DN是在糖尿病患者中最常见且最严重的微血管并发症，相比于其他原因引起的肾脏病变更易发展为终末期肾病。DN的发病机制复杂且有待挖掘，目前普遍认为，DN受代谢、血流动力学、炎症和遗传等多方面因素共同影响。当前临床治疗DN多以先控制血糖、血压，后保护肾功能为主，但并不能完全阻止其进展。许多研究表明，中药具有多成分、多靶点的特点，在DN的辅助治疗中具有重要作用[1-2]。
玉米须为禾本科植物玉米(Zea mays L.)的花柱和柱头，具有利尿消肿、利湿退黄的功效[3]，在临床上主要应用于糖尿病、高血压、肾炎等疾病的治疗。现代研究表明，玉米须的主要活性成分为多糖、黄酮和皂苷等。课题组前期对玉米须降糖、降脂作用及相关代谢通路进行了研究[4-7]，而糖脂代谢异常是诱导DN早期发病的重要因素。因此，玉米须可能通过调节糖脂代谢恢复正常保护肾组织。有研究发现，玉米须水提物能够减轻DN大鼠肾脏的损害[8]，但是相关代谢通路的研究尚未见报道。本实验运用代谢组学技术，研究玉米须对DN大鼠的肾组织和尿液内源性代谢物的影响，探讨玉米须干预DN的代谢通路和作用机制。
1 材料 1.1 药物与试剂玉米须采于黑龙江省农业科学院齐齐哈尔分院，经黑龙江省中医药科学院王伟明研究员鉴定为玉米须(Stigma maydis L.)；玉米须水煎液提取方法：取10 kg玉米须，加入20倍水煎煮2次，每次2 h，合并两次提取液，过滤后浓缩到0.54 kg·L-1，待用时，用蒸馏水配成相应的浓度。盐酸二甲双胍片(批号：ABW1966)购自中美上海施贵宝制药有限公司。链脲佐菌素(streptozocin, STZ) (S0130，美国Sigma公司)；甲醇、乙腈(色谱级，德国Merck公司)；甲酸(色谱级，德国Fisher公司)；蒸馏水(广州屈臣氏食品饮料有限公司)。
1.2 动物SPF级SD大鼠80只，♂，体质量(200±20)g，购于哈尔滨医科大学实验动物学部，许可证号：SCXK(黑) 2019-001。大鼠饲养于黑龙江省中医药科学院动物实验中心，每日给予基础饲料和饮用水，光照12 h，适应性饲养1周。高糖高脂饲料(批号：2021060402)购于北京科奥协力饲料有限公司。实验经黑龙江省中医药科学院动物伦理委员会批准(批准号：[2011]93)。
1.3 仪器ACQUITY UPLC系统(美国Waters公司)；Triple-TOFTM 5600+型高分辨质谱仪(美国AB SCIEX公司)；罗氏卓越血糖仪(美国罗氏公司)；7600型全自动生化分析仪(日本日立公司)；Eclipse Ci- L正置白光拍照显微镜(日本Nikon公司)；PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000全景切片扫描仪(匈牙利3DHISTECH公司)。
2 方法 2.1 动物造模、分组及给药参考文献的建模方法[9-11]，本实验将80只大鼠随机分成两组，空白组喂食基础饲料(n=12)；模型组，喂食高糖高脂饲料(n=68)。4周后，模型组大鼠禁食不禁水15 h，腹腔注射30 mg·kg-1 STZ溶液。3 d后测定空腹血糖(Fasting blood glucose, FBG)，选取FBG值>16.7 mmol·L-1且保持10 d不变者作为糖尿病(diabetes mellitus, DM)模型大鼠，不成模大鼠继续注射30 mg·kg-1 STZ溶液，直至10周后共有60只DM模型大鼠。将60只DM模型大鼠按FBG和体质量随机分为五组，每组12只，模型组、阳性对照组、玉米须低、中、高剂量组。模型组和给药组大鼠每2周腹腔注射30 mg·kg-1 STZ溶液。阳性对照组灌胃二甲双胍溶液(0.25 g·kg-1)，玉米须组灌胃玉米须水煎液，给药剂量根据其临床用量[12]换算成大鼠的剂量是5.4 g·kg-1(中剂量组)，低和高剂量组分别为2.7 g·kg-1、10.8 g·kg-1，连续干预给药8周。
2.2 检测指标 2.2.1 大鼠体质量、肾质量、脏器指数检测给药8周后，各组大鼠禁食12 h，称质量。用10%水合氯醛麻醉，取双肾称质量，计算肾脏脏器指数=两侧肾脏质量/体质量。取其中一侧肾脏置-80 ℃冰箱保存，另一侧肾脏固定于4%多聚甲醛中。
2.2.2 空腹血糖、肾功能及血脂指标检测给药8周后，所有大鼠禁食不禁水8 h，测定FBG。将各组大鼠放置在代谢笼中，禁食不禁水，收集12 h尿液。大鼠麻醉后，腹主动脉取血，将尿液和血液分别4 ℃、3 000 r·min-1离心10 min，取上清即得尿液样本和血清，用全自动生化分析仪检测尿微量白蛋白/尿肌酐(albumin creatinine ratio, ACR)、尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)、血肌酐(serum creatinine, Scr)、总胆固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDLC)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDLC)。
