2. 中国医科大学药学院，辽宁 沈阳 110122;
3. 中国医科大学生命科学院，辽宁 沈阳 110122
2. School of Pharmacy, China Medical University, Shenyang 110122, China;
3. School of Life Sciences, China Medical University, Shenyang 110122, China
邻苯二甲酸二异丁酯(diisobutyl phthalate缩写为DIBP)是塑料工业中广泛应用的增塑剂和软化剂，其作用是增加塑料的可塑性和韧性，提高塑料强度。近些年来研究表明该类物质以分子间作用与高分子塑料结合，随着时间的推移该类物质会逐渐地从塑料制品中释放出来，从而对环境、生物与食品造成污染，并可通过呼吸、饮食和皮肤进入人体内，对人体健康造成危害。研究提示，DIBP会造成动物的生殖和发育损害[1-3]。目前，只有澳大利亚对DIBP作了风险评估，但在报告中指出有关毒理学数据缺乏，还需完善毒理学资料。基于DIBP与健康密切相关，人们对它的许多安全隐患尚不明确，因此对该物质的毒理学安全性研究和评价就显得尤为重要。国内外关于其他邻苯二甲酸酯类物质的神经毒性文献已有少量报道，如Andral等通过研究指出DEHP孕期染毒，可使新生大鼠下丘脑视前交叉区芳香化酶表达量减低，抑制其活性产生影响导致大鼠神经功能异常[4-5]。DIBP与DEHP为同系物，被广泛作为增塑剂使用并具有造成神经系统不良影响的潜在危险。如王龙等[6]报道的邻苯二甲酸二丁酯引发显著的小鼠学习记忆障碍，而钙离子通道阻断药物尼莫地平对这一毒性作用具有良好的拮抗作用但具体的作用机制还尚未明确。
ANO2(ANOCTAMIN2)又名TMEM16B, 属于TMEM16的成员之一，作为钙激活的电压依赖性氯通道调节细胞内外的氯离子跨膜转运，目前研究表明其主要表达在中枢神系统如嗅觉、听觉神经元及嗅细胞、视网膜细胞上，生理条件下参与了嗅觉、视觉及听觉的产生及信号传递过程[7-12], 而病理条件下异常激活的钙激活的电压依赖性氯通道如TMEM16A参与了高盐饮食诱导的小鼠脑动脉重构[13]。国内外尚未进行广泛的ANO2的晶体结构、功能调节的研究，严重阻碍了靶向ANO2特异性药物的开发进程，也阻碍了深入研究ANO2通道介导疾病的病理生理机能研究。
本研究基于邻苯二甲酸酯类物质的神经毒性和ANO2在中枢神经系统内的神经信息传递功能，探索邻苯二甲酸酯类物质是否可通过直接作用在ANO2靶点产生各种神经系统的毒性损伤。研究结果表明DIBP可直接作用于ANO2靶点提高已激活ANO2通道的电导能力，其为小分子量化学分子，结构简单，故可作为ANO2特异性药物的先导化合物，为开发靶向ANO2的药物提供结构信息、为获得优化的ANO2特异性配体提供坚实的理论基础。
1 材料与试剂 1.1 实验材料Human Embryonic Kidney293细胞(HEK293细胞)购于(中国中科院上海细胞库), PEGFP-ANO2质粒(中国吉玛基因), 10%聚丙烯酰胺凝胶(上海雅酶生物医药科技有限公司), 聚丙烯酰胺膜PVDF(美国伯乐公司), 硼硅酸盐玻璃电极(美国Sutter Instrument公司), 35 mm培养皿、共聚焦皿(Thermo Fisher)等。
1.2 试剂实验药品DIBP、IL-8及钙荧光染料Fluo-4/F-127(美国Invitrogen公司), ECL发光试剂(中国Biosharp)、脱脂奶粉(美国BD公司)、CsCl、EGTA、NMDG、HEPES、Sucrose等(德国Sigma-Aldrich公司), liposome 2000(美国Invitrogen公司), 高糖DMEM培养基(美国Gibco公司), Fetal bovine serum(FBS)(乌拉圭Lonsera公司)等、ANO2抗体(ab113443)、β-actin抗体(ab8226)、辣根过氧化物酶标记的兔抗大鼠二抗(中国Biosharp)等、PCR扩增引物及相应荧光染料(上海生工生物工程股份有限公司)。
2 方法 2.1 细胞复苏、培养取出液氮罐保存的HEK293细胞，37 ℃水浴中快速融化，1 000 r·min-1离心5 min去上清，10% FBS/DMEM培养基重悬，细胞计数板计数后取适量细胞置于35 mm培养皿中37 ℃、5% CO2培养箱中培养。
2.2 转染用nanodrop测定经纯化后的质粒小提试剂盒提取的DH5α大肠杆菌中的PEGFP-ANO2质粒浓度，按1 μg每35 mm培养皿的剂量，应用liposome2000试剂进行转染，转染后6 h更换新鲜的培养液以消除脂质体对细胞的毒性损伤。
