2. 湖北科技学院咸宁医学院，糖尿病与心脑血管病变湖北省重点实验室，湖北 咸宁 437100;
3. 广西大学轻工与食品工程学院，广西 南宁 530004
2. Hubei Key Laboratory of Diabetes and Angiopathy, Xianning Medical College, Hubei University of Science and Technology, Xianning Hubei 437100, China;
3. School of Light Industry and Food Engineering, Guangxi University, Nanning 530004, China
2型糖尿病影响全球5亿多人，糖尿病特异性并发症(视网膜病变、肾病和神经病变等)以及心血管疾病风险导致沉重的经济负担[1]。选择2型糖尿病治疗药物时，同时需要考虑药物的心血管获益[2]。多种胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide 1，GLP-1)类似物亦称为GLP-1受体激动剂(艾塞那肽、索马鲁肽、度拉糖肽和利拉鲁肽等)已被批准用于治疗2型糖尿病，临床试验表明，GLP-1类似物可降低心血管事件风险[3-4]。
尽管GLP-1类似物治疗2型糖尿病取得成功，但是，它们分子量大，制备和保存困难，且容易降解，大部分GLP-1类似物需皮下注射等方面因素都限制其临床应用[4]。索马鲁肽口服剂型于2019年获批用于治疗2型糖尿病[3]，然而，口服索马鲁肽生物利用度低，并且出现恶心和呕吐等胃肠道症状的概率高于其他GLP-1类似物。因此，另一种GLP-1受体激动剂即非肽类小分子药物引起研究人员的关注，小分子GLP-1受体激动剂可以口服给药，并可以减少GLP-1类似物的副作用。尽管经过不断地探索，市场上仍然没有靶向GLP-1受体的小分子非肽类药物，目前只有3种化合物(TTP273、LY3502970和PF06882961)进入临床前或临床试验[4-5]。天然化合物一直是最丰富的药物资源，其往往是发现新的更有效、更安全或更具选择性治疗分子的起点[6]。高通量药物筛选是目前最流行的药物发现系统，本研究拟构建HEK293T-GLP-1R-3C-eGFP细胞系，用于高通量筛选天然化合物库中GLP-1受体小分子激动剂。
1 材料与方法 1.1 细胞与试剂大肠杆菌DH5α、人胚肾上皮细胞系HEK293T和表达载体pEGFP-GLP-1R-WT均由实验室保存提供；酵母粉(货号LP0021B)和胰蛋白胨(货号LP0042B)购自Oxoid公司；REPOTMCREB报告基因(货号GM-021030)、荧光素酶报告基因检测试剂盒(货号GM-040501)均购自吉满生物科技有限公司；DMEM高糖培养基(货号C11995500BT)和胎牛血清(货号10099-141)购自Gibco公司；Lipo8000转染试剂(货号C0533)购自上海碧云天生物技术有限公司；cAMP试剂盒(ELISA)(货号SU-B10709)购于睿信生物科技有限公司；G418(货号1150GR001)购于赛国生物科技有限公司；HindⅢ(货号1060S)、BamHI(货号1010S)和BglⅡ(货号1021A)等限制性内切酶、DNA Marker(货号B2232CAA)和T4 DNA连接酶(货号2011A)购于TaKaRa生物技术公司；Taq DNA聚合酶(货号P112-01)购于南京诺唯赞公司；KOD聚合酶(货号216500)购于Toyobo公司；HindⅢ-F、TMD-3C-R、TMD-3C-F、BglⅡ-R、cmv-F和pEGFP-R引物由金斯瑞生物科技股份有限公司合成(Tab 1)；质粒小提试剂盒(货号DP103-03)、质粒中提试剂盒(货号DP108)、基因组DNA提取试剂盒(货号DP302)和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(货号DP214-03)均购自天根生化科技(北京)有限公司；GLP-1(货号89070)购于吉尔生化有限公司；PVDF膜(货号IPVH00010)购于Millipore公司；GFP抗体(货号AE011)，β-actin抗体(货号HRP-60008)和HRP-交联的羊抗兔IgG(H+L)抗体(货号SA00001-2)购于武汉Proteintech公司；胰酶(货号BL501A)、PBS(货号BL302A)、琼脂糖(货号BS081)、HRP-交联的羊抗鼠IgG(H+L)(货号BL001A)和ECL化学发光底物试剂盒(超敏)(货号BL523A)购于兰杰柯科技有限公司；GLP-1R抗体(货号A8547)以及蛋白Marker(货号9623141419)购于武汉爱博泰克生物科技有限公司；其他试剂均为进口或国产分析纯试剂。测序由天一辉远生物科技有限公司完成。