2.3 肾组织病理学观察对固定的肾组织进行脱水、包埋、切片、HE和Masson染色、封片，在显微镜下详细观察组织切片情况。使用Image-Pro Plus 6.0分析软件统一以像素面积pixel作为标准单位，测量每张切片中胶原像素面积及对应的组织像素面积，计算出胶原面积占比/%=胶原像素面积/组织像素面积×100%。
2.4 代谢组学检测及分析 2.4.1 尿液样本处理取各组大鼠尿液各1.5 mL，采用0.22 μm滤膜器过滤，取续滤液进样。
2.4.2 肾组织样本处理取各组肾组织各100 mg，加1.0 mL冷水匀浆2 min，匀浆液加乙腈∶甲醇(1 ∶ 1) 4 mL，涡旋2 min，低温超声处理1 min，静置10 min，定量取30%的上清液，4 ℃ 13 000 r·min-1离心10 min，定量取60%的上清液氮气吹干，80%甲醇200 μL复溶，4 ℃ 13 000 r·min-1离心10 min，取上清液进样。
2.4.3 QC质控样本每组抽出两只尿液样本，各取200 μL混匀，按照“2.4.1”方法处理；每组抽出两只处理过的肾组织样本，上清液取10 μL混匀，液质进样。每检测10针样本进1针QC样本，共插入6针QC。
2.4.4 色谱条件 2.4.4.1 尿液样本Waters Acquity UPLC HSS T3 C18色谱柱(1.7 μm, 2.1 mm×100 mm)，AQUITY UPLC HSS T3 C18 VanGuard Pre-Column预柱(1.7 μm, 2.1 mm×5 mm)，柱温30 ℃。流动相A为0.1%甲酸-水，B为0.1%甲酸-乙腈，洗脱梯度：0~3 min，5%~10%B；3~9 min，10%~30%B；9~14 min，30%~100%B；14~15 min，100%B；15~15.1 min，100%~5%B；15.1~18 min，5%B，流速0.3 mL·min-1。进样量5 μL，自动进样器温度4 ℃。
2.4.4.2 肾组织样本Waters Acquity UPLC HSS BEH C18色谱柱(1.7 μm, 2.1 mm×100 mm)，AQUITY UPLC HSS BEH C18 VanGuard Pre-Column预柱(1.7 μm, 2.1 mm×5 mm)，柱温30 ℃。流动相A为0.1%甲酸-水，B为0.1%甲酸-乙腈，洗脱梯度：0~5 min，5%~70%B；5~10 min，70%~80%B；10~12 min，80%~100%B；12~14 min，100%B；14~14.1 min，100%~5%B；14.1~18 min，5%B，流速0.3 mL·min-1。进样量5 μL，自动进样器温度4 ℃。
2.4.5 质谱条件电喷雾离子源(ESI)正、负离子模式，离子源电压为5 500 V/-4 500 V，离子源温度为550 ℃，去簇电压(DP)为80 V/-80 V，碰撞能量(CE)为35 eV/-35 eV，碰撞能量扩展(CES)为15 eV/-15 eV。雾化气为N2，辅助气1为55 psi，辅助气2为55 psi，气帘气为35 psi。一级质谱母离子扫描范围为80~1 200 ku，IDA设置响应值超过100 cps的8个最高峰进行二级质谱扫描，子离子扫描范围为50~1 200 ku，开启动态背景扣除(DBS)。数据采集软件：Analyst TF 1.6 software。
2.4.6 数据分析采用SPSS 17.0软件对检测指标的数据进行F检验，组间差异采用t检验。使用Progenisis QI软件对UPLC/Q-TOF-MS采集的原始数据进行峰匹配、峰提取等预处理，得到的数据在EZinfo软件进行PCA和OPLS-DA，根据变量重要性投影值(VIP)>1且P < 0.05筛选差异代谢物。通过HMDB、KEGG等数据库的检索并导入MetaboAnalyst 5.0网站进行生物标记物的鉴定和代谢通路的分析。
3 结果 3.1 大鼠一般观察空白组大鼠精神状态良好、毛发正常且体质量持续增加；DN大鼠出现精神逐渐萎靡、毛发逐渐暗黄，失去光泽等现象，进食量和饮水量明显增加，尿量显著增加(表现在垫料从2 d一换到1 d一换，也可从代谢笼收集尿液量比对)，并带有烂苹果味。玉米须给药组大鼠上述状态优于模型组。
3.2 玉米须水煎液对DN大鼠体质量、肾质量、肾脏脏器指数的影响与空白组比较，模型组DN大鼠肾重和脏器指数明显增加，体质量下降(P < 0.01)，代表造模成功。经玉米须干预后，玉米须给药组的肾脏脏器指数明显降低，其中玉米须低和中剂量组差异有显著性(P < 0.01)；在肾质量水平上，玉米须低和中剂量组的两侧肾脏质量降低，其中玉低组差异有显著性(P < 0.01)；玉米须给药组对体质量有明显的改善作用，其中玉中组具有统计学意义(P < 0.05)。见Tab 1。
