根据国家癌症中心数据显示，2022年全国癌症患者中肺癌死亡人数最多，其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)约占肺癌的85%[1]。NSCLC临床上常采用外科手术切除治疗，但在切除手术后也可能会出现癌症复发[2-3]。此外，常用含铂类和紫杉类药物化疗联合治疗，但其效率较低，且易发生耐药性[4-5]。NSCLC最常见的突变是表皮生长因子受体(EGFR)发生突变，而AG1478作为一种EGFR酪氨酸激酶抑制剂，通过竞争性结合EGFR结构域中ATP结合位点，阻断信号传导从而达到抑制肿瘤的效果[6]。奥沙利铂(oxaliplatin，OXA)是第三代抗肿瘤铂类化疗药，同前两代铂类化疗药一样存在临床耐药的问题，而联合治疗成为OXA解决这一问题的有效手段[7]。韦东雪等[8]研究表明，AG1478可增加结直肠癌细胞对OXA的药物敏感性。自噬是细胞质物质被运送到溶酶体进行降解的过程，在控制细胞代谢中起着至关重要的作用[9]。自噬在肿瘤细胞中的作用是一把双刃剑，它既可以抑制肿瘤也可以促进肿瘤的发生[10]。Lu等[11]研究发现，人PINK1基因(PTEN induced kinase 1，PINK1) 是肺癌的不良预后因子，通过调节自噬促进肺癌细胞的增殖。Zhang等[12]研究表明，lncRNA PANDAR作为一种肿瘤抑制因子，通过上调BECN1表达来激活自噬和凋亡途径，从而抑制NSCLC细胞的增殖，这表明自噬与肺癌的发生发展及治疗密切相关。因此，本文探究AG1478联合OXA对NSCLC H1975细胞自噬的影响，以期为临床应用于NSCLC治疗提供数据基础与理论依据。
1 材料与试剂 1.1 细胞株人肺癌细胞H1975购自中国科学院细胞库。
1.2 药物与试剂OXA购自索莱宝(货号08390)；AG1478购自Med Chem Express(货号HY-13524)；PI3K抑制剂LY294002购自MCE(货号HY-10108)；N-乙酰半胱胺酸NAC购自MCE(货号HY-B0215)；MTT购自索莱宝(货号M8180)；ECL极敏化学发光试剂购自Affinity(货号)；一抗(PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、Beclin-1、LC3，ABcam)。
2 方法 2.1 细胞培养采取青-链霉素∶胎牛血清∶DMEM基础培养基为1 ∶ 10 ∶ 89的DMEM完全培养基在培养条件为37℃，5% CO2的培养箱进行孵育培养H1975肺癌细胞(以下培养条件相同)。后续实验研究取对数生长期细胞进行。
2.2 MTT法检测药物半数致死浓度 2.2.1 检测OXA以及AG1478对H1975肺癌细胞药物半数致死浓度将对数生长期H1975肺癌细胞以5×107个/L密度、每孔100 μL接种至96孔板中，培养至细胞贴壁后，再分别更换成100 μL含OXA培养基(0、25、50、75、88、100、112、125、150 μmol·L-1)或者含AG1478培养基(0、5、10、15、20、25、30、35、40 μmol· L-1)。更换为含药培养基48 h后，每孔避光快速加入10 μL MTT溶液，培养箱中避光孵育4 h，每孔避光快速加入150 μL DMSO，在酶标仪(490 nm)处测定吸光度。
2.3 分组给药根据实验结果进行分组：Control组(不含药)、OXA-25、OXA-50、OXA-100(OXA浓度分别为25、50和100 μmol·L-1的培养处理)、AG-20(AG1478浓度为20 μmol· L-1的培养处理)和OXA-25+AG-20(以OXA浓度为25 μmol· L-1和AG1478浓度为20 μmol·L-1的培养联合处理)。
2.4 H2DCFDA检测ROS水平以3×108个/L细胞密度将H1975细胞均匀接种于6孔板中，每孔2 mL培养基。细胞贴壁后，实验分组同“2.3”项。加药48 h后，PBS洗涤两次，加入1 mL含10 μmol· L-1 H2DCFDA的培养基，放回培养箱孵育30 min，PBS轻柔清洗3次后加入适量胰酶消化，离心后PBS重悬细胞沉淀，将其以每孔5 000个细胞数接种于96孔板，用多功能荧光酶标仪进行分析(Ex/Em=488/525 nm)。
2.5 MDC法检测细胞自噬接种方式同“2.4”项。细胞贴壁后，细胞分组同“2.3”项。加药处理后，PBS洗涤2次，加入MDC染液，继续孵育30 min，洗涤液清洗3次，充分去除未进入细胞的MDC染液，胰酶消化后使用Assay Buffer重悬细胞沉淀，将其以每孔5 000个细胞数接种于96孔板，用多功能荧光酶标仪分析(Ex/Em=335/512 nm)。
2.6 Westernblot法检测PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、Beclin-1、LC3II蛋白表达水平接种方式同“2.4”项。细胞贴壁后，细胞分组同“2.3”项。加入含药培养基48 h后进行收集细胞进行裂解，收集蛋白上清液，并对各组蛋白进行定量。对定量好的蛋白进行电泳(选用10% SDS-PAEG)，最终上样蛋白质量为10 μg。电泳分离结束后，对凝胶上的蛋白进行转印、封闭2 h、一抗4 ℃孵育过夜。封闭液用5%脱脂牛奶和TBST配制，一抗稀释比例为1 ∶ 1 000。次日用TBST洗涤3次(每次10 min)后，进行二抗孵育90 min(1 ∶ 10 000)，用化学发光成像系统进行成像拍照分析。ImageJ计算各组蛋白表达量。
2.7 统计学处理用SPSS 27.0软件进行数据统计分析，数据结果以x±s表示。多组均数采用One-Way ANOVA检验，组间两两比较采用LSD-t检验。
3 结果 3.1 OXA和AG1478分别作用于H1975细胞的半数抑制浓度(IC50)根据MTT实验检测不同浓度OXA、AG1478作用H1975细胞48 h后细胞活力，结果显示，与对照组比较，OXA对H1975细胞增殖有明显抑制作用，IC50值为70.86 μmol·L-1(Fig 1A)；AG1478对H1975细胞增殖有明显抑制作用，IC50值为24.24 μmol·L-1(Fig 1B)。因此，后续研究中选择低于OXA半数抑制浓度的剂量(25 μmol·L-1)和低于AG1478半数抑制浓度的剂量(20 μmol·L-1)进行两药联合剂量研究。
