2. 中国人民解放军西部战区总医院，四川成都 610083
2. the General Hospital of Western Theater Command, Chengdu 610083, China
国际糖尿病联盟(The International Diabetes Federation, IDF)发布的第10版《IDF全球糖尿病地图》显示，全球有5.37亿成年人(20-79岁)患有糖尿病，预计到2030年这一数字增至6.43亿，2045年将增至7.84亿，糖尿病已成为威胁人口健康的重要问题[1]。糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病的重要并发症，是导致糖尿病患者死亡的主要原因之一[2]。临床治疗DCM策略以控制血糖为主，缺乏针对性治疗方案。中医药治疗糖尿病及其并发症具有悠久历史，近年来已发现多个中药及其有效成分对DCM具有治疗潜力[3]。
蜀椒即为四川省特产川花椒(Zanthoxylum bungeanum Maxim.)，近年来，关于川花椒治疗心血管疾病的药用价值，逐渐受到关注[4]。故课题组在乌头赤石脂丸基础上重用蜀椒加减形成临床经验方“舒心汤”。课题组前期建立DCM药效学体内外验证模型实验结果显示，使用舒心汤治疗后，可明显提高高糖损伤心肌细胞存活率，改善DCM鼠的心功能。我们证明课题组经验方舒心汤对DCM具有治疗作用，并在该方指导下研究DCM针对性候选药物。川花椒作为舒心汤的“君药”，在疾病治疗中发挥主要作用，山椒素类化合物是川花椒最主要的功能性组分之一，是其麻味来源，并对心脏有保护作用，能明显改善糖尿病所致心肌病[5]。此外，研究发现羟基-α-山椒素(hydroxy-α-sanshool，SAN)可改善糖尿病鼠的蛋白紊乱、脂质紊乱及肥胖，但对DCM的疗效观察及保护机制尚不清楚[6]。因此本次研究主要探究SAN治疗DCM小鼠的疗效，差异蛋白表达情况及参与的保护机制，并对相关通路的关键蛋白表达量进行Western blot验证。
1 材料与方法 1.1 实验动物SPF级健康雄性C57BL/6小鼠24只，7~8周龄，体质量(20±2)g，购自成都达硕实验动物有限公司，生产许可证号SCXK(川)2020-030。24只小鼠随机分组分笼喂养，自由获得食物和水，明暗周期各12 h，室温维持24 ℃。
1.2 药物及试剂STZ(S110910)购自北京索莱宝科技有限公司；SAN(纯度≥98.00%，分子式C16H25NO2，分子量263.375；DQ0175)购自成都德思特生物技术有限公司；SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(P0015F)，BCA定量试剂盒(P0012)购自上海碧云天生物技术有限公司；Tris(T0826-500g)，BSA(A0332)购自上海生工生物工程有限共司；碘乙酰胺(I1149-5G)、三氟乙酸(T6508)和二硫苏糖醇(43819-5G)均购自美国Sigma公司；甲酸(A117)购自美国Thermo Fisher Scientific；乙腈(1000304008)购自美国Merck；HCl(10011018)购自国药集团化学试剂有限公司；Trypsin(V5117)购自美国Promega；cAMP抗体(DF6523)、PKA抗体(AF7746)和HRP标记山羊抗兔二抗(S0002)购自常州市祥泰生物技术有限公司。
1.3 仪器Easy nLC色谱系统(美国Thermo Fisher Scientific)；低温高速离心机(德国Eppendorf 5430R)；电泳仪(美国BIO-RAD)；超声破碎仪(宁波新芝JY96-IIN)；Orbitrap Exploris 480质谱仪(美国Thermo Fisher Scientific)；Multiskcan FC酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific)；真空离心浓缩仪(太仓华美LNG-T98)；MP Fastprep-24匀浆仪(美国MP Fastprep-24 5G)。
1.4 方法 1.4.1 DCM模型的建立、分组及给药24只小鼠适应性饲养1周后，随机分为对照组(CON组)、DCM组和SAN治疗组(DCM+SAN组)，每组8只小鼠。CON组普通饲料喂养，DCM组和DCM+SAN组高脂饲料(脂肪、蛋白质、碳水化合物)喂养。4周后，DCM组和DCM+SAN组禁食不禁水12 h，连续7 d腹腔注射STZ(50 mg·kg-1)，CON组小鼠注射等体积溶媒(柠檬酸盐缓冲液，pH 4.5)。注射7 d后禁食12 h尾静脉采血，测空腹血糖≥11.1 mmol·L-1视为诱导糖尿病成功，继续饲养10周使其发展为DCM[7]。造模成功后，DCM+SAN组通过灌胃给药(8 mg·kg-1，蓖麻油作为溶媒灌胃)，其余两组以等体积蓖麻油灌胃，持续给药4周[6]。
1.4.2 血糖测定、心脏超声实验开始每周测1次空腹血糖直至结束。药物干预结束后，异氟烷呼吸麻醉小鼠行心脏超声检测，对心脏左室收缩及舒张末期的容积及内径进行测量，计算左室射血分数(left ventricular ejection fractions, LVEF)和左室缩短分数(left ventricular fractional shortening，LVFS)。
1.4.3 心脏取材超声结束12 h内腹腔注射戊巴比妥钠麻醉小鼠，生理盐水清洗并分离心脏，一部分心肌组织放入4%多聚甲醛固定以备观察病理形态，另一部分冻存于-80 ℃冰箱用于蛋白组学及Western blot检测。
