2. 贵州中医药大学微生物教研室，贵州 贵阳 550025;
3. 贵州中医药大学药理教研室，贵州 贵阳 550025
2. Dept of Microbiology, Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550025, China;
3. Dept of Pharmacology, Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550025, China
胃肠黏膜不仅影响消化吸收功能，且可形成天然功能屏障对机体起保护作用，非甾体类抗炎药及应激等因素均可对胃肠黏膜造成损伤而引起黏膜屏障功能障碍。中医认为，脾虚证是胃肠病变的常见证型之一，脾虚证患者可见胃黏膜及肠黏膜损伤。多胺，主要包括腐胺(putrescine，PUT)、精脒及精胺，存在于肠道上皮中并参与其生理及病理过程，多胺可作用于RNA结合蛋白和非编码RNA，改变编码生长相关蛋白的mRNA稳定性，及其翻译，在转录及转录后水平调控肠上皮增殖、迁移、凋亡等过程[1-2]。有研究表明，多胺通过改变HuR蛋白在细胞浆及细胞核中的分布，减少HuR与ATF-2、JunD等生长抑制基因mRNA的相互作用，从而下调靶基因蛋白的表达而促进肠上皮细胞增殖[3-5]。
四君子汤源自宋代《太平惠民和剂局方》，方中人参为君，臣以白术，佐以茯苓，甘草调和，其益气健脾功效显著，常作为基础方应用于脾虚证相关疾病治疗，如胃溃疡，肠易激综合征及溃疡性结肠炎等[6]，该方对吲哚美辛诱发的肠黏膜损伤具有防治作用[7-8]。课题组前期研究结果表明，四君子汤可通过促进IEC-6细胞迁移及增殖等而促进肠黏膜修复，其机制与激活多胺信号通路有关[9-10]，但对增殖过程的调控机制尚未明确。本研究通过观察四君子汤含药血清(Sijunzi decoction-containing serum，SJZD)对HuR在细胞浆及细胞核分布情况，生长相关基因蛋白ATF-2、JunD及CDK4表达以及细胞周期分布的影响，基于多胺及HuR探讨其促进细胞增殖的作用机制，为其胃肠黏膜损伤修复作用研究提供参考。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞大鼠小肠隐窝上皮细胞(rat small intestinal epithelial cells，IEC-6)购自上海中乔新舟生物科技有限公司。
1.1.2 实验动物健康SD大鼠16只，♀♂各半，体质量200 g左右，合格证号：430726200100385135，购于长沙市天勤生物技术有限公司，饲养于避光通风环境，室温25 ℃左右，相对湿度50%左右，适应性喂养1周后进行含药血清制备实验，符合贵州中医药大学实验动物福利与伦理委员会相关规范。
1.1.3 药品与试剂四君子汤：人参(19040187)、茯苓(20062405)、炒白术(20062704)、炙甘草(20052303)，购自北京同仁堂(贵阳分店)；青霉素/链霉素溶液(MAO110-Mar-04G)，RIPA裂解液(MAO151-Feb-06G)，PAGE凝胶制备试剂盒(MAO387-Apr-22G)，ECL发光液(MAO186-Feb-06G)，meilunbio；胎牛血清(SA112.02)高糖DMEM(20200720)，胰酶(20191030)，Cellmax；PUT(D13208-25G，Sigma)；α-二氟甲基鸟氨酸(DFMO，3305986，Calbiochem)；牛血清蛋白(420E052)，抗荧光衰减封片剂(20210427)，核糖核酸酶RNaseA(R8021)，蛋白浓度测定试剂盒(PC0020)，DAPI溶液(C0065)，Triton X-100，4%多聚甲醛，Solarbio；碘化丙啶PI染液(G1021，Servicebio)；PMSF(ST506)，蛋白上样缓冲液(P0285)，Beyotime；兔抗ATF-2抗体(35031S)，兔抗HuR抗体(12582S)，兔抗Lamin B1(13435S)，CST；兔抗CDK4抗体(ab199728)，兔抗JunD抗体(ab181615)，兔抗β-actin抗体(ab179467)，山羊抗兔IgG二体(ab6721)，山羊抗兔IgG荧光二抗(ab150077)，Abcam；RNA提取试剂盒(9767，Takara)；逆转录试剂盒(#20AI01)，PCR荧光染料(#20BB05)，Genstar。
