2. 河北省中西医结合肝肾病证研究重点实验室，河北 石家庄 050091;
3. 河北中医药大学药学院，河北 石家庄 050091;
4. 河北中医药大学中医临床技能中心，河北 石家庄 050091
2. Hebei Key Laboratory of Integrative Medicine on Liver-Kidney Patterns, Shijiazhuang 050091, China;
3. College of Pharmacy, Hebei University of Chinese Medicine, Shijiazhuang 050091, China;
4. Chinese Medicine Clinical Skills Center, Heibei University of Chinese Medicine, Shijiazhuang 050091, China
糖尿病肾脏疾病(Diabetic kidney disease，DKD)是糖尿病最常见的微血管并发症，也是导致患者进展至终末期肾病，最终应用肾脏替代治疗的主要原因之一[1]。鉴于DKD的严重不良预后，因此DKD的防治已经成为现代医学的一项艰巨任务。现代研究发现，在DKD中肾组织固有细胞自噬通路受阻，溶酶体酸化缺陷，无法去除异常和错误折叠蛋白质、受损的细胞器及代谢废物，从而导致肾脏组织学病变[2]。
钠-葡萄糖共转运蛋白-2(sodium-dependent glucose transporters 2，SGLT2)抑制剂恩格列净作为一种新型的口服降糖药，除了具有降低血糖、血脂，减轻体重的作用外，还可通过改善肾缺氧、降低肾脏高滤过、抑制氧化应激和炎症等延缓糖尿病并发症出现及DKD的进展[3]。EMPA-REG OUTCOME试验证实，恩格列净不仅显著降低2型糖尿病合并心血管疾病患者死亡和心衰住院风险，并可延缓肾脏疾病的进展和降低临床相关肾脏事件的发生率[4]。此外，恩格列净还可诱导AMP激活的蛋白激酶和沉默信息调节因子1活化，正向调节自噬，维持肾脏细胞的稳态，降低肾脏损伤[5-6]，但其对自噬的调控是否通过保护溶酶体途径实现的尚未可知。因此，本研究上述研究基础上，通过建立DKD小鼠模型，观察恩格列净是否通过调节自噬-溶酶体通路发挥肾脏保护作用。
1 材料与方法 1.1 材料与试剂恩格列净片(批号J20171073)购自上海勃林格殷格翰药业有限公司；微管相关蛋白1轻链3B抗体(LC3B，批号ab48394)、p62/SQSTM1抗体(批号ab91526)、Beclin 1抗体(批号ab62557)、Agt7抗体(批号ab133528)、溶酶体相关膜蛋白1抗体(LAMP 1，批号ab25245)、Bcl-2抗体(批号ab32124)、caspase-3抗体(批号ab184787)、Bax抗体(批号ab32503)购自美国Abcam公司；肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α，批号SXR063)、白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β，批号SXR026)、单核细胞趋化因子-1(monocyte chemokine-1，MCP-1，批号SXR043)试剂盒均购自上海森雄科技实业有限公司；β-actin抗体(批号GB11001)、HRP标记羊抗兔抗体(批号GB23303)、磷酸化酶抑制剂和蛋白酶抑制剂批号(批号G2007)、ECL化学发光试剂盒(批号G2014)购自武汉赛维尔生物科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒(批号A53225)购自美国Thermo Fisher Scientific公司。
1.2 仪器ImagQuant LAS4000型全自动凝胶成像系统(美国通用GE公司)；7600-020全自动大型生化分析仪(日本Hitachi公司)；BX63+DP72型正置研究级显微镜(日本Olympus公司)；DYY-6C型电泳仪(北京六一仪器厂)；Centrifuge5417R型低温离心机(德国Eppendorf公司)，RM2050石蜡切片机(德国Leica公司)，全自动模块化石蜡包埋机(德国SLEE公司)。