1.4.4 心肌组织病理形态观察取固定的心脏组织进行脱水，固定，石蜡包埋，切片(4 μm)，采用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining，HE)染色，完成后中性树胶封片，显微镜下观察心肌组织的病理形态变化并拍照。
1.4.5 检测蛋白质酶解肽段取冻存心脏组织剪碎加入适量SDT裂解液后匀浆破碎，沸水浴10 min，冷却后低温离心取上清液，将取得样本用BCA法进行蛋白定量，计算相应蛋白浓度。样品蛋白加上样缓冲液，沸水浴后进行SDS-PAGE电泳。质检合格后进行蛋白过滤器辅助样品制备(filter-aided sample preparation, FASP)酶解：加入二硫苏糖醇(dithiothreitol, DTT)进行肽段还原，之后加入碘乙酰胺(IAA)进行烷基化，尿素及置换buffer分别置换3次进行超滤。最后肽段冻干后加入甲酸溶液复溶用于后续检测。
1.4.6 液相色谱-质谱连用分析采用纳升流速Easy nLC系统进行色谱分离。A液为0.1%甲酸水溶液，B液为0.1%甲酸乙腈水溶液。色谱柱(C18分析柱：IonOpticks, Australia，25 cm×75 μm，1.6 μm，C18 beads)以100%的A液平衡，样品由自动上样器上样到分析柱分离，流速为300 nL·min-1。设置液相梯度：1.5 h梯度：0~2 min，B液4%~6%；2~75 min，B液线性梯度从6%~28%；75 min~80 min，B液线性梯度从28%~38%；80 min~85 min，B液线性梯度从38%~100%；85 min~90 min，B液维持在100%。样品经色谱分离后直接进行质谱分析。一级质谱分辨率为120 000，AGC target为300%，一级Maximum IT为50 ms。二级质谱分辨率15 000，Microscans为1，二级Maximum IT为35 ms。
1.4.7 生物信息学分析将实验所得蛋白质数据与swissprot数据库中蛋白质数据信息进行定量蛋白比对分析，得出不同组别差异蛋白。筛选样本组内重复实验数据中至少有一半为非空值的数据进行统计分析，以fold change≥1.2(上下调)且t test＜0.05为筛选标准筛选差异表达蛋白质[8]。对样品和差异蛋白质的表达量两个维度进行分类，并生成层次聚类热图。利用Blast2Go数据库(https://www.blast2go.com/)进行基因本体(gene ontology，GO)功能二级注释分析。使用KEGG数据库(https://www.genome.jp/kegg/)进行京都基因和基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析。运用string网站(https://string-db.org/)及cytoscape软件对关键通路差异表达蛋白进行蛋白质互作网络分析。
1.4.8 Western blot验证cAMP信号通路关键蛋白表达水平将小鼠心脏组织进行总蛋白提取，BCA蛋白定量法测定蛋白浓度。制胶，上样，电泳(80 V 0.5 h，120 V 1 h)，切胶，转膜(300 mA，1.4 h)，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，一抗室温孵育1 h后4 ℃过夜，次日取出PVDF膜，TBST清洗后(5 min/次，3次)加入山羊抗兔Ⅱ抗孵育1 h，TBST清洗(5 min·次-1，3次)，加入显影液显影并利用UVP成像仪拍照。ImageJ软件计算条带灰度值，半定量分析后比较各组差异。
1.4.9 统计学分析数据统计分析由SPSS 26.0软件分析，数据用x±s表示，两组间差异用t检验，单因素方差分析对多组间差异进行分析。
2 结果 2.1 各组小鼠血糖及心功能变化与CON组相比，DCM组与DCM+SAN组小鼠血糖明显升高并≥11.1 mmol·L-1(P＜0.01)；SAN干预结束后(20 weeks)，小鼠血糖无明显变化；SAN持续给药干预处理后，观察小鼠心脏LVFS和LVEF变化，超声显示与CON组相比，DCM组LVFS和LVEF明显降低(P＜0.05)；与DCM组相比，DCM+SAN组小鼠LVFS和LVEF明显升高(P＜0.05)(Fig 1)。表明，SAN未能明显改善小鼠的血糖，但对心功能有保护作用。
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| Fig 1 Effect of hydroxy-α-sanshool on cardiac dysfunction and blood glucose caused by diabetes mellitus A: Blood glucose change of mice; B: Image of M-mode echocardiography; C: Left ventricular ejection fraction (LVEF); D: Left ventricular fractional shortening (LVFS). *P＜0.05，**P＜0.01 vs CON group；#P＜0.05 vs DCM group. |
HE染色显示，CON组小鼠心肌组织整齐排列，层次鲜明，组织结构清洗可见。DCM组小鼠心肌组织排列紊乱，细胞肥大变形且大小不一，组织结构模糊、稀疏。DCM+SAN组小鼠心肌组织排列紊乱及细胞肥大得到明显改善，组织结构较DCM组更为清晰(Fig 2)。表明，SAN对DCM小鼠的心肌组织具有保护作用。