1.1.4 主要仪器细胞培养箱，微量分光光度计(Thermo Scientific)；荧光显微镜(Leica)；流式细胞仪(Beckman)；梯度PCR仪(杭州博日科技)；凝胶成像仪，电泳仪，荧光PCR仪(Bio-Rad)。
1.2 方法 1.2.1 含药血清制备参照前期文献[10]制备SJZD，取等份炒白术、人参、茯苓及炙甘草，水煎煮提取后浓缩得四君子汤水提液(浓度1 kg生药量·L-1)。大鼠随机分为2组，分别进行生理盐水及四君子汤水提液(13 g生药·kg-1·d-1)灌胃，给药4 d，末次给药2 h后采集动脉血，血凝后离心取上清，56 ℃灭活，得空白血清及SJZD，低温保存备用。临给药前以DMEM培养基(含0.5%胎牛血清)分别配制20%空白血清培养基及5%、10%、20%SJZD培养基，空白血清将各给药组血清总含量补足至20%，上述百分数均为体积分数。
1.2.2 细胞培养、分组及给药[10-11]2.5 mL细胞悬液(8×107L-1)接种于6孔板，培养液含5%胎牛血清，培养24 h后换成无血清培养液，血清饥饿24 h后分组给药。无负荷实验设空白组，PUT组及SJZD低、中、高(SJZD-L、SJZD-M、SJZD-H)剂量组，分别给予20%空白血清培养基，10 μmol·L-1 PUT及SJZD(5%、10%及20%)培养基；DFMO负荷实验在上述组别基础上加设模型(2.5 mmol·L-1 DFMO)组；其中PUT及DFMO均以20%空白血清培养基进行配制，给药48 h后进行后续实验。
1.2.3 免疫荧光分析胞浆及胞核HuR表达1 mL细胞悬液(2×107L-1)接种于24孔板(含细胞爬片)，按“1.2.2”项同法培养后分组给药，给药48 h后，弃培养液，以下每一步结束后均用PBS洗3次，4%多聚甲醛固定细胞15 min；1% Triton X-100透化细胞10 min；1%的BSA封闭1 h；HuR抗体(1 ∶ 250)4 ℃孵育过夜；荧光二抗(1 ∶ 500)避光孵育1 h；DAPI溶液染核10 min；封片后置于荧光显微镜上拍照，分析HuR在细胞浆及细胞核中分布情况。
1.2.4 RT-PCR检测相关mRNA表达细胞给药48 h后，吸附柱法提取纯化细胞总RNA，纯度测定后按说明书合成cDNA，以其为模板，采用SYBR Green方法进行RT-PCR反应，同时以β-actin为内参进行扩增，2-ΔΔCT法分析mRNA表达水平。β-actin引物：上游5′-CGTGAAAAGATGACCCAGATCA-3′，下游5′-CCAGCCTGGATGGCTACGT-3′；ATF-2引物：上游5′-CAGTCAGAAGAGTCTCGTCCACA-3′，下游5′-GAAGCTGCTGCTCTATTTCGTTC-3′；JunD引物：上游5′-GCGAACCAAGGATTACGGAA-3′，下游5′-TCTTTTTGTTTGGTTTTGTTTTGC-3′；CDK4引物：上游5′-GCCTGGCCAGAATCTACAGCTAC-3′，下游5′-GGTCGGCTTCAGAGTTTCCAC-3′。
1.2.5 Western blot法检测相关蛋白表达给药48 h后收集细胞，以RIPA裂解液提取总蛋白，以核蛋白提取试剂盒提取胞浆蛋白及核蛋白，BCA法测浓度，制备电泳样品，依次进行凝胶电泳分离样品，转膜，脱脂奶粉(5%)封闭；分别以β-actin抗体、ATF-2抗体、JunD抗体、HuR抗体(稀释比例均为1 ∶ 1 000)以及CDK4抗体(1 ∶ 2 000)4 ℃孵育过夜，洗膜3次；二抗(1 ∶ 5 000)孵育1 h，洗膜3次；发光液显色后凝胶成像，核蛋白内参为Lamin B1，其余蛋白内参为β-actin，成像仪自带软件分析蛋白水平。
1.2.6 流式细胞仪检测细胞周期细胞给药48 h后，胰酶消化并离心收集细胞；75%乙醇固定，4 ℃过夜；离心沉淀细胞，PBS洗涤，2 μL RNaseA(10 g·L-1)37 ℃水浴30 min；100 μL PI染色液(100 mg·L-1)避光孵育10 min；流式细胞仪检测，Modfit软件分析细胞周期。
1.2.7 统计学方法采用SPSS 22.0软件进行统计分析，实验数据以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐，LDS法组间比较，方差不齐，Dunnett法组间比较。
