2. 贵州医科大学基础医学院机能实验室, 贵州 贵阳 550025
2. Lab of Functional Experiments, School of Basic Medical Sciences, Guizhou Medical University, Guiyang 550025, China
砷是一种在自然界中广泛存在的非金属元素，人群常通过水、食物和空气等途径接触砷而导致人体砷中毒[1]。我国是砷污染较为严重的国家，其中贵州是我国一个典型的燃煤污染型地方性砷中毒病区[2]。经过流行病学调查，发现砷可造成包括心血管系统、呼吸系统、神经系统、内分泌系统和皮肤在内的许多人体系统和器官的毒性损伤[3]。砷可诱发中枢和周围神经病变，导致多发性神经炎和神经衰弱等疾病[4]。但是，砷引起神经损伤的具体机制至今仍不十分明确。Hippo-YAP信号通路的核心部分是由3个激酶组成的级联反应构成，分别是哺乳动物STE20样蛋白激酶1/2(mammalian STE20-like protein kinase 1/2，MST1/2)，大肿瘤抑制因子1/2 (large tumor suppressor 1/2，LATS1/2) 和最终效应因子Yes相关蛋白(Yes-associated protein，YAP)[5]。此通路在调节细胞周期、控制细胞增殖与凋亡方面有重要作用，并且在进化上高度保守[6]。本课题组前期研究已经证明，NaAsO2能激活Hippo-YAP通路，诱导PC12细胞凋亡，促进细胞S期阻滞[7]，而且Hippo-YAP通路参与NaAsO2影响PC12细胞活力、形态及突触后致密蛋白95(post synaptic density protein，PSD95)、突触素蛋白(synaptophysin，SYN)表达[8]。那么，Hippo-YAP信号通路是否参与NaAsO2对PC12细胞周期及细胞凋亡的影响，本实验将在前期研究基础上对这些问题进行探讨。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞系PC12细胞株，从中科院昆明细胞库购买。
1.1.2 试剂亚砷酸钠(S7400)购于美国Sigma公司。青霉素- 链霉素(15140163)、高糖DMEM培养基(8120293)和胰蛋白酶(25200056)均购自Gibco公司。胎牛血清(10099141C)于BioInd公司购买。XMU-MP-1(HY-100526)购自MCE公司。一抗抗体LATS1(17049-1-AP)、MST1(22245-1-AP)、YAP1(13584-1-AP)、BAX(50599-2-Ig)、p53(10442-1-AP)和BCL-2(12789-1-AP)均在ProteintechGroup公司购买。Phospho-MST1(49332S)和Phospho-LATS1(9157S)购自Cell Signaling Technology。Phospho-YAP1(ab76252)订购自Abcam。内参抗体Tubulin(11224-1-AP)、Histone-H3(17168-1-AP)和GAPDH(10494-1-AP)于ProteintechGroup公司订购。抗兔IgG-HRP二抗(ZB-2305)从北京中衫金桥订购。细胞周期检测试剂盒(KGA512)及细胞凋亡检测试剂盒Annexin V-FITC /PI(KGA1012)于凯基生物购买。核蛋白提取试剂盒(R0050)从索莱宝购买。
1.1.3 仪器流式细胞仪FACSCalibur(美国BD公司)，细胞超净工作台(苏州净化)，凝胶全自动成像仪(美国SynGene公司)，全波长多功能酶标仪(美国BioTek公司)，恒温二氧化碳细胞培养箱Model 310(美国ThermoFisher公司)，激光共聚焦显微镜(日本Nikon公司)。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养PC12细胞置于饱和湿度、37 ℃和5% CO2的培养箱中，用含10% FBS和1%青霉素-链霉素的高糖DMEM全培养基进行培养。培养基两天更换一次，细胞融合度达到80%时，进行传代或冻存。
1.2.2 细胞处理及分组免疫荧光实验将细胞分为control组和NaAsO2(40 μmol·L-1)组，其余实验将细胞分为control组、NaAsO2(40 μmol·L-1)组、NaAsO2+XMU-MP-1(3 μmol·L-1)组、XMU-MP-1组。
1.2.3 细胞周期检测PC12细胞以5×108 L-1的密度铺于6孔板中培养过夜。以含3 μmol·L-1 XMU-MP-1的高糖DMEM培养基对NaAsO2+XMU-MP-1组及XMU-MP-1组细胞预处理4 h。之后分别用含40 μmol·L-1 NaAsO2、40 μmol·L-1 NaAsO2+3 μmol·L-1 XMU-MP-1、3 μmol·L-1 XMU-MP-1的高糖培养基处理细胞，空白对照组以高糖培养基培养。细胞处理24 h，无EDTA胰酶消化并收集。使用PBS进行清洗，然后以1 100 r·min-1的速度离心5 min，这个步骤重复2次，并且丢弃上清液。接着，使用70%的乙醇在4 ℃下固定30 min，固定完成后以1 100 r·min-1的速度离心5 min并丢弃固定液。再次使用PBS清洗2次，加入300 μL的PI/RNase，避光在室温下孵育60 min。最后，使用流式细胞仪对细胞样品进行检测。
1.2.4 流式细胞仪检测PC12细胞凋亡本实验分组以及细胞收集、固定步骤同“1.2.3”。接着PBS洗2次，1 100 r·min-1离心弃上清。加500 μL PBS吹打得细胞悬液。然后加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI振荡混匀，避光冰上静置20 min，用流式细胞仪检测。