1.3 实验动物健康雄性db/db和db/m小鼠(11~12周龄，SPF级)，遗传背景为C57BLKS/J，购自江苏常州卡文斯实验动物有限公司，合格证号SCXK(苏)2021-0013。其中db/db小鼠16只，体质量(45±5)g；db/m小鼠8只，体质量(25±5)g，于湿度50%~70%，温度(24±1) ℃条件下喂养。小鼠可自由进食进水，并维持12 h光照/黑暗循环。所有动物实验均在所在机构动物伦理委员会许可的前提下进行，并遵循动物实验伦理准则。
2 方法 2.1 实验分组将适应性喂养1周后的db/db小鼠监测尿蛋白均阳性后随机分为模型组(Model)、恩格列净组(Empagliflozin)，每组8只，db/m组小鼠8只作为正常组(Control)。各组继续饲喂小鼠维持饲料直至实验结束，维持饲料主要含蛋白质21.1%，脂肪4.5%，碳水化合物60.6%等；由北京博泰宏达生物技术有限公司提供。
2.2 实验药物及干预恩格列净片溶于蒸馏水中，给药剂量为10 mg·kg-1·d-1[4]，根据给药剂量配置药液质量浓度为1 g·L-1(0.1%)，每天灌胃1次，连续灌胃8周。正常组和模型组每日用等体积的蒸馏水灌胃。
2.3 标本收集各组小鼠于实验结束时置于代谢笼中收集24 h尿液，测尿量，EP管分装后置-80 ℃冰箱保存；并于禁食不禁水12 h后，3%异氟烷吸入麻醉，股动脉取血，脱颈椎处死后，剖开腹腔，完整剪下肾脏，剥离肾包膜，并将肾组织一部分放入4%多聚甲醛中固定，用于光镜检测，另一部分肾脏放入-80 ℃冰箱冻存，用于Western blot检测。
2.4 观察指标 2.4.1 各组小鼠24 h尿蛋白定量(24 h urine protein，24h-UTP)检测将收集的小鼠尿标本在4 ℃离心机中以3 000 r·min-1离心15 min后取上清，按照尿蛋白定量试剂盒的操作说明书测定各组小鼠尿蛋白浓度，然后根据各组小鼠尿量计算24 h-UTP。
2.4.2 各组小鼠生化指标检测将收集的各组小鼠血液置于全自动血生化分析仪上测定其血糖(fasting blood glucose，FBG)、糖化血红蛋白(glycosylated hemoglobin，HBA1c)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三脂(triglyceride，TG)、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(creatinine，Scr)水平。
2.4.3 各组小鼠血清炎症因子检测将收集的各组小鼠血液，置于离心机中3 000 r·min-1，4 ℃离心10 min分离血清，按照试剂盒说明书测定血清TNF-α、IL-1β、MCP-1水平。
2.4.4 各组小鼠肾组织病理变化将固定24 h后的各组小鼠肾脏组织取出，梯度酒精脱水，石蜡常规包埋并切片(厚度4 μm)，然后分别用苏木精-伊红(hematoxylin eosin，HE)和Masson染色。光学显微镜观察肾组织病理形态学，Image Pro Plus 6.0软件被用于对Masson染色的肾病理切片胶原沉积量进行半定量分析。
2.4.5 Western blot检测自噬-溶酶体及凋亡相关蛋白取小鼠肾组织约50 mg充分研磨后，加入RIPA裂解液与蛋白酶抑制剂后冰上裂解30 min。然后以10 000 r·min-1，4 ℃离心10 min，吸取上清。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定上清液中的蛋白质量浓度。将吸取的蛋白样品用上样缓冲液稀释后在100 ℃沸水中变性5 min。将适量蛋白样品电泳分离后转至PVDF膜上，封闭洗涤后，分别加入p62(1 ∶750)、LC3B(1 ∶600)、Beclin 1(1 ∶600)、Agt7(1 ∶500)、LAMP1(1 ∶500)、Bcl-2(1 ∶750)、caspase-3(1 ∶750)、Bax(1 ∶750)、β-actin(1 ∶1 000)抗体，4 ℃孵育过夜，洗膜，HRP标记的山羊抗兔IgG二抗孵育1 h，洗膜后置于ECL发光液中显色，使用ImageQuant LAS4000成像系统拍摄，ImageJ软件分析条带灰度值。