2 结果 2.1 SJZD对细胞HuR蛋白在胞浆及胞核分布的影响Fig 1结果显示，与空白组比较，DFMO模型组胞核HuR蛋白水平下降，胞浆HuR蛋白水平上升(P < 0.01)，SJZD-M、SJZD-H及PUT组胞核及胞浆HuR蛋白水平无明显差异(P>0.05)，SJZD-L组胞浆HuR蛋白水平无明显差异(P>0.05)；与模型组比较，SJZD-L、SJZD-M、SJZD-H及PUT组胞浆HuR蛋白水平下降，胞核HuR蛋白水平升高(P < 0.01)，各组HuR总蛋白表达无明显差异。Fig 2结果显示，与空白组比较，DFMO模型组胞浆HuR蛋白表达明显的细胞比例上升(P < 0.01)，而SJZD-M及PUT组无明显差异(P>0.05)；与模型组比较，SJZD-M及PUT组胞浆HuR蛋白表达明显的细胞比例下降(P < 0.01)。结果提示PUT及SJZD可调控HuR蛋白在细胞胞浆及胞核中的分布，降低胞浆内HuR蛋白水平，提高核内HuR蛋白水平。
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| Fig 1 Effects of SJZD on expression of HuR protein in cytoplasm and nucleus of IEC-6 cells under DFMO loading (x±s, n=3) 1:Control; 2:DFMO; 3:PUT+DFMO; 4:SJZD-L+DFMO; 5:SJZD-M+DFMO; 6:SJZD-H+DFMO. #P < 0.05, ##P < 0.01 vs Control; *P < 0.05, **P < 0.01 vs DFMO |
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| Fig 2 Effects of SJZD on HuR protein distribution in IEC-6 cytoplasm and nucleus under DFMO loading (x±s, n=6) 1:Control; 2:DFMO; 3:PUT+DFMO; 4:SJZD-M+DFMO.##P < 0.01 vs Control; **P < 0.01 vs DFMO |
Fig 3结果显示，与空白组比较，SJZD-L、SJZD-M、SJZD-H及PUT组细胞ATF-2及JunD mRNA表达明显下调(P < 0.01)，SJZD-M、SJZD-H及PUT组细胞CDK4 mRNA表达明显上调(P < 0.05，P < 0.01)。Fig 4结果显示，与空白组比较，DFMO模型组细胞ATF-2及JunD mRNA水平明显上升且CDK4 mRNA水平明显降低(P < 0.05，P < 0.01)；与模型组比较，SJZD-L、SJZD-M、SJZD-H及PUT组细胞ATF-2及JunD mRNA表达明显降低(P < 0.05，P < 0.01)，SJZD-M、SJZD-H及PUT组细胞CDK4 mRNA表达明显升高(P < 0.05，P < 0.01)。结果提示，PUT及SJZD可下调ATF-2、JunD mRNA表达和上调CDK4 mRNA表达，且可拮抗DFMO的作用。
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| Fig 3 Effect of SJZD on expression of ATF-2, JunD and CDK4 mRNA in IEC-6 (x±s, n=3) 1:Control; 2:PUT; 3:SJZD-L; 4:SJZD-M; 5:SJZD-H. #P < 0.05, ##P < 0.01 vs Control |
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| Fig 4 Effect of SJZD on expression of ATF-2, JunD and CDK4 mRNA in IEC-6 under DFMO loading (x±s, n=3) 1:Control; 2:DFMO; 3:PUT+DFMO; 4:SJZD-L+DFMO; 5:SJZD-M+DFMO; 6:SJZD-H+DFMO. #P < 0.05, ##P < 0.01 vs Control; *P < 0.05, **P < 0.01 vs DFMO |