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| Fig 1 Activity of AG1478 and OXA on H1975 cells measured by MTT assay (x±s, n=3) A: The IC50 of OXA in H1975 cells; B: The IC50 of AG1478 in H1975 cells. **P < 0.01 vs Control group. |
通过ROS探针H2DCFDA检测H1975细胞ROS水平，实验结果显示，与对照组比较，OXA单药组(OXA-25、OXA-50、OXA-100)、AG1478单药组及联合用药组ROS水平升高，差异均有统计学意义(P < 0.01，P < 0.05，P < 0.01) (Fig 2A)；与对照组相比，联合用药组ROS水平升高，NAC处理组ROS水平降低，差异均有统计学意义(P < 0.01) (Fig 2B)；NAC为ROS清除剂，与联合用药组相比较，NAC预处理的联合用药组ROS水平下降(P < 0.01)；因此，AG1478与OXA联合使用明显升高H1975细胞内ROS水平，联合用药对ROS水平升高作用高于OXA单独用药。
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| Fig 2 ROS levels on H1975 cells detected by ROS probe H2DCFDA (x±s, n=3) A: Effects of OXA combined with AG1478 on ROS levels in H1975 cells; B: Effects of ROS scavenger NAC pretreatment on ROS levels in H1975 cells. *P < 0.05, **P < 0.01 vs Control group; ##P < 0.01 vs OXA-25+AG-20 group. |
MDC实验结果显示，与对照组比较，OXA单药组(OXA-25、OXA-50、OXA-100)、AG1478单药组及联合用药组自噬水平升高，差异均有统计学意义(P < 0.01，P < 0.01，P < 0.01)；与OXA单药组(OXA-25)比较，联合用药组自噬水平升高，差异均有统计学意义(P < 0.01), 结果表明，单药组与联合用药组促进H1975细胞自噬水平的表达(Fig 3)。
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| Fig 3 Intensity of autophagy fluorescence detected by MDC assay in H1975 cells (x±s, n=3) **P < 0.01 vs Control group; ##P < 0.01 vs OXA-25+AG-20 group. |
Western blot结果显示，与对照组比较，OXA单药组(OXA-25、OXA-50、OXA-100)、AG1478单药组及联合用药组Beclin-1、LC3Ⅱ的蛋白表达上调，差异均有统计学意义(P < 0.05，P < 0.05)；与OXA单药组(OXA-25)比较，联合用药组Beclin-1、LC3Ⅱ的蛋白表达水平升高，差异均有统计学意义(P < 0.05，P < 0.01)(Fig 4)，结果表明，单药组与联合用药组均促进H1975细胞自噬蛋白LC3II、Beclin-1表达，同时AG1478促进OXA对H1975细胞自噬作用。
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| Fig 4 Effects of AG1478 combined with OXA on expression of Beclin-1 and LC3Ⅱ in H1975 cells (x±s, n=3) A, B: Effect of OXA combined with AG1478 on the expression level of autophagy protein in H1975 cells. 1:Control; 2:OXA-25;3:OXA-50;4:OXA-100;5:AG-20;6:OXA-25+AG-20.*P < 0.05, **P < 0.01 vs Control group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs OXA-25+AG-20 group. |
与对照组比较，OXA单药组(OXA-25、OXA-50、OXA-100)、AG1478单药组及联合用药组PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达均下调，差异均有统计学意义(P < 0.01，P < 0.05，P < 0.05，P < 0.05)；与OXA单药组(OXA-25)比较，联合用药组PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT的蛋白表达水平均下降，差异均有统计学意义(均P < 0.01)；结果表明，单药组与联合用药组均抑制PI3K信号通路(PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT)的蛋白表达，同时AG1478增强了OXA抑制PI3K信号通路相关蛋白表达，见Fig 5。
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| Fig 5 Effects of AG1478 combined with OXA on expression of PI3K, p-PI3K, AKT, p-AKT in H1975 cells (x±s, n=3) 1:Control; 2:OXA-25;3:OXA-50;4:OXA-100;5:AG-20;6:OXA-25+AG-20. *P < 0.05, **P < 0.01 vs Control group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs OXA-25+AG-20 group. |