2.5 统计学方法数据采用SPSS 26.0软件进行分析，数据以x±s表示。首先对各组数据进行正态性检验，方差齐时采用单因素方差分析，组间比较采用LSD检验；方差不齐时采用秩和检验。
3 结果 3.1 各组小鼠一般情况正常组小鼠活动灵敏，反应迅速，毛色光亮；模型组小鼠出现多饮、多尿、多食，精神萎靡，活动缓慢，反应迟钝，毛色枯槁；恩格列净干预后上述情况有明显改善，反应灵敏，活动量增加，毛色有光泽。
3.2 各组小鼠血糖血脂情况比较如Tab 1所示，与正常组小鼠相比，模型组小鼠FBG、HBA1c、TG、TC均明显升高(P < 0.01)；与模型组小鼠相比，经恩格列净干预后，小鼠FBG、HBA1c、TG、TC均显著降低(P < 0.05，P < 0.01)。
| Group | FBG/mmol·L-1 | HBA1c/mmol·mol-1 | TG/mmol·L-1 | TC/mmol·L-1 |
| Control | 6.41±1.81 | 22.93±2.82 | 1.23±0.18 | 1.47±0.18 |
| Model | 27.18±3.39** | 88.63±10.82** | 3.39±0.54** | 5.43±0.46** |
| Empagliflozin | 12.41±1.12## | 36.52±4.92## | 2.87±0.61# | 3.73±0.21## |
| **P < 0.01 vs Control; #P < 0.05，##P < 0.01 vs Model, the same as below. | ||||
如Tab 2所示，与正常组小鼠相比，模型组小鼠24 h-UTP、BUN、Scr及KIM-1均明显升高(P < 0.01)；与模型组小鼠相比，经恩格列净干预后，小鼠24-UTP、BUN、Scr及KIM-1均明显降低(P < 0.01)。
| Group | BUN/mmol·L-1 | Scr/μmol·L-1 | KIM-1/μg·L-1 | 24 h-UTP/mg |
| Control | 4.96±0.94 | 14.24±1.61 | 2.56±0.12 | 5.82±0.41 |
| Model | 15.21±3.47** | 26.93±3.21** | 8.07±0.28** | 24.24±3.64** |
| Empagliflozin | 9.31±1.09## | 19.74±1.45## | 5.49±0.32## | 13.05±1.19## |
| **P < 0.01 vs Control; ##P < 0.01 vs Model. | ||||
如Tab 3所示，与正常组小鼠相比，模型组小鼠血清IL-1β、TNF-α及MCP-1水平均明显升高(P < 0.01)；与模型组小鼠相比，经恩格列净干预后，小鼠血清IL-1β、TNF-α及MCP-1均明显降低(P < 0.01)。
| Group | IL-1β/ng·L-1 | TNF-α /ng·L-1 | MCP-1/ng·L-1 |
| Control | 22.31±2.97 | 24.16±4.75 | 68.73±6.57 |
| Model | 47.46±3.94** | 44.56±5.16** | 103.47±5.56** |
| Empagliflozin | 30.86±3.86## | 27.89±3.46## | 81.39±3.39## |
| **P < 0.01 vs Control; ##P < 0.01 vs Model. | |||
如Fig 1所示，正常组小鼠肾组织结构正常，未见异常的组织病理学改变；模型组小鼠肾小球基底膜弥漫性增厚，系膜基质及细胞增多，肾小囊腔变窄，部分可见球囊黏连，肾小管空泡变性，间质炎性细胞浸润，部分间质纤维化。恩格列净干预后，小鼠肾组织病理改变均有一定程度减轻。Masson染色显示正常组小鼠肾组织胶原纤维沉积较少，而模型组小鼠肾组织胶原纤维沉积明显增加(P < 0.01)，经恩格列净干预后，DKD小鼠肾组织胶原纤维明显减少(P < 0.01)。