Fig 5结果显示，与空白组比较，SJZD-L、SJZD-M、SJZD-H及PUT组细胞ATF-2蛋白表达明显减少(P < 0.01)；SJZD-M、SJZD-H及PUT组细胞JunD蛋白表达明显下降且CDK4蛋白表达明显增加(P < 0.05，P < 0.01)。Fig 6结果显示，与空白组比较，DFMO模型组细胞ATF-2及JunD蛋白表达明显上升且CDK4蛋白表达明显下降(P < 0.01)；与模型组比较，SJZD-M、SJZD-H及PUT组细胞ATF-2蛋白水平明显降低且CDK4蛋白水平明显升高(P < 0.05，P < 0.01)，SJZD-L、SJZD-M、SJZD-H及PUT组细胞JunD蛋白水平明显下降(P < 0.01)。结果提示PUT及SJZD可降低ATF-2及JunD蛋白表达和升高CDK4蛋白表达，且可拮抗DFMO的作用。
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| Fig 5 Effect of SJZD on expression of ATF-2, JunD and CDK4 protein in IEC-6 (x±s, n=3) 1:Control; 2:PUT; 3:SJZD-L; 4:SJZD-M; 5:SJZD-H. #P < 0.05, ##P < 0.01 vs Control |
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| Fig 6 Effect of SJZD on expression of ATF-2, JunD and CDK4 protein in IEC-6 under DFMO loading (x±s, n=3) 1:Control; 2:PUT+DFMO; 3:SJZD-L+DFMO; 4:SJZD-M+DFMO; 5:SJZD-H+DFMO; 6:DFMO. ##P < 0.01 vs Control; *P < 0.05, **P < 0.01 vs DFMO |
Fig 7结果显示，与空白组比较，SJZD-L、SJZD-M、SJZD-H及PUT组G0/G1期细胞占比明显减少且S期细胞占比明显增多(P < 0.01)；各组G2/M期细胞占比无明显差异。Fig 8结果显示，与空白组比较，DFMO模型组G0/G1期细胞占比明显增加，S期及G2/M期细胞占比明显减少(P < 0.01)；与模型组比较，SJZD-M、SJZD-H及PUT组G0/G1期细胞占比明显下降(P < 0.01)，SJZD-L、SJZD-M、SJZD-H及PUT组S期细胞占比明显上升(P < 0.05，P < 0.01)，PUT组G2/M期细胞占比明显升高(P < 0.05)，SJZD组G2/M期细胞占比无明显差异。结果提示PUT及SJZD可影响细胞周期进程，主要表现为减少细胞周期中G0/G1期细胞占比，提高S期细胞占比，且对DFMO有一定拮抗作用。
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| Fig 7 Effect of SJZD on IEC-6 cell cycle distribution (x±s, n=3) 1:Control; 2:PUT; 3:SJZD-L; 4:SJZD-M; 5:SJZD-H. ##P < 0.01 vs Control |
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| Fig 8 Effect of SJZD on IEC-6 cell cycle distribution under DFMO loading (x±s, n=3) 1:Control; 2:DFMO; 3:PUT+DFMO; 4:SJZD-L+DFMO; 5:SJZD-M+DFMO; 6:SJZD-H+DFMO. ##P < 0.01 vs Control; *P < 0.05, **P < 0.01 vs DFMO |