| Group | Body weight/g | Bilateral kidney weight/g | Kidney organ index/mg·g-1 |
| K | 547.75±66.63 | 2.84±0.31 | 5.23±0.69 |
| M | 349.49±21.29## | 3.52±0.28## | 10.10±0.83## |
| Y | 394.17±60.01 | 3.48±0.35 | 8.89±0.66** |
| YD | 362.39±29.31 | 3.11±0.24** | 8.61±0.75** |
| YZ | 388.16±34.50* | 3.50±0.31 | 9.02±0.50** |
| YG | 373.10±62.60 | 3.56±0.35 | 9.65±0.89 |
| K：Blank group；M：Model group；Y：Positive control group；YD：Corn silk low dose group；YZ：Corn silk medium dose group；YG：Corn silk high dose group. ##P < 0.01 vs blank；*P < 0.05，**P < 0.01 vs model. | |||
与空白组比较，模型组DN大鼠FBG、ACR和BUN明显增加(P < 0.01，P < 0.05)，代表造模成功。经玉米须干预后，玉米须给药组的FBG和ACR显著降低(P < 0.01，P < 0.05)，但各给药组几乎对BUN无调节作用。Scr在各组之间差异无统计学意义(P>0.05)，可能由于DN模型处于早期，肾功能受损较轻。见Tab 2。
| Group | FBG/mmol·L-1 | ACR/mg·g-1 | BUN /mmol·L-1 | Scr/μmol·L-1 |
| K | 5.63±0.52 | 18.46±9.21 | 5.64±0.71 | 25.77±1.32 |
| M | 32.88±1.33## | 148.24±43.43## | 7.49±1.71# | 23.68±3.35 |
| Y | 28.32±4.11** | 85.57±20.91** | 7.48±1.52 | 23.88±2.89 |
| YD | 26.07±3.13** | 78.68±22.25** | 11.16±1.16** | 26.53±2.44 |
| YZ | 27.70±4.12** | 72.86±20.20** | 9.44±1.07* | 22.55±4.84 |
| YG | 29.22±5.19* | 97.31±29.86** | 7.93±1.07 | 23.78±3.12 |
| K：Blank group；M：Model group；Y：Positive control group；YD：Corn silk low dose group；YZ：Corn silk medium dose group；YG：Corn silk high dose group. #P < 0.05，##P < 0.01 vs blank；*P < 0.05，**P < 0.01 vs model. | ||||
与空白组比较，模型组DN大鼠TC、TG、HDLC和LDLC含量明显升高(P < 0.01)。经玉米须干预后，玉米须给药组的TC、TG、HDLC和LDLC含量明显下降(P < 0.01，P < 0.05)。见Tab 3。
| Group | TC/mmol·L-1 | TG/mmol·L-1 | HDLC/mmol·L-1 | LDLC/mmol·L-1 |
| K | 2.13±0.23 | 0.85±0.29 | 0.62±0.09 | 0.19±0.04 |
| M | 7.43±1.35## | 2.57±0.97## | 1.19±0.23## | 2.35±0.57## |
| Y | 2.20±0.35** | 0.96±0.34** | 0.91±0.20** | 0.24±0.11** |
| YD | 2.37±0.41** | 0.64±0.21** | 0.97±0.19* | 0.23±0.06** |
| YZ | 2.21±0.38** | 0.83±0.17** | 0.94±0.15** | 0.19±0.05** |
| YG | 2.27±0.45** | 0.89±0.32** | 0.93±0.22* | 0.25±0.06** |
| K：Blank group；M：Model group；Y：Positive control group；YD：Corn silk low dose group；YZ：Corn silk medium dose group；YG：Corn silk high dose group. ##P < 0.01 vs blank；*P < 0.05，**P < 0.01 vs model. | ||||