| Gene | Forward primer (5′-3′) |
| HindⅢ-F | GAGCTCAAGCTTATGGCCGGCGCCCCCGGCCCG |
| TMD-3C-R | GGGGCCTTGGAACAGCACCTCGAGCTCGCACTCCGACAA |
| TMD-3C-F | GAGGTGCTGTTCCAAGGCCCCAGCTCCCCGGAGGAGCAG |
| BglⅡ-R | GGCGATAGATCTGCTGCAGGAGGCCTGGCA |
| cmv-F | CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG |
| pEGFP-R | CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG |
利用融合PCR技术将3C酶切位点引入原始质粒pEGFP-GLP-1R-WT中，获得pEGFP-GLP-1R-3C扩增片段, 构建流程如Fig 1所示。
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| Fig 1 Construction of pEGFP-GLP-1R-3C plasmid GLP-1 receptor (GLP-1R), extracellular domain (ECD), transmembrane domain (TMD) |
以pEGFP-GLP-1R-WT(10 mg·L-1)质粒为模板，进行PCR 1和PCR 2。PCR 1扩增50 μL反应体系：H2O 20 μL，2×Taq Mix 25 μL，HindⅢ-F(10 μmol·L-1)和TMD-3C-R(10 μmol·L-1)各2 μL，模板DNA 1 μL。PCR 2扩增50 μL反应体系：H2O 32 μL，10×KOD Buffer 5 μL，KOD酶1 μL，dNTP(2 mmol·L-1) 5 μL，MgSO4 3 μL，BglⅡ-R(10 μmol·L-1)和TMD-3C-F(10 μmol·L-1)各1.5 μL，模板DNA 1 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，50 ℃/55 ℃/60 ℃/65 ℃退火30 s，72℃延伸(PCR 1为40 s、PCR 2为1 min)，共30个循环。72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。对PCR 1和PCR 2产物进行琼脂糖凝胶电泳，按琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书进行柱回收。
以PCR 1和PCR 2产物为模板，融合PCR扩增目的基因。PCR 3扩增50 μL反应体系：H2O 30 μL，10×KOD Buffer 5 μL，KOD酶1 μL，dNTP(2 mmol·L-1)5 μL，MgSO4 3 μL，HindⅢ-F(10 μmol·L-1)和BglⅡ-R(10 μmol·L-1)各2 μL，PCR 1和PCR 2产物各1 μL。PCR 3反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，共30个循环。72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。对PCR 3产物进行琼脂糖凝胶电泳，按琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书进行柱回收。
1.2.2 载体和GLP-1R-3C的双酶切与回收在HindⅢ与BamHI酶切位点对原始质粒pEGFP-GLP-1R-WT进行切割，获得pEGFP-GLP-1R载体。在HindⅢ与BglⅡ酶切位点对目的片段GLP-1R-3C进行切割。对酶切片段进行柱回收，pEGFP-GLP-1R载体与GLP-1R-3C按照摩尔比1 ∶ 3混合，16 ℃连接4 h。经转化、涂板、挑单菌落和扩大培养。菌落PCR进行鉴定，PCR 4扩增体系：H2O 3 μL，2×Taq Mix 5 μL，pEGFP-R(10 μmol·L-1)和cmv-F(10 μmol·L-1)各0.5 μL，菌落悬液1 μL，PCR 4反应条件同PCR 3。并送公司测序，将测序正确的质粒简称为pEGFP-GLP-1R-3C。
