱导抗氧化调节因子NRF2及其抗氧化效应蛋白HO-1的作用有关，这些发现提示CUR是治疗肾结石的潜在选择。
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