HE染色结果表明(Fig 1A)，空白组肾皮质中肾小管上皮细胞圆润、饱满，刷状缘排列整齐规则。模型组肾皮质可见较大量的肾小管扩张，多见肾小管上皮细胞变性，胞质空泡化，胞核固缩深染，少见淋巴细胞浸润。与模型组相比，阳性对照组肾小管扩张的数量明显变少，但仍有少量淋巴细胞浸润；玉米须低剂量组少见肾小管病变，无明显的炎性改变；玉米须中剂量组肾小管上皮细胞变性减轻，组织中少见淋巴细胞浸润；玉米须高剂量组组织中可见多处肾小管扩张，局部间质中可见轻度的结缔组织增生，伴有少量淋巴细胞浸润。Masson染色结果可见，胶原纤维被染成蓝色(Fig 1B)，空白组胶原面积占比为0.012 3，模型组胶原面积占比明显增高，为0.078 9。与模型组比较，阳性对照组与玉米须低、中、高剂量组DN大鼠的肾纤维化程度均有所改善，胶原面积占比分别是0.031 5、0.041 5、0.052 3、0.060 9。
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| Fig 1 Effects of corn silk decoction on pathological sections of kidney tissues in DN rats K: Blank group; M: Model group; Y: Positive control group; YD: Corn silk low dose group; YZ: Corn silk medium dose group; YG: Corn silk high dose group. A: HE staining(×200);B: Masson staining(×200). |
各组大鼠的肾组织和尿液PCA图显示(Fig 2A-D)，在正负离子模式下，QC样本聚集良好，说明系统稳定，数据可靠。空白组、模型组及玉米须给药组之间有明显的离散，组内样本在一定范围内聚类较好。玉米须给药组位于空白组和模型组之间，表明玉米须能对DN大鼠的代谢紊乱有正向调节作用。
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| Fig 2 PCA score plot (A, C: positive ion mode; B, D: negative ion mode) of samples in each group K: Blank group; M: Model group; Y: Positive control group; YD: Corn silk low dose group; YZ: Corn silk medium dose group; YG: Corn silk high dose group. A, B: Renal tissue samples; C, D: Urine samples. |
对空白组和模型组大鼠的肾组织及尿液代谢轮廓进行OPLS-DA分析，得到S-plot载荷图(Fig 3A-D)，空白组与模型组明显分离，表明DN大鼠的肾组织及尿液代谢轮廓发生了显著的变化。在S-plot载荷图中，距离原点越远的点，其代表的化合物对各组间产生差异的贡献越大，筛选VIP >1且P < 0.05的代谢物为潜在生物标记物，根据分子量和串联质谱结果，在HMDB、KEGG等数据库中进行鉴定、识别。按照上述原则，最终在DN大鼠肾组织和尿液中分别筛选出41和43种潜在差异代谢物，对比玉米须给药组与模型组中各代谢物的含量，玉米须可回调其中73种差异代谢物，见Tab 4，5。
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| Fig 3 S-plot of blank group and model group samples K: Blank group; M: Model group; Y: Positive control group; YD: Corn silk low dose group; YZ: Corn silk medium dose group; YG: Corn silk high dose group. A: Renal tissue samples, positive ion mode; B: Renal tissue samples, negative ion mode; C: Urine samples, positive ion mode; D: Urine samples, negative ion mode. |
| No | Compound | Molecular formula | RT/min | m/z | Adduct | ppm | VIP | Trend A | Trend B |
| 1 | Armillaripin | C24H30O6 | 6.07 | 415.211 1 | M+H, M+Na | -1.000 5 | 3.134 93 | ↓ | ↑ |