1.3 细胞培养、转染和稳转细胞株构建及其验证HEK293T在10%血清的DMEM中培养，并置于37 ℃含5% CO2培养箱中培养。参考转染试剂说明书，将质粒pEGFP-GLP-1R-3C转染至HEK293T细胞。利用G418筛选，稳定培养2周后，用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)是否表达；使用流式细胞仪分选出含有GFP的细胞，并扩大培养；将富集的转染细胞进行二次分选，分选到4个96孔板中，每孔中含1个单细胞，培养24~48 h，显微镜下观察，待细胞长成单克隆后，将其逐级扩大培养；选择荧光较强的细胞继续扩大培养，并冻存。采用Western blot和激光共聚焦技术检测GLP-1R-3C-eGFP蛋白的表达情况。所构建的细胞系命名为HEK293T-GLP-1R-3C-eGFP细胞系。
1.4 Western blot使用流式细胞仪两次分选得到的10个单克隆细胞株制成样品，95 ℃变性10 min。进行凝胶电泳、转膜、清洗和5%脱脂牛奶室温封闭1 h。分别孵育GFP(1 ∶ 2 000)和GLP-1R(1 ∶ 2 000)一抗，4 ℃过夜。1×TBST清洗后孵育二抗(1 ∶ 10 000)，室温孵育1 h。1×TBST清洗后，显影。
1.5 基因组PCR参照基因组DNA提取试剂盒说明书，提取DNA。PCR 5扩增体系：H2O 3 μL，2×Taq Mix 5 μL，pEGFP-R(10 μmol·L-1)和cmv-F(10 μmol·L-1)各0.5 μL，模板1 μL，PCR 5反应条件同PCR 3。
1.6 激光共聚焦拍摄选取高表达GLP-1R-3C-eGFP的单克隆细胞株，将其在激光共聚焦培养皿中培养。4%多聚甲醛固定后，PBS清洗，DAPI染核，PBS清洗后，滴上抗荧光淬灭封片剂，使用激光共聚焦显微镜观察GLP-1R-3C-eGFP表达的位置。
1.7 荧光素酶报告分析将REPOTMCREB报告基因转染HEK293T-GLP-1R-3C-eGFP细胞，不同浓度GLP-1(200、400和600 nmol·L-1)处理4 h，0.5% DMSO作为溶剂对照组。参照荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书，加入细胞裂解液，充分裂解后，4 ℃ 12 000 r·min-1离心10 min。取上清，加入等体积萤火虫荧光素酶检测试剂，酶标仪读取发光值。为验证荧光素酶报告基因检测方法的准确性，使用ELISA方法检测同一批细胞的cAMP含量。
为评估本方法高通量筛选的精确度和稳定性，将REPOTMCREB报告基因转染HEK293T-GLP-1R-3C-eGFP细胞，30个孔加入200 nmol·L-1 GLP-1作为实验组，另外30个孔加入0.5% DMSO溶剂作为对照组，采取荧光素酶报告基因检测方法检测发光值。Z′因子是高通量筛选中常用来评价分析性能的主要统计参数之一：
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σs和σc分别为实验组和对照组的标准差，μs和μc分别为实验组和对照组的平均值。如果筛选实验的Z′=1，则说明检测方法是一种理想的方法。如果1 > Z′ ≥0.5，则认为该检测方法比较理想，可以接受[7-9]。
1.8 统计学方法实验数据以x±s表示，使用GraphPad Prism 5软件作图和分析，两组间比较采用t检验，多组间行One-Way ANOVA。
2 结果 2.1 pEGFP-GLP-1R-3C表达载体的构建pEGFP-GLP-1R-3C表达载体包括GLP-1R的胞外域、跨膜域和胞内域，3C酶切位点(位于GLP-1R的胞外域和跨膜域之间) 与GFP以及抗性筛选标签。不同温度梯度(50 ℃/55 ℃/60 ℃/65 ℃)对目的片段进行扩增，在不同温度下PCR 1与PCR 2产物大小均正确，分别为350 bp与1 000 bp(Fig 2A)。融合PCR 3扩增目的片段pEGFP-GLP-1R-3C，结果显示目的产物大小正确，>1 000 bp(Fig 2B)。PCR 4显示编号1、2、10、12、14和20菌落悬液PCR产物大小正确，>1 000 bp(Fig 2C)。重组质粒pEGFP-GLP-1R-3C经进一步测序，其序列正确。