2.3 免疫印记及Real-time PCR技术鉴定ANO2的分子身份常规收集培养好的转染PEGFP-ANO2质粒的HEK293细胞，分别应用RIPA强裂解液、PMSF及超声的方法破碎细胞，12 000 r·min-1提取蛋白并应用BCA法进行蛋白定量，应用20 μg的总蛋白量电泳分离及恒流转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h后分别应用抗ANO2抗体及β-actin抗体4 ℃孵育摇床过夜，隔日加入辣根过氧化物酶标记抗体室温孵育2 h, TBST 3次清洗后应用ECL发光试剂盒检测ANO2是否成功表达；应用TRIzol试剂提取总RNA, namodrop检测总RNA的纯度和浓度，应用荧光染料SYBR Green法行real-time PCR检测ANO2是否特异性表达，上游引物5′-GTCGTTCTTGAAGATCAAAG-3′, 下游引物5′-CGA AGAAGGTGTCCTTTTC-3′; β-actin作为内参，上游引物5′-CCTGGCACCCAGCACAAT-3′, 下游引物5′-CCTGGCACCCAGCACAAT-3′, 反应条件95 ℃ 30s、95 ℃ 15s和60 ℃ 30 s、40个循环，单△CT法分析ANO2是否成功表达。
2.4 膜片钳技术鉴定ANO2分子身份及DIBP对激活状态下ANO2通道的药理作用应用美国AXON200b放大器/digita1550B模数转换器膜片钳系统进行ANO2的特异性配体的筛选，常规配置电极外液、1 μmol·L-1钙离子浓度的电极内液，在荧光显微镜下采用全细胞记录模式记录EGFP阴性/阳性表达的HEK293细胞膜上的氯电流，观察并记录加入DIBP药物前后ANO2氯电流的电生理特性的改变。
2.5 共聚焦显微镜检测IL-8、DIBP对HEK293胞内Ca2+信号的作用将细胞生长状态良好的HEK293细胞传入共聚焦皿内继续培养24 h, 贴壁后应用Hanks液洗涤，终体积为1 mL加入3 μL Fluo-4/1 μL F-127的预混钙离子荧光染料，避光37 ℃孵育45 min后加入1 mL的D-HANKS液清洗3遍。共聚焦显微镜下分别检测10 μmol·L-1 IL-8和10 μmol·L-1 DIBP对HEK293细胞中钙离子浓度的影响。
2.6 膜片钳技术检测DIBP对静息状态下ANO2的药理作用荧光显微镜下选择绿色荧光蛋白阳性表达的ANO2过表达的HEK293细胞，应用无钙电极内液填充玻璃微电极及全细胞记录模式检测IL-8和DIBP对静息状态ANO2的药理作用。
2.7 统计学方法所有数据均采用x±s表示，使用origin软件进行统计量计算及绘制统计图，应用adobe illustrator 2023软件进行组图，SPSS 23.0软件进行统计量统计分析，两组间差异比较采用t检验。
3 结果 3.1 DIBP的分子特性及化学结构式DIBP为无色、无味、粘稠状液体，并且热稳定性好，为邻苯二甲酸与异丁醇酯化反应生成的化合物，其基本结构见Fig 1。
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| Fig 1 The molecular structure of DIBP |
研究中应用EGFP标记的ANO2表达载体构建其过表达的HEK293细胞模型，采用免疫印记、荧光定量PCR及膜片钳技术分别从蛋白水平、核酸水平及分子功能水平加以表达鉴定。免疫印记在过表达ANO2表达载体的HEK293细胞中检测到了特异性表达条带，实时荧光定量PCR过表达ANO2表达载体的HEK293细胞提取的总RNA中检测到了ANO2的表达，且溶解曲线为单峰，提示引物特异性强(Fig 2); 膜片钳技术在过表达ANO2表达载体的HEK293细胞中检测到了钙激活的电压依赖性氯电流(Fig 3)。因此，分别从分子表达水平和功能水平证实成功建立了ANO2过表达的细胞模型，可用于ANO2特异性配体的筛选。
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| Fig 2 Identification of ANO2 expression level after HEK293 cells transfected with EGFP-marked ANO2 overexpression vector A: The represent picture of ANO2 protein expression using Western blot technique; B: The ANO2 Protein densitometry values in the histograms were expressed as-fold change relative to the β-actin, **P < 0.01 vs Con group (n=4); C: The ANO2 mRNA densitometry values in the histograms were expressed as-fold change relative to the β-actin, **P < 0.01 vs Con group (n=5). Con: Control group; oe ANO2: Overexpression ANO2 group. |