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| Fig 1 Effects of empagliflozin on renal histopathology in DKD mice(×400) A: Pathological morphology of renal tissues in each group of mice. B: The fibrosis area of renal tissues in each group of mice (x±s, n=6). **P < 0.01 vs Control group; ##P < 0.01 vs Model group. |
如Fig 2所示，与正常组小鼠相比，模型组小鼠肾组织p62升高，LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ、Beclin 1、Agt7、LAMP1降低(P < 0.01)；经恩格列净干预后，DKD小鼠肾组织p62降低，LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ、Beclin 1、Agt7、LAMP1升高(P < 0.01)。
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| Fig 2 Effect of empagliflozin on autophagy lysosomal pathway-related proteins in renal tissue of DKD mice(x±s, n=3) A: The expression of autophagy-lysosomal pathway-related proteins in each group mice; B-F: The quantitative analysis of autophagy-lysosomal pathway-related proteins in each group mice.**P < 0.01 vs Control group; ##P < 0.01 vs Model group. |
如Fig 3所示，与正常组小鼠相比，模型组小鼠肾组织caspase-3、Bax升高，Bcl-2降低(P < 0.01)；经恩格列净干预后，DKD小鼠肾组织caspase-3、Bax降低，Bcl-2升高(P < 0.01)。
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| Fig 3 Effect of empagliflozin on apoptosis-related proteins in renal tissue of DKD mice(x±s, n=3) A: The expression of apoptosis-related proteins in each group mice; B-D: The quantitative analysis of apoptosis-related proteins in each group mice.**P < 0.01 vs Control group; ##P < 0.01 vs Model group. |
糖尿病在全球呈快速增长趋势，据2019年国际糖尿病联盟报告全球约有4.63亿糖尿病患者，预计到2045年将增长至7亿，其中有30%~40%的患者会进展为DKD[7]。我国一项2016年的调查研究显示，在住院患者中糖尿病所引起的慢性肾脏病已经超过原发性肾小球肾炎相关的慢性肾脏病，预估目前的患病人数已达2 400万以上，并且已成为我国中老年人终末期肾病的首因[8]。目前，DKD的防治主要包括控制血糖、血压、调脂、抗血小板聚集以及调整生活方式等。虽然血管紧张素受体阻滞剂及血管紧张素转换酶抑制剂是最常用的可有效延缓DKD进展的药物，但因其存在升高血钾、加重肾缺血等不良反应而限制了临床应用。因此，具有肾脏保护作用的新型降糖药物的研发越来越受到广大学者关注。