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| Fig 2 Electrophoretic analysis of PCR products A: Electrophoretic analysis of PCR 1 and PCR 2 products. B: Electrophoretic analysis of fusion PCR 3 products. C: Electrophoretic analysis of colony PCR 4 products. |
经G418及流式细胞术双重筛选后的单克隆HEK293T-GLP-1R-3C-eGFP细胞株GFP荧光阳性率达100%，且经过超过十代培养之后未发现荧光丢失(Fig 3A)。Western blot实验表明，编号为2、6、9和10的稳转细胞GFP和GLP-1R蛋白表达量高，未转染质粒pEGFP-GLP-1R-3C的细胞(NC)中无GFP和GLP-1R蛋白表达(Fig 3B)。提取编号为2、6和10细胞的基因组进行PCR鉴定，结果表明质粒pEGFP-GLP-1R-3C已整合到细胞基因组(Fig 3C)。同时，激光共聚焦显微镜显示蛋白GLP-1R-3C-eGFP主要分布在细胞膜上(Fig 3D)，再次提示HEK293T-GLP-1R-3C-eGFP细胞株构建成功。
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| Fig 3 Construction and confirmation of stable HEK293T-GLP-1R-3C-eGFP cell line A: The stable cell line at the 10th generation passage was examined under a fluorescence microscope. The pictures on left lane represented the original black-white pictures. B: The protein level of GFP and GLP-1R was confirmed by Western blotting. There was no GFP and GLP-1R protein detected in control HEK293T cell (NC). The No 2, 6, 9 and 10 stable HEK293T-GLP-1R-3C-eGFP cells showed high level expression of GFP and GLP-1R protein. C: Electrophoretic analysis of genome PCR products of the stable HEK293T-GLP-1R-3C-eGFP cell line and NC. There was no GLP-1R-3C-eGFP DNA detected in NC. The No 2, 6 and 10 stable HEK293T-GLP-1R-3C-eGFP cells showed high level expression of GLP-1R-3C-eGFP DNA. D: The protein level of GLP-1R-3C-eGFP was confirmed by laser confocal microscopy. The GLP-1R-3C-eGFP protein was distributed on the cell membrane. |
荧光素酶报告基因法检测发光值(Fig 4A)与ELISA方法检测胞内cAMP含量(Fig 4B)，二者趋势类似。
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| Fig 4 Dose-response of GLP-1-stimulated luminescence values and cAMP accumulation in HEK293T-GLP-1R-3C-eGFP cells (n=3~6) After stimulation with different concentrations of GLP-1 peptide (200, 400 and 600 nmol·L-1), 0.5% DMSO as solvent control group. A: Luminescence value was detected by One-Step Luciferase Reporter Gene Assay Kit. B: Dose-response of GLP-1-stimulated cAMP accumulation in HEK293T-GLP-1R-3C-eGFP cells was verified using the cAMP kit (ELISA). **P < 0.01 vs 0.5% DMSO group. |