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| Fig 2 Hydroxy-α-sanshool ameliorated diabetes-induced myocardial histopathology (100 μm) |
电泳结果显示，电泳条带清晰，平行性好，无蛋白降解(Fig 3)。表明样本蛋白满足后续开展蛋白定量实验。
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| Fig 3 SDS-PAGE gel map of cardiac sample M: Marker. D1, D2, D2 represent DCM group. B1, B2, B3 represent. DCM+SAN group. |
为了筛选DCM小鼠使用SAN治疗与否心脏组织中的差异蛋白，将实验数据和数据库对比，共鉴定出160个差异表达蛋白, 其中127个蛋白发生表达上调，33个蛋白发生表达下调，按照差异表达进行火山图可视化；将蛋白质相对表达数据进行分层聚类分析并在热图中可视化(Fig 4)证实蛋白质的合理性获取。
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| Fig 4 Statistics of differentially expressed proteins in cardiac tissue of mice in DCM group and DCM+SAN group A: The volcano map of the differentially expressed proteins in each group; B: Hierarchical clustering of the differentially expressed proteins. |
根据GO富集分析结果，展示DCM组与DCM+SAN组在GO功能二级注释的结果(Fig 5)。主要生物过程主要有：细胞过程(cellular process)，生物调节(biological regulation)，代谢过程(metabolic process)，细胞成分组织或生物成因(cellular component organization or biogenesis)，对刺激的反应(response to stimulus)。主要分子结构主要有：黏合物(binding)，催化活性(catalytic activity)，分子功能调节器(molecular function regulator)。主要细胞结构主要有细胞部分(cell part)，细胞器部分(organelle part)，细胞器(organelle)，含有蛋白质的复合体(protein-containing complex)。
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| Fig 5 Secondary annotation diagram of GO function of differentially expressed proteins A: Biological process, BP; B: Molecular function, MF; C: Cellular component, CC. |
以KEGG通路为单位，将筛选出的差异蛋白进行Fisher′s精确检验，根据相应的P-value(-log10)得分及富集的蛋白数量对疾病和功能进行排序，以区分这些蛋白质与不同疾病和功能之间的相关性或重要性(Fig 6)。对前20种疾病和功能进行展示，结果显示cAMP信号通路(cAMP signaling pathway)排名最高(Tab 1)；以cAMP信号通路为对象，展示通路中相应蛋白变化情况(Fig 7)。结果表明，cAMP信号通路可能是SAN对DCM小鼠有效作用的最重要机制之一。
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| Fig 6 KEGG enrichment analysis of differentially expressed proteins |
| Term | Count | P-value(-log10) |
| cAMP signaling pathway | 12 | 2.99 |
| cGMp-PKG signaling pathway | 11 | 2.88 |
| Carbohydrate digestion and absorption | 5 | 2.81 |
| Glycosphingolipid biosynthesis - ganglio series | 3 | 2.72 |
| Pancreatic secretion | 8 | 2.54 |
| Other glycan degradation | 4 | 2.25 |
| Sphingolipid signaling pathway | 10 | 2.16 |
| Cushing syndrome | 7 | 2.1 |
| Amoebiasis | 10 | 2.04 |
| Long-term depression | 6 | 2.02 |
| Gastric acid secretion | 6 | 1.93 |
