宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一。全球癌症统计最新数据显示，60.4万例新发病例中约有一半的患者死亡[1]。在发展中国家或欠发达地区，由于缺乏充分的筛查和疫苗低接种率，宫颈癌发病率占全球宫颈癌发病率的80%[2-3]。目前，宫颈癌最常见的治疗方法是手术治疗、化疗和放疗，但预后效果差、病灶易转移、患者生存率低等弊端也逐渐显现。有研究者发现，宫颈癌组织中自噬相关蛋白Beclin1的表达量要低于癌旁组织，自噬与宫颈癌的发生发展密切相关[4]。因此，寻找通过调节自噬抑制恶性肿瘤的新药物已经引起了宫颈癌领域研究者的关注。
大叶蛇葡萄(Ampelopsis megalophylla Diels et Gilg)为葡萄科蛇葡萄属植物，叶及嫩茎为其主要药用部位，收载于《湖北省中药材质量标准》(2018年版)[5]，主产于湖北西部、贵州、四川等地。蛇葡萄素(ampelopsin，AMP)，又名二氢杨梅素，是从大叶蛇葡萄中提取的主要活性成分。据报道AMP具有抗氧化、抗炎及抗癌等多种药理作用[6]。也有研究发现，AMP可以诱导多种类型的癌细胞凋亡和自噬，包括乳腺癌、胃癌、膀胱癌等[7-8]，但目前AMP抗宫颈癌的研究除本课题组外未见报道。
课题组前期对AMP诱导宫颈癌的活性进行了筛选，发现其对SiHa细胞敏感性较高，并从凋亡角度进行了研究[9]，同时在观察凋亡小体时，发现了自噬现象。因此，本研究采用MDC染色法、TEM研究AMP对SiHa细胞和C-33A细胞自噬的影响；通过mRFP-GFP-LC3转染法、Western blot进一步探究AMP干预SiHa细胞后自噬及PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白的表达变化，旨在探究AMP对SiHa细胞自噬的影响，并进一步研究AMP诱导SiHa细胞自噬的分子机制，期望为宫颈癌的治疗提供新的方法并为创新药物的研究提供新的策略。
1 材料与方法 1.1 细胞株人宫颈癌SiHa(批号CL-0210)和C-33A(批号CL-0045)细胞购自中国科学院细胞库。
1.2 药物与试剂蛇葡萄素(AMP，纯度≥98%，课题组自制)；3-MA(批号N1012A，大连meilunbio公司)；MEM培养基(批号PM152340，武汉Procell生命科技有限公司)；磷酸盐缓冲液(PBS，批号AE29031187，美国Gibco公司)；胰蛋白酶(批号J180026，美国Hyclone公司)；青霉素-链霉素(批号J180034，美国Hyclone公司)；胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS，批号42G4084K，美国Gibco公司)；MDC染色液(批号BCBX0277，美国Sigma公司)；电镜固定液(批号G1102，美国SPI公司)；抗荧光猝灭封片剂(批号AS1236，武汉阿斯本生物技术有限公司)；mRFP-GFP-LC3转染试剂盒(批号AP20102504，上海汉恒生物科技有限公司)；ECL发光试剂盒(批号MA0186，大连meilunbio公司)；二甲亚砜(DMSO，批号RNBF8134，美国Sigma公司)；抗体P62(39749s)、Beclin-1(3495s)、Atg13(13273s)、p-AKT(4060s)、p-mTOR(5536s)(美国CST公司)；p-PI3K(ab182651，美国abcam公司)；LC3(14600-1-AP)、HRP标记的山羊抗兔二抗(批号SA00001-2，武汉Proteintech公司)。
1.3 主要仪器IX51 Olympus倒置显微镜(日本Olympus公司)；Galaxy s+CO2培养箱(英国RS Biotech公司)；电泳仪(美国Bio-RAD公司)；UC7型超薄切片机(德国Leica公司)；Tecnai G220TWIN透射电子显微镜(美国FEI公司)；LSM880型激光共聚焦显微镜(德国ZEISS公司)；Syngene Gene Genius全自动凝胶成像系统(英国Syngene公司)。
1.4 方法 1.4.1 试剂配制AMP和3-MA均用DMSO分别配制成16、125 mmol·L-1的贮存液，给药时用MEM稀释成不同的浓度，DMSO的最终浓度低于0.1%。
1.4.2 细胞培养与实验分组在37 ℃、5% CO2的培养箱中培养SiHa和C-33A细胞；培养基为含有10% FBS和1%青-链霉素的MEM。待细胞生长至对数期时，用不同浓度的AMP处理细胞，实验分为空白对照组和给药组。
1.4.3 MDC法观察自噬现象取对数生长期的SiHa和C-33A细胞分别以1×105/孔接种于6孔板中，放置培养箱中孵育过夜，待细胞密度长至约80% 时，加入不同浓度的AMP(10、20、40、80 μmol·L-1)。培养24 h后弃去旧培养基，每孔加入500 μL MDC溶液(50 μmol·L-1)，孵育40 min后弃去染液，PBS润洗3遍，在激光共聚焦显微镜下观察自噬小体。