SGLT2抑制剂恩格列净是近年来新兴的一类口服降糖药物。其能够直接作用于肾脏，通过抑制肾脏近曲小管SGLT2蛋白表达，减少肾小管对葡萄糖的重吸收，增加葡萄糖的排泄，在不增加胰岛素分泌的情况下降低血糖水平。现代研究发现，恩格列净还可通过抑制管球反馈，减轻肾脏高滤过，降低肾小球内压；同时减轻近端肾小管的负担，抗氧化应激，抑制炎症反应，调节自噬，增加促红细胞生成素的产生，改善内皮功能以及轻度生酮等方面减少尿蛋白，延缓DKD的进展[3, 5-6]。本研究发现，应用恩格列净干预后的DKD小鼠血糖、血脂均下降，肾功能改善，尿蛋白排泄降低，同时炎症因子的表达也降低，这与目前研究发现的恩格列净的药理作用相一致。
研究表明，溶酶体功能障碍在多种肾脏疾病发生发展中发挥着重要作用[9]。溶酶体功能受损导致自噬抑制，从而使细胞的各种代谢产物，如受损的细胞器及蛋白质聚集体不能在溶酶体降解、清除和循环，引起各种病理性产物堆积，进而激活炎症因子的表达活化，从而导致肾脏组织学病变，加速肾小球硬化[10]。Liu等[11]发现，在DKD患者和晚期糖基化终产物刺激的足细胞中自噬活性被抑制，同时糖基化终产物触发了足细胞溶酶体膜透化，导致酶活性降低、溶酶体酸化缺陷，溶酶体降解自噬体的能力下降。LAMP1可作为溶酶体标记蛋白之一，主要分布在溶酶体膜和内吞体膜。研究显示LAMP1不仅具有维持溶酶体结构完整性以及溶酶体内pH稳定性的作用，还参与多种细胞内的生理过程，如溶酶体胞吐的调节和自噬囊泡的降解等[12]。此外，Beclin 1、LC3和p62是自噬的关键介质，被广泛用作在正常和病理条件下监测和量化自噬活动的标志物。研究发现由BECN 1基因编码的Beclin 1蛋白，在自噬囊泡形成的起始阶段起中心作用，诱导产生活跃的吞噬囊泡并将自噬相关蛋白定位于吞噬泡[13]。当吞噬泡形成后，Beclin 1结合LC3，LC3前体被半胱氨酸蛋白酶裂解生成LC3-I，LC3-I可与自噬体膜上的磷脂酰乙醇胺共价结合转变为LC3-Ⅱ[14]。自噬底物p62/SQSTM1作为泛素化蛋白，是泛素化蛋白质、细胞器和微生物的受体，可将被清除的物质与底物受体相结合，然后被转运至吞噬泡进而被溶酶体水解酶降解，其表达水平与自噬呈负相关[15]。本研究发现，模型组小鼠肾组织p62蛋白升高，Beclin 1、Agt7蛋白、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值降低，同时LAMP1表达也降低，应用恩格列净干预后，逆转了上述相关蛋白的表达。这表明高糖环境下肾组织自噬-溶酶体通路受阻，自噬底物降解受损，而恩格列净可改善DKD小鼠肾组织溶酶体结构和功能，促进自噬底物降解，从而发挥肾脏保护作用。
此外，细胞自噬与凋亡密切相关。研究表明，抑制自噬相关蛋白Agt 7的表达导致自噬通量受损，引起线粒体受损和活性氧的积累，从而导致细胞凋亡[16]。Bcl-2是调节细胞凋亡的关键蛋白，Bcl-2与Beclin 1结合形成复合物，在内质网应激条件下，Bcl-2磷酸化会导致Bcl-2-Beclin 1复合物解离，从而激活细胞自噬，同时其也可以与Bax/Bad结合形成复合物抑制细胞凋亡，但长时间的内质网应激将导致细胞凋亡途径的激活[17]。caspases作为细胞凋亡过程中的执行者，caspase-3可以与p62的泛素结合域结合，随后p62与LC3相互作用将caspase-3募集到自噬体而降解，从而抑制细胞凋亡[18]。本研究发现，模型组小鼠肾组织caspase-3、Bax升高，Bcl-2降低；经恩格列净干预后，DKD小鼠肾组织caspase-3、Bax降低，Bcl-2升高。这表明恩格列净可改善DKD小鼠肾组织细胞凋亡。
综上所述，恩格列净可通过保护DKD小鼠肾组织细胞溶酶体结构和功能，修复自噬-溶酶体通路，促进自噬底物降解，抑制炎症因子的产生，进而抑制细胞凋亡，降低尿蛋白排泄，改善肾功能，从而减轻肾脏损伤，发挥肾脏保护作用。
( 致谢: 本实验完成于河北省中西医结合肝肾病证研究重点实验室，向全体老师和同学们表示感谢。)
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