| 2 | Stearoylcarnitine | C25H49NO4 | 8.34 | 428.373 0 | M+H | -1.000 6 | 1.989 11 | ↑ | ↓ |
| 3 | Alpha-Linolenic acid | C18H30O2 | 7.19 | 279.231 4 | M+H | -1.462 7 | 1.593 66 | ↑ | ↓ |
| 4 | Hydrocortamate | C27H41NO6 | 8.15 | 498.282 1 | M+Na | -1.174 4 | 1.103 35 | ↑ | ↓ |
| 5 | Lansioside A | C38H61NO8 | 8.17 | 682.428 6 | M+Na | -0.454 7 | 1.250 29 | ↓ | ↑ |
| 6 | 1-O-Hexadecyl-2-O-dihomogammalinolenoylglycero-3-phosphocholine | C44H84NO7P | 11.72 | 792.586 6 | M+Na | -1.460 2 | 1.940 8 | ↑ | — |
| 7 | Arachidonic acid | C20H32O2 | 11.72 | 305.247 0 | M+H | -1.704 4 | 1.533 97 | ↑ | ↓ |
| 8 | Montecristin | C37H66O4 | 15.64 | 575.503 5 | M+H | 0.110 6 | 1.210 12 | ↑ | ↓ |
| 9 | SM(d18 ∶0/16 ∶1(9Z)) | C39H79N2O6P | 15.56 | 703.574 4 | M+H | -0.635 8 | 6.939 1 | ↑ | — |
| 10 | 27-Nor-5b-cholestane-3a, 7a, 12a, 24, 25-pentol | C26H46O5 | 10.95 | 439.341 4 | M+H | -0.960 8 | 2.077 28 | ↓ | ↑ |
| 11 | Cucurbitacin C | C32H48O8 | 6.03 | 583.323 8 | M+Na | -0.605 5 | 2.210 35 | ↑ | ↓ |
| 12 | Octadecylamine | C18H39N | 5.92 | 270.314 9 | M+H | -2.419 0 | 3.654 5 | ↑ | ↓ |
| 13 | Sphinganine | C18H39NO2 | 5.94 | 302.304 8 | M+H | -1.694 5 | 1.938 78 | ↑ | ↓ |
| 14 | Phytosphingosine | C18H39NO3 | 5.29 | 318.300 0 | M+H | -0.877 9 | 2.228 73 | ↓ | ↑ |
| 15 | Tridecanoylglycine | C15H29NO3 | 7.22 | 270.206 9 | M-H | -2.188 2 | 2.311 77 | ↓ | ↑ |
| 16 | 15(S)-HETE | C20H32O3 | 7.34 | 319.228 0 | M-H | 0.545 1 | 2.521 2 | ↑ | ↓ |
| 17 | Alpha-dimorphecolic acid | C18H32O3 | 7.20 | 295.227 9 | M-H | 0.052 2 | 3.922 56 | ↑ | ↓ |
| 18 | Ganoderic acid H | C32H44O9 | 7.95 | 571.290 6 | M-H | -1.150 5 | 3.293 33 | ↑ | ↓ |
| 19 | (R)-1-O-[b-D-Glucopyranosyl-(1->6)-b-D-glucopyranoside]-1, 3-octanediol | C20H38O12 | 4.95 | 469.227 4 | M-H | -3.532 2 | 1.179 47 | ↑ | ↓ |
| 20 | Chenodeoxycholic acid sulfate | C24H40O7S | 4.85 | 471.242 8 | M-H | 1.279 5 | 3.252 72 | ↑ | ↓ |
| 21 | 9, 10-DHOME | C18H34O4 | 6.17 | 313.238 5 | M-H | 0.330 7 | 1.925 49 | ↑ | ↓ |
| 22 | Ethyl tetradecanoate | C16H32O2 | 13.14 | 255.233 1 | M-H | 0.512 7 | 2.167 45 | ↑ | ↓ |
| 23 | Oleic acid | C18H34O2 | 13.27 | 281.249 0 | M-H | 1.315 2 | 3.105 01 | ↑ | ↓ |