与对照组比较，联合用药组Beclin-1、LC3Ⅱ表达上调，差异均有统计学意义(P < 0.01，P < 0.01)，应用10 μmol·L-1 NAC预处理后，联合用药组Beclin-1、LC3Ⅱ上调水平被抑制，差异均有统计学意义(P < 0.01，P < 0.05)，表明联合用药调控ROS水平升高进而促进H1975细胞自噬(Fig 6)。
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| Fig 6 Effects of AG1478 combined with OXA on expression of Beclin-1 and LC3Ⅱ in H1975 cells regulated by ROS (x±s, n=3) A, B: Effects of ROS scavenger NAC pretreatment on the expression level of autophagy protein in H1975 cells(A-B). 1:Control; 2:OXA-25+AG-20;3:NAC; 4:NAC+OXA-25+AG-20. *P < 0.05, **P < 0.01 vs Control group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs OXA-25+AG-20 group. |
与对照组比较，联合用药组Beclin-1、LC3Ⅱ表达上调，差异均有统计学意义(P < 0.05，P < 0.05)，LY294002是一种广谱PI3K抑制剂，应用10 μmol·L-1浓度LY294002预处理后，联合用药组Beclin-1、LC3Ⅱ上调水平更明显，差异均有统计学意义(P < 0.05，P < 0.05)；表明联合用药抑制PI3K信号通路激活进而促进H1975细胞自噬(Fig 7)。
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| Fig 7 Effects of AG1478 combined with OXA on expression of Beclin-1 and LC3Ⅱ in H1975 cells regulated by PI3K signaling pathway (x±s, n=3) A, B: Effects of PI3K inhibitor LY pretreatment on the expression level of autophagy protein in H1975 cells regulated by ROS. 1:Control; 2:OXA-25+AG-20;3:LY; 4:LY+OXA-25+AG-20. *P < 0.05, **P < 0.01 vs Control group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs OXA-25+AG-20 group. |
与对照组比较，联合用药组PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT的蛋白表达均下调，差异均有统计学意义(均P < 0.01)；应用10 μmol·L-1 NAC预处理后，联合用药组PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT下调水平被抑制，差异均有统计学意义(均P < 0.01)；表明联合用药调控ROS水平升高进而抑制PI3K信号通路的激活(Fig 8)。
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| Fig 8 Effects of AG1478 combined with OXA on expression of PI3K, p-PI3K, AKT, p-AKT in H1975 cells regulated by ROS (x±s, n=3) A, B: Effects of ROS scavenger NAC pretreatment on the expression level of PI3K, p-PI3K, AKT, p-AKT in H1975 cells. 1:Control; 2:OXA-25+AG-20;3:NAC; 4:NAC+OXA-25+AG-20. *P < 0.05, **P < 0.01 vs Control group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs OXA-25+AG-20 group. |
OXA可诱导ROS生成，进而增强肿瘤初期进展中的化疗效果[13]。ROS是由一系列含氧的高活性物质如过氧化氢、自由基和氧阴离子组成，可导致细胞损伤[14-15]。Navarro-Yepes等[16]研究表明，ROS可以促进自噬的发生，而自噬与癌症抑制密切相关。PI3K/AKT信号通路是与磷脂酰肌醇有关的信号通路，参与调控癌细胞代谢、增殖、转录及蛋白质合成等多个生物学过程，在细胞生存中发挥重要作用[17]。为进一步验证自噬、ROS和PI3K信号通路之间的关系，我们利用NAC预处理后发现，ROS水平有所下降，OXA联合AG1478作用于H1975细胞对自噬的促进作用被抑制；当使用LY预处理后，PI3K水平有所下降，OXA联合AG1478作用于H1975细胞对自噬的促进作用被抑制；当使用NAC预处理后，ROS水平有所下降，OXA联合AG1478作用于H1975细胞对PI3K/AKT信号通路的抑制作用有所回升。
综上所述，本实验通过AG1478联合OXA作用于NSCLC H1975细胞，探究了AG1478联合OXA对NSCLC H1975细胞自噬的影响，实验结果表明细胞内ROS水平升高，PI3K/AKT信号通路的激活被抑制，促进H1975细胞发生自噬。本研究结果为AG1478进一步开发为EGFR小分子抑制剂联合OXA抗NSCLC提供了实验数据基础与理论依据。
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