通过对数据计算，Z′=0.52，说明该方法为一种高通量筛选的稳定方法。
3 讨论GLP-1受体在葡萄糖代谢和糖尿病治疗中起关键作用，对肽类和非肽类GLP-1受体激动剂均有反应[10]。GLP-1受体是一种含463个氨基酸的7次跨膜蛋白，由胞外域、跨膜域和胞内域组成，其在胰腺β细胞、几种胰外器官/组织(如十二指肠和神经垂体)，以及某些神经内分泌肿瘤(胰岛素瘤)中表达。PF-06882961(UK4)、LY3502970(OWL-833或V6G)、TT-OAD2和UK1非肽类GLP-1受体激动剂与GLP-1受体跨膜螺旋的中上层区域结合，而不是直接延伸到Arg190周围的下部区域[11-12]。因此，本研究尝试在GLP-1受体的胞外域与跨膜域之间引入3C蛋白酶切位点，探索是否能通过3C蛋白酶除去胞外域，单独表达跨膜域，由此来筛选仅与跨膜域结合的小分子GLP-1受体激动剂。基于GFP细胞模型的高通量筛选系统可用于从天然药物中筛选GLP-1R配体或调节剂[13-14]。因此，本研究构建pEGFP-GLP-1R-3C表达载体，并转染至HEK293T细胞。Western blot结果表明，GLP-1R-3C-eGFP融合蛋白在单克隆细胞株中高度表达。同时，激光共聚焦显微镜显示GLP-1R-3C-eGFP主要分布在细胞膜上，再次提示HEK293T-GLP-1R-3C-eGFP细胞株构建成功。
在GLP-1激动剂刺激下，GLP-1受体被激活，并与Gs的α-亚基偶联，GTP-α-Gs亚基继续激活腺苷酸环化酶，并使细胞内cAMP水平增多，最终通过cAMP响应元件等多种响应元素诱导基因转录[9, 13]。目前，在G蛋白偶联受体筛选程序中采用的方法主要是通过确定第二信使(如cAMP、三磷酸肌醇和细胞内Ca2+转移)的变化来检测G蛋白信号，这通常需要建立不同的分析平台，并需要专门仪器，成本较高[9]。其他检测或筛选GLP-1类似物生物活性的方法包括AlphaScreen技术或R&D试剂盒法，这些方法价格昂贵，稳定性差，周期长[13]。荧光素酶报告基因分析被广泛用于与cAMP或Ca2+信号相关的G蛋白偶联受体的高通量筛选，检测报告基因的表达水平用于显示配体激活受体的活性。荧光素酶报告基因方法灵敏度高、特异性强、检测速度快，且不需要昂贵的设备[15]。魏玉林教授[13]团队建立GFP荧光标记GLP-1受体细胞系，并用于高通量筛选天然药物的粗提物，黎思彤等[16]建立以GLP-1受体为靶点的药物筛选模型。高华山等[17]利用报告基因系统构建了靶向GLP-1受体激动剂的细胞筛选模型。罗志英等[18]也采用荧光素酶报告基因方法建立GLP-1融合蛋白生物学活性检测方法。因此，本研究中将REPOTMCREB报告基因转染至HEK293T-GLP-1R-3C-eGFP细胞中，不同浓度GLP-1(200、400和600 nmol·L-1)处理4 h后，荧光素酶报告基因法检测结果(Fig 4A)与ELISA方法检测胞内cAMP含量可得到相似的趋势，ELISA方法进一步验证该方法的可行性。Z′>0.5，说明该方法为一种高通量筛选的稳定方法。
GLP-1(7-37)或GLP-1(7-36)是一种含有31或30个氨基酸的肠促胰岛素激素，其可增强葡萄糖诱导胰岛素的表达和分泌，减少胰高血糖素分泌，抑制β细胞凋亡，促进β细胞新生，并引发其他胰外生理效应[11]。GLP-1由肠道L细胞分泌，GLP-1只在高血糖的情况下促进胰岛素的释放，因此无低血糖风险。目前多数GLP-1受体激动剂是肽类注射制剂，仅有的索马鲁肽口服剂型生物利用度低，并且经常出现恶心和呕吐等胃肠道症状，寻找适合口服的小分子非肽类激动剂从未停止过。本研究构建了HEK293T-GLP-1R-3C-eGFP细胞系，可用于小分子GLP-1受体激动剂的筛选，后期将筛选出的小分子与GLP-1受体跨膜域共结晶，进一步解析结构，为2型糖尿病小分子口服药的开发提供思路。
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