| 24 | Arachidonic acid | C20H32O2 | 11.73 | 303.233 4 | M-H | 1.578 9 | 3.221 83 | ↑ | ↓ |
| 25 | Linoleic acid | C18H32O2 | 12.09 | 279.233 3 | M-H | 1.217 3 | 2.877 44 | ↑ | ↓ |
| 26 | Docosahexaenoic acid | C22H32O2 | 11.23 | 327.233 3 | M-H | 1.116 5 | 2.380 58 | ↑ | ↓ |
| 27 | Pantothenic acid | C9H17NO5 | 2.33 | 218.103 5 | M-H | 0.645 5 | 2.534 42 | ↑ | ↓ |
| 28 | L-Phenylalanine | C9H11NO2 | 2.29 | 164.071 7 | M-H | -0.036 2 | 1.772 29 | ↑ | ↓ |
| 29 | L-Leucine | C6H13NO2 | 1.94 | 130.087 3 | M-H | -0.123 7 | 1.830 97 | ↑ | ↓ |
| 30 | L-Tyrosine | C9H11NO3 | 1.72 | 180.066 5 | M-H | -0.474 2 | 1.274 66 | ↑ | ↓ |
| 31 | Arabinosylhypoxanthine | C10H12N4O5 | 2.01 | 267.073 6 | M-H | 0.214 3 | 3.636 72 | ↓ | ↑ |
| 32 | Xanthosine | C10H12N4O6 | 2.11 | 283.068 5 | M-H | 0.217 3 | 1.914 49 | ↑ | — |
| 33 | Eriodictyol 7-(6-trans-p-coumaroylglucoside) | C30H28O13 | 2.05 | 595.144 1 | M-H | -2.708 3 | 2.518 13 | ↓ | ↑ |
| 34 | Flavin Mononucleotide | C17H21N4O9P | 2.69 | 455.098 2 | M-H | 1.970 0 | 1.059 06 | ↓ | — |
| 35 | L-Tryptophan | C11H12N2O2 | 2.65 | 203.082 5 | M-H | -0.705 3 | 1.917 43 | ↑ | ↓ |
| 36 | 10-Formyldihydrofolate | C20H21N7O7 | 2.41 | 470.143 6 | M-H | 1.340 1 | 1.347 91 | ↑ | ↓ |
| 37 | Gluconic acid | C6H12O7 | 0.93 | 195.050 9 | M-H | -0.407 2 | 2.595 42 | ↑ | ↓ |
| 38 | Taurine | C2H7NO3S | 0.90 | 124.007 5 | M-H | 0.798 6 | 1.299 49 | ↓ | ↑ |
| 39 | ADP-ribose 1“-2” cyclic phosphate | C15H22N5O16P3 | 1.38 | 620.022 7 | M-H | 4.024 1 | 1.473 6 | ↓ | ↑ |
| 40 | Uric acid | C5H4N4O3 | 1.00 | 167.020 5 | M-H | -3.140 3 | 1.104 33 | ↑ | ↓ |
| 41 | 10, 11-dihydro-20-dihydroxy-LTB4 | C20H34O6 | 4.61 | 369.228 6 | M-H | 0.841 4 | 3.120 24 | ↑ | ↓ |
| Trend A：model vs blank；Trend B：corn silk vs model；↑：increase；↓：decrease；—：no significant differences. | |||||||||
| No | Compound | Molecular formula | RT/min | m/z | Adduct | ppm | VIP | Trend A | Trend B |
| 1 | Leukotriene C4 | C30H47N3O9S | 5.45 | 626.313 5 | M+H, M+Na | 4.623 1 | 1.800 99 | ↓ | ↑ |
| 2 | Riboflavin | C17H20N4O6 | 7.04 | 377.145 6 | M+H, M+Na | 0.035 2 | 4.071 95 | ↓ | ↑ |
| 3 | 4-(3-Pyridyl)-3-butenoic acid | C9H9NO2 | 7.10 | 164.070 0 | M+H, M+Na | -3.497 2 | 2.424 28 | ↓ | ↑ |