1.2.5 核质分离在处理完所有细胞组后，移除培养液并用PBS进行一次清洗。然后，使用细胞刮刀收集细胞，以2 000 r·min-1的速度离心2 min，丢弃上清液。接着，加入200 μL的浆蛋白提取试剂，摇匀后在冰浴中放置10 min。然后进行高速振荡，4 ℃下以1.2×104 r·min-1的速度离心10 min，取上清液(即细胞浆蛋白)备用。细胞核为沉淀物，加入50~100 μL的核蛋白提取试剂，高速涡旋15 s以确保充分分散，然后在冰浴中放置10 min。再次进行高速涡旋，4 ℃下以1.2×104 r·min-1的速度离心10 min，取上清液(即细胞核蛋白)。
1.2.6 Western blot检测经过药物处理的各组细胞，使用200 μL含有PMSF的RIPA裂解液在冰上裂解细胞10 min，然后以1.2×104 r·min-1离心15 min。使用BCA法测量上清液的浓度。然后使用双蒸水和5×上样缓冲液将各组蛋白调至相同浓度，以100 ℃变性8 min。使用恒压电泳将蛋白质分离，然后转移到PVDF膜上。在室温下使用5%脱脂牛奶封闭2 h，然后在4 ℃下孵育一夜使用一抗(根据抗体说明书稀释)或内参(GAPDH、Tubulin、Histone-H3)。使用TBST洗膜5 min，重复3次，然后在室温下孵育兔二抗(1 ∶10 000稀释)2 h。再次使用TBST洗膜3次，使用化学发光方法，全自动凝胶成像仪进行检测，并用ImageJ软件进行蛋白条带的分析和处理。
1.3 统计学分析用SPSS 25. 0和GraphPad Prism 8.0对实验结果进行统计分析。数据表示为x±s，采用t检验进行两独立样本比较；使用单因素方差分析及事后检验进行多组数据间比较。
2 结果 2.1 NaAsO2对PC12细胞中YAP蛋白核质分布的影响核质分离，检测YAP蛋白核质分布，如Fig 1A所示，与control组相比，40 μmol·L-1 NaAsO2组中YAP总蛋白的表达无变化，细胞质内的YAP蛋白表达明显升高(P < 0.05)，而细胞核内YAP蛋白的表达明显减少(P < 0.01)。利用免疫荧光对YAP蛋白染色，如Fig 1B所示，control组的细胞核显示较强的红色荧光，胞质内荧光强度较弱；而NaAsO2处理后，细胞核中的红色荧光减弱，胞质内荧光增强。
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| Fig 1 Effect of NaAsO2 on YAP protein in cytoplasmic and nucleus of PC12 cells detected by Western blot (A) and immunofluorescence (B) (x±s, n=3) *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group. |
如Fig 2所示，与control组相比，40 μmol·L-1 NaAsO2处理PC12细胞24 h后，Hippo-YAP信号通路中的p-MST1、p-LATS1、p-YAP蛋白表达以及p-LATS1/LATS1、p-YAP/YAP比值增加(P < 0.01)。而经过XMU-MP-1(MST1/2抑制剂)预处理后，p-MST1、p-LATS1、p-YAP蛋白表达以及p-LATS1/LATS1、p-YAP/YAP比值相比于NaAsO2组均有所下调(P < 0.05)。
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| Fig 2 Effect of NaAsO2 and XMU-MP-1 on expression of proteins associated with Hippo-YAP signaling pathway in PC12 cells (x±s, n=3) *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs As treatment group |
通过流式细胞仪检测各组细胞周期的变化，如Tab 1和Fig 3所示，与control组相比，XMU-MP-1对PC12细胞周期无影响。NaAsO2组G0/G1期细胞比例由control组的(63.80±0.69)%下降到(59.83±1.02)%(P < 0.01)，S期比例由control组的(17.25±1.09)%上升到(19.29±0.63)%(P < 0.05)，提示细胞周期被阻滞在S期。而XMU-MP-1预处理后，G0/G1期细胞比例由NaAsO2组的(59.83±1.02)%上升到(64.62±0.56)%(P < 0.01)，S期比例由NaAsO2组的(19.29±0.63)%下调到(16.71±0.31)%(P < 0.01)，可逆转NaAsO2对S期的影响。
| Group | G0/G1(%) | S(%) | G2/M(%) |
| control | 63.80±0.69 | 17.25±1.09 | 17.96±0.98 |
| XMU-MP-1 | 64.02±0.15 | 16.81±0.25 | 18.08±0.86 |
| As | 59.83±1.02** | 19.29±0.63* | 19.72±0.56 |
| XMU-MP-1+As | 64.62±0.56# | 16.71±0.31# | 17.53±0.32# |