1.4.4 TEM观察细胞超微结构的变化取对数生长期的SiHa和C-33A细胞，分别消化成单细胞悬液后以1×106/皿接种于10 cm培养皿中，置于培养箱中培养。SiHa细胞中AMP浓度为20和80 μmol·L-1，C-33A细胞中AMP浓度为20和40 μmol·L-1。培养24 h后，先用4 mL预冷的PBS洗两遍，缓慢加入电镜固定液5 mL，4 ℃固定约3 h。随后轻轻刮下细胞转移到15 mL离心管内，800 r·min-1离心5 min，弃去大部分上清液后加入1 mL固定液，4 ℃固定保存。PBS漂洗3次，每次15 min，再用1%的锇酸加上0.1 mol·L-1 PBS室温固定2 h，PBS漂洗3次，依次用50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇各脱水15 min。丙酮-812包埋剂室温静置过夜，60 ℃聚合48 h，在超薄切片机中切成60~80 nm薄片。铀铅双染色15 min，室温干燥过夜，TEM下观察细胞超微结构变化。
1.4.5 mRFP-GFP-LC3转染检测细胞自噬流强度取对数生长期的SiHa细胞消化传代后以5×105/孔接种于6孔板中，培养箱中培养过夜。细胞长至70%~80%时，加入病毒颗粒感染SiHa细胞，48 h后细胞转染成功，加入不同浓度的AMP(20、40、80 μmol·L-1)，置培养箱中继续孵育24 h。4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗2遍，共聚焦显微镜下观察细胞内的自噬情况，拍照记录。
1.4.6 Western blot检测自噬相关蛋白及PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白的表达情况细胞培养同“1.4.2”，用20、40、80 μmol·L-1的AMP作用SiHa细胞12 h或40 μmol·L-1的AMP作用6、12、24 h，弃去旧培养基，用PBS洗涤2次，加入含磷酸酶和蛋白酶抑制剂的裂解液，5 min后刮取细胞收集至EP管中，放入装有冰水混合物的超声仪内，超声10 s停顿5 s，重复3次。然后置于冰上裂解20 min。4 ℃，12 000 r·min-1离心10 min，取上清，根据上清体积加入5×Loading buffer，沸水浴8 min。SDS-PAGE电泳分离蛋白后，半干式转膜至经甲醇活化的PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1.5 h，一抗4 ℃摇床孵育过夜。HRP标记的抗兔IgG二抗室温孵育1 h，TBST洗涤3次，加入ECL化学发光液，将PVDF膜置于全自动化学发光分析仪中显影并分析结果。
1.4.7 Western blot法检测3-MA和AMP联合干预时PI3K/AKT/mTOR通路蛋白的表达变化给药组设置为空白对照组、AMP(80 μmol·L-1)组、3-MA(5 mmol·L-1)组、AMP+3-MA组。细胞长至70%~80%时，AMP+3-MA组先加入抑制剂3-MA作用2 h后再加入AMP，其他组别对应加入10 mL药液，继续恒温孵育12 h。
1.4.8 统计学分析所有数据以 x±s表示，采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，多组间比较采用单因素方差分析，用GraphPad Prism检验计算组间变量的显著性，进行数据分析、作图。
2 结果 2.1 AMP可增加SiHa和C-33A细胞内的自噬水平结果如Fig 1所示，空白对照组中绿色荧光信号较弱，随着AMP干预浓度的增加(10、20、40、80 μmol·L-1)，颗粒状绿色荧光信号逐渐增强，在80 μmol·L-1组细胞数量明显减少，颗粒状绿色荧光增多，表明自噬小体的数量增加，自噬增强。以上结果说明，AMP可能诱导SiHa和C-33A细胞发生自噬。
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| Fig 1 AMP increased autophagy levels in SiHa and C-33A cells in a concentration-dependent manner (autophagosome: dot green fluorescence, ×1 000) |
如Fig 2A所示，空白对照组的SiHa细胞结构完整清晰，线粒体形态正常；AMP(20 μmol·L-1)干预组可见少量单层膜结构的自噬溶酶体(图中红色箭头所示)，部分线粒体嵴溶解；AMP(80 μmol·L-1)干预组细胞内观察到较多的自噬溶酶体和自噬小体(图中黄色箭头所示)，线粒体也出现明显肿胀和空泡化。如Fig 2B所示，空白对照组的C-33A细胞状态良好，线粒体和内质网形态正常；AMP(20 μmol·L-1)干预组可见自噬溶酶体；AMP(40 μmol·L-1)干预组细胞内观察到较多的自噬溶酶体和自噬小体，细胞核皱缩，线粒体也出现肿胀和空泡化。以上结果表明，AMP可诱导SiHa和C-33A细胞自噬。