| 4 | 5-Dodecenoic acid | C12H22O2 | 17.12 | 221.153 2 | M+H, M+Na | -2.235 1 | 1.928 47 | ↑ | ↓ |
| 5 | Suberylglycine | C10H17NO5 | 6.19 | 232.117 3 | M+H, M+Na | -2.788 4 | 1.501 62 | ↑ | ↓ |
| 6 | 17alpha, 21-Dihydroxypreg-nenolone | C21H32O4 | 9.64 | 349.237 2 | M+H | -0.402 7 | 1.038 71 | ↓ | ↑ |
| 7 | 3 hydroxycoumarin | C9H6O3 | 16.76 | 163.038 4 | M+H | -3.331 1 | 1.225 15 | ↑ | ↓ |
| 8 | 8-iso-PGA1 | C20H32O4 | 14.07 | 337.237 2 | M+H | -0.520 4 | 1.228 18 | ↓ | ↑ |
| 9 | Hepoxilin B3 | C20H32O4 | 11.32 | 337.237 7 | M+H | 1.109 4 | 1.413 53 | ↓ | ↑ |
| 10 | 4, 8 dimethylnonanoyl carnitine | C18H35NO4 | 12.34 | 330.263 9 | M+H | 0.104 6 | 1.735 9 | ↑ | ↓ |
| 11 | Urothion | C11H11N5O3S2 | 5.57 | 326.037 4 | M+H | -0.675 6 | 1.177 54 | ↓ | — |
| 12 | Epimelibiose | C12H22O11 | 0.97 | 365.104 7 | M+Na | -2.113 8 | 4.312 92 | ↑ | ↓ |
| 13 | alpha-CEHC | C16H22O4 | 0.36 | 279.158 9 | M+H | -0.757 3 | 1.111 32 | ↑ | ↓ |
| 14 | Pyridine | C5H5N | 0.45 | 80.049 8 | M+H | 4.306 8 | 1.757 21 | ↑ | ↓ |
| 15 | Maltotriose | C18H32O16 | 1.01 | 527.156 6 | M+Na | -3.200 1 | 3.834 04 | ↑ | ↓ |
| 16 | Galactosylglycerol | C9H18O8 | 1.01 | 277.089 2 | M+Na | -0.569 3 | 1.062 69 | ↑ | ↓ |
| 17 | Ribothymidine | C10H14N2O6 | 1.01 | 259.091 8 | M+H | -2.444 1 | 2.692 8 | ↑ | — |
| 18 | 2-Indolecarboxylic acid | C9H7NO2 | 6.38 | 162.054 2 | M+H | -4.633 4 | 1.715 18 | ↓ | ↑ |
| 19 | Indolelactic acid | C11H11NO3 | 9.66 | 204.066 6 | M-H | -0.241 8 | 1.420 87 | ↓ | ↑ |
| 20 | Metanephrine | C10H15NO3 | 10.27 | 196.097 8 | M-H | -0.774 5 | 1.226 27 | ↓ | ↑ |
| 21 | 2-Hydroxydecanedioic acid | C10H18O5 | 8.87 | 217.108 0 | M-H | -0.869 4 | 1.111 28 | ↑ | ↓ |
| 22 | Guaifenesin | C10H14O4 | 9.29 | 197.081 8 | M-H | -0.756 1 | 1.740 77 | ↑ | ↓ |
| 23 | Decenedioic acid | C10H16O4 | 10.90 | 199.097 3 | M-H | -1.286 1 | 1.183 37 | ↑ | ↓ |
| 24 | Traumatic acid | C12H20O4 | 11.77 | 227.128 5 | M-H | -1.566 9 | 1.146 44 | ↑ | ↓ |
| 25 | Pantothenic acid | C9H17NO5 | 4.05 | 218.103 5 | M-H | 0.371 6 | 3.548 91 | ↓ | — |
| 26 | 3, 4-Dihydroxyphenylglycol O-sulfate | C8H10O7S | 3.59 | 249.006 8 | M-H | -2.501 4 | 1.275 98 | ↓ | ↑ |