应用膜片钳技术里的电压钳全细胞记录模式，在1 μmol·L-1 Ca2+电极内液的条件下应用ramp和step电压刺激波形(Fig 3)及全细胞记录模式记录ANO2激活时的氯电流；待电流稳定后加入10 μmol·L-1的DIBP, 结果显示DIBP明显增加ANO2通道介导的外向整流的氯电流，其整流能力较加药前也显著增强，见Fig 4, 结果证实DIBP可提高激活状态下的ANO2介导的氯电流的幅度，即通过延长单通道的开放时间或增加单通道的开放频率来增强ANO2介导的氯电导。
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| Fig 3 The function identification of ANO2 expression after HEK293 cells transfected with EGFP-marked ANO2 overexpression vector A: The waveform for ANO2-meidated chloride current holding potential at 0mV and ramp from-100 to +100mV with duration 750 ms; B: The waveform for ANO2-meidated chloride current holding potential at 0mV and step from-100 to +100mV with duration 750 ms; C: The outward rectification current was recorded from HEK293 cells transfected with ANO2 overexpression vector but couldn′t from transfected with control vector using ramp protocol; D and E: The outward rectification current was recorded from HEK293 cells transfected with ANO2 overexpression vector but not HEK293 cells transfected with control vector using step protocol. Con: Control group; oe ANO2: Overexpression ANO2 group. |
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| Fig 4 Effect of DIBP on chloride current mediated by activating ANO2 The activating ANO2 was established using 1 μmol·L-1 calcium pipette solution. A: DIBP enhanced the chloride current mediated by ANO2 when using ramp protocol; B: The chloride current mediated by ANO2 before giving DIBP when using step protocol; C: The chloride current mediated by ANO2 after giving DIBP when using step protocol; D: The I-V curve to depict the effect of DIBP on ANO2-mediated chloride current (n=5); E: The statistical result of DIBP on Idensity at 100 mV recording potential (before 14.67±2.87, n=5) vs (after 28.75±4.05, n=5) **P < 0.01 vs before. |
ANO2作为一种钙激活的电压依赖性氯通道，其氯离子电导能力与胞浆内的钙离子浓度成正相关关系，DIBP增强活化状态ANO2的氯电导作用可能是通过升高胞质内钙离子浓度介导的。本研究应用Fluo-4/F-127预混的钙离子敏感的荧光染料孵育HEK293细胞，分别用10 μmol·L-1 IL-8(作为阳性对照药物)和10 μmol·L-1 DIBP即时给药后检测胞内钙离子的浓度变化。结果所示，IL-8给药后可引起胞内游离的钙离子浓度增加，而DIBP给药后胞内游离的钙离子浓度未见改变；结果证实DIBP并非通过升高胞内游离钙离子浓度间接发挥增强ANO2的氯电导作用，见Fig 5。