| Salivary secretion | 6 | 1.93 |
| Natural killer cell mediated cytotoxicity | 8 | 1.92 |
| Thyroid hormone signaling pathway | 9 | 1.92 |
| Other types of O-glycan biosynthesis | 3 | 1.86 |
| Endocrine and other factor-regulated calcium reabsorption | 6 | 1.84 |
| Oxytocin signaling pathway | 11 | 1.82 |
| Aldosterone-regulated sodium reabsorption | 4 | 1.8 |
| Glycosphingolipid biosynthesis - globo and isoglobo series | 2 | 1.74 |
| Transcriptional misregulation in cancer | 7 | 1.73 |
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| Fig 7 The pathway diagram of cAMP signaling pathway KEGG Red represents the differentially expressed proteins of change |
利用String数据库对cAMP信号通路上的差异蛋白进行网络互作分析，再用cytoscape软件根据蛋白互作间的度值进行可视化。PKA与其他明显差异表达的蛋白显示出最多的相互作用(Fig 8)。结果表明，PKA是cAMP信号通路上的核心蛋白。
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| Fig 8 Analysis diagram of cAMP signaling pathway protein interaction network The figure is rendered according to the degree of value. Orange-yellow-green-blue represents degree of value from high to low. |
DCM组小鼠心肌组织中的cAMP和PKA蛋白相对表达量均明显低于CON组(P＜0.05)；DCM+SAN组小鼠心肌组织中的cAMP和PKA蛋白相对表达量均明显高于DCM组(P＜0.05)(Fig 9)。
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| Fig 9 Western blot changes in expression of differentially expressed proteins A: The protein levels of PKA were detected by Western blot; B: The protein levels of cAMP were detected by Western blot. *P < 0.05 vs CON group, #P < 0.05 vs DCM group. |
山椒素是脂肪链酰胺生物碱，有广泛的生物学效应，其中SAN在花椒中含量为71.75~191.65 mg·g-1[9]。药代动力学数据显示，健康受试者口服或皮下注射SAN后，可迅速吸收、分布，SAN口服30 min后，血浆SAN浓度达到最大值，为0.76~2.66 μmol·L-1, 半衰期为1.6~1.7 h，药代动力学拟合后呈线性[10]。
生物信息学推测SAN可能通过cAMP信号通路保护糖尿病心功能。研究发现通过激活cAMP信号通路，对DCM、心脏衰竭和心肌缺血再灌注等多种疾病有保护作用[11-12]。cAMP是心脏细胞中的中枢第二信使，也是心脏病理生理的关键调节分子，正常的心脏功能通过调控cAMP合成和降解之间的平衡来严格控制细胞内cAMP浓度[13-14]。cAMP信号通路是经典的G蛋白偶联受体通路，调节和测量心肌cAMP的钙调素和其他调节蛋白。其在调节心肌细胞功能的不同方面起着关键作用，包括基因转录、细胞代谢和介导心脏兴奋－收缩耦连。此外，细胞外刺激，如神经递质、激素、趋化因子、脂质介质和药物，可以通过与大量跨膜G蛋白偶联受体结合来调节腺酰环化酶的活性，从而增加或减少cAMP的产生达到对心脏收缩功能的调节[11]。
通过建立DCM小鼠模型，证实SAN对糖尿病心功能有保护作用，能明显改善糖尿病所致心脏功能及结构的损伤。利用蛋白质组学技术对DCM小鼠使用SAN治疗与否心脏组织中的差异蛋白进行检测，再对差异蛋白进行生物信息学分析。GO富集分析结果表明，差异蛋白主要参与细胞过程、代谢过程、对刺激的反应等过程，大部分位于细胞器及含有蛋白质的复合体；KEGG通路分析，差异蛋白涉及的cAMP信号通路富集最丰富，可能是SAN保护DCM小鼠的最重要机制之一；蛋白互作确定了cAMP信号通路上的关键蛋白及蛋白间互作关系。通过Western blot验证cAMP、PKA及所在通路可能参与了SAN对DCM的保护作用。为精确阐释SAN对DCM的作用机制，课题组将进一步验证相关通路具体互作机制通路的作用，以助力于对DCM治疗开发新的靶点及药物。
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