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| Fig 2 AMP induced morphological characteristics of autophagy in SiHa and C-33A cells A: SiHa cells were treated with AMP (0, 20 and 80 μmol·L-1) for 12 h. B: C-33A cells were treated with AMP (0, 20 and 40 μmol·L-1) for 12 h. Red arrows indicated autophagolysosome. Yellow arrows indicated autophagosome. |
如Fig 3A所示，随着AMP干预浓度的增加，标记LC3的绿色GFP荧光逐渐减弱，指示自噬溶酶体的红色mRFP荧光逐渐增强，代表自噬体的黄色荧光(Merge)也逐渐增强，表明自噬体和自噬溶酶体数量明显增加。如Fig 3B所示，随着AMP浓度的增加，GFP逐渐减少，mRFP逐渐增多，如Fig 3C所示，两种荧光重叠比例(黄色荧光Merge)也逐渐增大。以上结果表明，AMP可呈剂量依赖性地增强SiHa细胞自噬流。
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| Fig 3 AMP-induced autophagic flux enhancement in SiHa cells (x±s, n=6) Green GFP fluorescent label LC3; Red mRFP fluorescence indicated autophagic lysosomes; Yellow fluorescence (Merge) indicated the autophagosome(×1 000). *P < 0.05, **P < 0.01 vs Control group. |
如Fig 4A所示，与空白对照组相比，经AMP干预后，Beclin-1、Atg13表达水平随着AMP浓度的增加逐渐上升，LC3Ⅱ/Ⅰ比值增加，而P62的表达水平则呈下降趋势。如Fig 4B所示，随着AMP干预时间的延长，Beclin-1、Atg13表达水平明显上升，LC3Ⅱ/Ⅰ比值呈上调趋势，P62表达下调。结果表明，AMP可呈浓度和时间依赖性地激活自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、P62、Beclin-1、Atg13的表达，从而诱导自噬。
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| Fig 4 Effect of AMP on protein expression of Beclin-1, Atg13, P62 and LC3 in SiHa cells (x±s, n=3) *P < 0.05, **P < 0.01 vs Control group. |
PI3K/AKT/mTOR信号通路是肿瘤免疫中的重要通路之一，其中磷酸化蛋白p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表达量是判断通路是否被激活并参与到细胞自噬的重要指标。结果如Fig 5所示，随着AMP浓度的升高，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表达量均明显下降，总蛋白PI3K、AKT、mTOR的表达量基本不变；随着作用时间的延长，SiHa细胞内的p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表达量均呈明显下降的趋势，总蛋白表达量基本不变。结果表明，AMP可呈剂量和时间依赖性地下调p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表达量，抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路，促进自噬的发生。
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| Fig 5 Effect of AMP on protein expression of PI3K/AKT/mTOR pathway (x±s, n=3) 1:Control; 2:AMP; 3:3-MA; 4:AMP-3-MA. **P < 0.01 vs Control group. |