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| Fig 5 Action of DIBP on intracellular calcium signal in HEK293 cells A: IL-8 as a positive control drug that could induce endoplasmic reticulum releasing calcium and enhance Fluo-4 fluorescence intensity, DIBP could not directly regulate intracellular calcium signal; B: The time history curve was plotted after giving IL-8 or DIBP, and DIBP had not any effect on intracellular calcium signal following time flash. |
基于某些钙离子门控离子通道的激动剂可直接开放离子通道，为了证实DIBP是否通过这一作用形式产生ANO2激活作用，故应用膜片钳-全细胞记录模式及无钙电极内液记录条件下，分别检测10 μmol·L-1 IL-8和10 μmol·L-1 DIBP即时给药后的ANO2介导的氯电流，结果显示IL-8给药后可记录到ANO2介导的外向整流的氯电流，而DIBP给药后尚未记录到ANO2介导的外向整流的氯电流，结果表明DIBP并不能直接激活静息状态下ANO2, 见Fig 6。
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| Fig 6 The pharmacological activity of DIBP on resting ANO2 overexpressed in HEK293 cells The resting ANO2 was established using 0 μmol·L-1 calcium pipette solution. A: IL-8 as a positive control drug that could induce outward rectification chloride current in ANO2 overexpressed HEK293 cells; B: DIBP could not directly activate chloride current. |
DIBP为小分子的塑化剂，具有较高的脂溶性，可通过呼吸、饮食和皮肤进入人体内，进而对机体内多种组织器官产生毒性损伤，比如神经毒性、生殖毒性等等，但其致毒性损伤的机制尚未明确，严重妨碍了临床治疗DIBP的毒性损伤的治疗策略，因此，积极寻找DIBP毒性损伤的特异性靶点具有重要的临床意义，为开发治疗DIBP毒性损伤疾病的药物提供新的靶点和研究方向。ANO2作为钙激活的电压依赖性氯通道，调节细胞内外的氯离子跨膜转运，目前研究表明，其主要功能活动介导了嗅觉及听觉的产生及信号传递过程，基于ANO2的晶体结构尚未阐明，导致了开发特异性配体药物研发的延迟。ANO1和ANO2同属TMEM16(ANOCTAMIN)家族成员，两者蛋白一级结构中有约60%的氨基酸序列存在一致性，两者都是作为钙激活电压依赖性的氯通道，开发ANO1的特异性配体的研究策略可用于ANO2配体的研究，ANO1的晶体结构于2017年被成功破解，为开发特异性ANO1的配体药物提供了坚实的基础[14], 近期有研究者证实很多ANO1通道的特异性配体可能并非直接作用于ANO1结构上，而是通过改变胞内游离钙离子的信号转导进而产生活化或抑制ANO1的氯通道功能[15], 如Eact促进TRPV1介导的钙离子内流而活化ANO1通道[16]。本研究分别检测DIBP对ANO2介导的氯电导的作用及DIBP对HEK293胞内钙信号的作用，结果证实DIBP通过直接作用调节激活状态下的ANO2的氯电导，此作用是非间接胞内钙信号介导的。离子通道电导的大小取决于膜上离子通道的数量、单个离子通道开放的时间及单个离子通道的开关频率[17], 本研究中采用过表达ANO2的HEK293细胞为研究对象，其单个记录细胞膜上的ANO2分子数量在膜片钳实验中稳定不变，故推测DIBP可能通过影响单个ANO2氯通道的开放时间或开放频率提高氯电导作用的，研究中还证实DIBP在电极内液无钙条件下不能直接活化ANO2, 提示DIBP不改变ANO2对电压的敏感性且不能独立的活化静息状态的ANO2分子，其可能是通过增强ANO2对钙离子的敏感性进而延长单通道开放时间或开放频率增强其氯电导。基于ANO2的晶体结构未知，DIBP在ANO2上的特异性结合位点尚无法应用MOE软件进行预测，后续实验将要检测DIBP对ANO1通道电流的作用并进行相应的ANO1/ANO2位点交互突变以寻找特异性的ANO2上的DIBP结合位点。本研究首次证实DIBP具有显著的增强ANO2氯电导的作用，其可作为ANO2特异性配体的先导化合物，为医药企业开发靶向ANO2的特异性配体药物提供良好的结构信息基础。
综上所述，本研究证实DIBP这种小分子化合物，以胞内钙离子依赖性的方式活化ANO2通道介导的氯电导，该化合物的结构信息为开发靶向ANO2的药物提供了丰富的结构信息，同时也为深入研究ANO2功能调节机制提供了新的视角，为研究ANO2介导的生理功能及病理功能机制提供了有力的工具药物。
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