四君子汤是临床常用经方，主要应用于脾虚证相关疾病，近年来其作用机制及物质基础研究均有了一定进展。除了消化系统疾病，学者们还探讨了该方对免疫系统、神经系统及肠道菌群等方面的影响[12-13]。已有研究表明，四君子汤可通过促进IEC-6细胞迁移而修复肠黏膜损伤，调节细胞连接而保护肠黏膜，其机制与影响多胺及Ca2+调控有关，多糖为其有效组分之一[11, 14-15]。本课题组前期研究发现，SJZD-L、SJZD-M、SJZD-H可促进IEC-6细胞增殖，提高IEC-6细胞内PUT及精脒的含量，同时可拮抗DFMO(多胺合成抑制剂)对细胞增殖的抑制作用以及DFMO所引起的PUT及精脒含量降低；四君子汤促进IEC-6细胞增殖的作用机制与激活多胺信号通路而下调生长抑制基因核仁磷酸蛋白，p53表达及上调生长促进基因c-Myc，细胞周期检测点激酶2的表达有关[10, 16]。HuR是一种RNA结合蛋白，在小肠上皮细胞增殖过程中，多胺可通过影响HuR在胞浆及胞核的分布，促使HuR向细胞浆移位，调节其与靶基因的结合，从而影响靶基因mRNA的稳定性及其蛋白表达，最终促进细胞增殖[4, 17]。本研究在前期研究基础上，通过观察SJZD对HuR蛋白的作用，进一步探讨其对IEC-6细胞增殖的调控机制。结果发现，DFMO可促使HuR蛋白从细胞核移位至细胞浆，提高胞浆HuR蛋白表达明显的细胞比例，SJZD-M及PUT可拮抗DFMO对HuR蛋白分布的影响，降低胞浆HuR蛋白表达明显的细胞比例；DFMO、PUT及SJZD等不影响HuR总蛋白表达水平。结果表明，SJZD可通过影响多胺，调控HuR蛋白在细胞胞浆及胞核中的分布，该作用与外源性PUT相似。
多胺对编码生长相关蛋白的各类基因有调控作用，有研究发现，多胺合成减少可诱导ATF-2及JunD表达，增加ATF-2/JunD异二聚体的形成，从而降低CDK4 mRNA及蛋白表达而抑制肠上皮细胞增殖；若沉默ATF-2基因，不仅能拮抗多胺耗竭对CDK4表达的抑制作用，同时也能消除由过表达JunD所引起的CDK4表达抑制，ATF-2基因沉默还能促进多胺耗竭IEC-6细胞增殖[3, 18]，ATF-2及JunD对IEC-6细胞增殖有负调控作用。另有研究表明，多胺合成减少可增加HuR与ATF-2及JunD mRNA的相互作用，提高ATF-2及JunD mRNA稳定性而使其mRNA及蛋白表达升高[4-5]。为此，本研究进一步观察SJZD对ATF-2及JunD表达的调控作用，结果发现，SJZD不仅下调正常细胞ATF-2、JunD mRNA和蛋白表达，同时还对DFMO诱导的ATF-2、JunD mRNA和蛋白表达有拮抗作用。结果表明，SJZD可通过作用于多胺/HuR信号通路，负调控生长抑制相关基因ATF-2及JunD表达，从而促进IEC-6细胞增殖。
CDK4作为细胞周期重要调控激酶之一，是细胞周期中G1期向S期转变的关键。多胺耗竭可诱导IEC-6细胞ATF-2/JunD复合物形成而抑制CDK4表达[3, 18]。为探讨SJZD对生长抑制基因ATF-2，JunD下游靶点的调控机制，本研究还观察SJZD对IEC-6细胞CDK4表达及细胞周期的影响，结果发现，SJZD可提高正常细胞CDK4 mRNA和蛋白表达，影响细胞周期分布，主要表现在G0/G1期细胞占比下降，S期(DNA合成期)细胞占比上升，G2/M期细胞占比无明显差异；DFMO抑制多胺合成后，CDK4 mRNA和蛋白表达降低，G0/G1期细胞占比增加而S期细胞占比减少，主要表现出对细胞增殖的阻滞作用；SJZD对DFMO所引起CDK4表达降低及细胞周期分布改变均有逆转作用。结合前期研究结果表明，四君子汤可通过多胺上调CDK4表达，促使细胞G1期向S期转变而促进IEC-6细胞增殖。
综上所述，SJZD可影响HuR在IEC-6细胞中的分布，减少细胞核HuR蛋白向细胞浆移位，下调多胺通路生长抑制基因ATF-2，JunD mRNA和蛋白表达，因而提高其下游靶点CDK4 mRNA和蛋白表达，最终影响细胞周期进程而促进IEC-6细胞增殖。结合前期SIZD对细胞内多胺，NPM和p53调控作用的研究结果，表明SJZD可通过作用多胺/HuR信号通路，调控生长抑制基因ATF-2、JunD、NPM及p53等表达，影响细胞周期进程而促进IEC-6细胞增殖。本研究为四君子汤调控肠黏膜损伤修复机制研究提供了参考，然而，四君子汤是否通过影响HuR与生长抑制基因相互作用，在转录后水平下调生长抑制基因的表达，有待进一步探讨。另外，复方药效物质基础研究较为复杂，SJZD中促进肠上皮细胞增殖有效成分尚待探讨。
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