3-MA是一种特异型自噬抑制剂，也是PI3K抑制剂，为了明确3-MA是否可以抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导的自噬，本研究利用3-MA和AMP同时干预SiHa后，通过Western blot法检测信号通路相关蛋白的表达情况。结果如Fig 6所示，与空白对照组相比，AMP与3-MA联用后，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表达量有所上调，总蛋白PI3K、AKT、mTOR的表达量基本不变，说明抑制自噬后，AMP对PI3K/AKT/mTOR信号通路的抑制作用被逆转，AMP对SiHa细胞的诱导自噬作用减弱。
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| Fig 6 Effect of autophagy inhibitor 3-MA combined with AMP on expressions of pathway-related proteins (x±s, n=3) *P < 0.05, **P < 0.01 vs Control group. |
目前，临床治疗宫颈癌药物紫杉醇或与铂类联合用药等存在较严重副作用与耐药性，因此当前研究的关键是寻找更加安全有效的药物。
自噬是细胞内程序性死亡的一种方式，与凋亡不同，它通过溶酶体途径将细胞器等包裹在双层膜结构的自噬小体中，并进行自我降解，促进细胞内代谢循环过程以维持细胞内的稳态。自噬与肿瘤之间联系紧密，可以清除肿瘤组织中坏死的细胞器及有毒物质，在肿瘤的发展过程中起着重要作用[10]。
中药及其提取物可以多途径多靶点参与到肿瘤发展的各个过程，包括肿瘤细胞的生长、增殖、分化、凋亡及自噬等，起到预防和治疗肿瘤的作用。AMP是从大叶蛇葡萄中提取出的一种小分子化合物，已有研究证明，AMP对人脑胶质瘤、膀胱癌、结直肠癌等都有较好的体外抑制增殖作用，但是AMP对宫颈癌的作用及深入的分子机制研究甚少。本课题组前期研究发现，AMP可抑制SiHa细胞增殖，降低线粒体膜电位，通过抑制线粒体途径诱导细胞凋亡，同时发现自噬现象[11]。
本研究以宫颈癌细胞SiHa和C-33A为研究对象，MDC染色法为初步观察自噬现象最常用的荧光探针之一。首先通过该法观察到绿色荧光标记的自噬小体，且随着AMP浓度的增加，发生自噬的细胞数量逐渐增多。但MDC是一种嗜酸性荧光探针，因此，很多酸性膜性结构也会被染色，故为进一步确定自噬现象的发生，采用自噬检测的金标准TEM法，结果发现了AMP干预后细胞明显的形态学变化及细胞内部出现的自噬小体和自噬溶酶体。这两种方法分别从荧光探针和细胞形态结构两个方面证实AMP可诱导人宫颈癌SiHa和C-33A细胞发生自噬。采用mRFP-GFP-LC3转染法从定性和定量两方面证明了AMP可呈剂量依赖性地增强SiHa细胞自噬流。LC3Ⅱ/Ⅰ、P62、Beclin-1、Atg13均为自噬标志性蛋白，被激活后可诱导细胞发生自噬，本研究发现，AMP可以上调SiHa细胞中LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、Atg13的表达，下调P62的表达，说明AMP呈时间-剂量依赖性地诱导了SiHa细胞自噬。
PI3K/AKT/mTOR信号通路已有研究证明在宫颈癌中发挥重要作用[12]。多种生长因子及信号传导复合物激活PI3K并引起其磷酸化，PI3K募集到活化受体AKT并将其转运至细胞膜上，再通过磷酸化多种酶、激酶等下游因子调节细胞功能。PI3K/AKT下游靶点是mTOR，由磷酸化的AKT激活，起到控制细胞生长的作用。PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活与肿瘤的发生密切相关，它可以加速细胞周期G1~S期的转换，促进细胞增殖，抑制细胞自噬，抑制肿瘤细胞迁移[13-14]。因此，抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路可诱导肿瘤细胞自噬。本实验中，通过Western blot发现，AMP可以抑制PI3K、AKT和mTOR的磷酸化水平，且呈时间-剂量依赖性，说明AMP可以通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路而诱导人宫颈癌细胞SiHa自噬。
3-MA是一种自噬抑制剂，也是一种Ⅲ型PI3K抑制剂，通过阻止自噬体的形成及PI3K与自噬蛋白的结合而阻断自噬，许多研究证实3-MA可以减轻细胞毒性作用，逆转自噬[15-16]。因此，本研究中加入抑制剂3-MA后，PI3K、AKT和mTOR的磷酸化水平均呈上升趋势，3-MA逆转了AMP的诱导细胞自噬的作用。
综上所述，AMP可诱导SiHa和C-33A细胞自噬，SiHa细胞发生自噬的机制可能与抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路有关。后期将进一步探索AMP所诱导的自噬和凋亡之间是否还存在着某种关系，并将进一步进行相关的体内研究。
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