| * P＜0.05, ** P＜0.01 vs control group; # P＜0.01 vs As treatment group. | |||
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| Fig 3 Effect of NaAsO2 and XMU-MP-1 on cell cycles of PC12 cells (x±s, n=3) |
利用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率，如Fig 4所示，PC12细胞经NaAsO2处理24 h后，凋亡率由control组的3.83% 上升至11.00%(P < 0.01)，而XMU-MP-1预处理后，凋亡率由NaAsO2组的11.00%下降到6.88%(P < 0.05)。然后，再利用Western blot检测凋亡相关蛋白，如Fig 5所示，与control组相比，NaAsO2处理24 h后明显下调BCL-2蛋白表达，上调BAX、P53蛋白表达(P < 0.01)。而与NaAsO2组相比，XMU-MP-1预处理可以上调BCL-2蛋白表达，下调P53、BAX蛋白表达(P < 0.05)。两部分结果都表明，XMU-MP-1预处理可以部分逆转NaAsO2诱导的细胞凋亡。
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| Fig 4 Effect of NaAsO2 and XMU-MP-1 on apoptosis rates of PC12 cells (x±s, n=3) *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05 vs As treatment group. |
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| Fig 5 Effect of NaAsO2 and XMU-MP-1 on expression of apoptosis-related proteins in PC12 cells (x±s, n=3) *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs As treatment group. |
研究显示，砷暴露严重影响学习记忆、认知能力以及神经系统的发育[9]。课题组前期研究证明NaAsO2可抑制PC12细胞生长[10]，促进细胞凋亡，并且干扰细胞周期，激活Hippo-YAP信号通路[7]。
Hippo-YAP信号通路是一条高度保守的信号通路，可以对细胞增殖与凋亡进行调控。文献报道，Hippo-YAP通路激活时，首先是MST1/2被磷酸化激活，然后MST1/2磷酸化LATS1/2，最终导致YAP蛋白磷酸化阻止其入核；而Hippo-YAP通路失活时，未磷酸化的YAP蛋白转移至细胞核，然后与转录因子TEAD结合以诱导细胞生长和增殖相关的基因表达[5]。而用XMU-MP-1抑制MST1/2的活性可逆转NaAsO2对Hippo-YAP通路的激活及对PC12细胞活力、形态及神经突触相关蛋白的影响[8]。本次实验还发现，NaAsO2激活Hippo-YAP通路后可抑制YAP蛋白入核，这可能是Hippo-YAP通路参与NaAsO2对PC12细胞生长的依据。
细胞周期分四个不同阶段，DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)和有丝分裂期(M期)。毒性损伤会导致细胞周期检查点的异常，使细胞周期停留在某一阶段[11]。研究表明YAP蛋白可以促进B-MYB和FOXM1表达，并且诱导B-MYB与MuvB复合物在S期结合形成MMB亚复合物。MMB亚复合物招募FOXM1，在S/G2过渡期形成MMB: FOXM1复合物。进入G2期后，B-MYB被降解，FOXM1磷酸化激活促进G2/M期基因表达，使细胞进入M期[12]。研究发现，利用siRNA敲低YAP表达将导致WB-F344细胞(大鼠肝上皮样干细胞)停滞在G0/G1期[13]。本课题组前期研究发现NaAsO2处理PC12细胞24 h后p-YAP表达和S期细胞比例均明显增加，细胞阻滞在S期[7]。而用XMU-MP-1阻断Hippo-YAP通路则逆转NaAsO2诱导的S期阻滞，表明Hippo-YAP通路参与NaAsO2对细胞周期的影响。
BCL-2可抑制细胞凋亡，而BAX则促进凋亡的发生，当BAX/BCL-2的比例增加时，可促进细胞凋亡[14]。P53是肿瘤抑制基因，其编码的P53蛋白可促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤发生[15]。Jin等[16]发现，YAP通过与TEAD相互作用并结合到BCL-2启动子区域来上调BCL-2转录。前期研究发现NaAsO2能增加PC12细胞凋亡及P53、BAX蛋白表达而下调BCL-2的表达，提示NaAsO2可能通过促进YAP磷酸化阻碍其入核，来抑制BCL-2表达，从而促进PC12细胞凋亡。利用XMU-MP-1阻断Hippo-YAP通路则逆转NaAsO2对细胞凋亡、P53、BCL-2和BAX表达的调控，表明Hippo-YAP通路参与NaAsO2对细胞凋亡的影响。
综上所述，本研究发现NaAsO2激活Hippo-YAP通路可改变YAP蛋白核质分布，而NaAsO2诱导细胞S期阻滞和促进细胞凋亡的内在机制可能涉及Hippo-YAP通路。然而，YAP如何进一步调控细胞周期，是否通过结合启动子来调控凋亡相关蛋白表达，仍需要进一步实验加以验证。
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