| 27 | Lanthionine ketimine | C6H7NO4S | 2.79 | 188.002 1 | M-H | -1.010 3 | 2.420 1 | ↓ | ↑ |
| 28 | Xanthurenic acid | C10H7NO4 | 5.57 | 204.029 9 | M-H | -1.848 3 | 1.806 18 | ↓ | — |
| 29 | Pyrocatechol | C6H6O2 | 5.38 | 109.029 5 | M-H | -0.316 4 | 2.960 35 | ↑ | — |
| 30 | Epimelibiose | C12H22O11 | 1.12 | 341.108 5 | M-H | -1.345 0 | 2.811 58 | ↑ | ↓ |
| 31 | Oxoglutaric acid | C5H6O5 | 1.34 | 145.013 9 | M-H | -2.707 0 | 2.387 02 | ↑ | — |
| 32 | 6-Sialyllactose | C23H39NO19 | 1.10 | 632.206 0 | M-H | 2.636 4 | 4.117 73 | ↑ | ↓ |
| 33 | Arabinonic acid | C5H10O6 | 0.97 | 165.039 9 | M-H | -3.118 3 | 1.240 26 | ↑ | ↓ |
| 34 | N-Acetylneuraminic acid | C11H19NO9 | 0.98 | 308.098 3 | M-H | -1.350 3 | 1.544 86 | ↑ | ↓ |
| 35 | Galactonic acid | C6H12O7 | 0.98 | 195.050 6 | M-H | -2.136 5 | 4.029 09 | ↑ | ↓ |
| 36 | 3-Methoxy-4-hydroxyphenylethyleneglycolsulfate | C9H12O7S | 7.77 | 263.022 5 | M-H | -2.109 2 | 2.474 16 | ↓ | ↑ |
| 37 | Indoxyl sulfate | C8H7NO4S | 7.30 | 212.002 3 | M-H | 0.041 0 | 12.602 | ↓ | ↑ |
| 38 | Isovalerylglutamic acid | C10H17NO5 | 6.26 | 230.103 7 | M-H | 1.156 7 | 2.339 28 | ↑ | ↓ |
| 39 | Rutin | C27H30O16 | 6.07 | 609.147 9 | M-H | 2.986 0 | 1.562 92 | ↑ | ↓ |
| 40 | Phenol | C6H6O | 5.91 | 93.034 8 | M-H | 1.770 2 | 4.172 02 | ↓ | ↑ |
| 41 | Valproic acid glucuronide | C14H24O8 | 6.83 | 319.139 7 | M-H | -0.481 0 | 1.308 75 | ↑ | ↓ |
| 42 | 3-Hydroxydodecanedioic acid | C12H22O5 | 7.11 | 245.139 2 | M-H | -1.129 4 | 1.261 58 | ↑ | ↓ |
| 43 | Dodecanedioic acid | C12H22O4 | 7.81 | 229.144 4 | M-H | -0.466 6 | 1.021 53 | ↓ | — |
| Trend A：model vs blank；Trend B：corn silk vs model；↑：increase；↓：decrease；—：no significant differences. | |||||||||
将DN大鼠肾组织和尿液的差异代谢物，以及玉米须可回调的差异代谢物，分别导入到MetaboAnalyst 5.0网站进行相关的代谢通路分析(Fig 4)。Fig 4A，B显示，DN大鼠肾组织中苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、核黄素代谢、鞘脂代谢等14条代谢通路发生紊乱，玉米须能改善其中13条代谢通路。Fig 4C，D显示，DN大鼠尿液中核黄素代谢、半乳糖代谢、三羧酸循环等8条代谢通路发生紊乱，玉米须能改善其中5条代谢通路。这些通路中共有18种差异代谢物参与，这些代谢物可能是玉米须对DN发挥干预作用的关键生物标志物。与空白组比较，DN模型大鼠体内代谢呈紊乱趋势，生物标志物的含量明显升高或降低(P < 0.01)，在肾组织中，玉米须能明显回调亚油酸、花生四烯酸等(P < 0.01，P < 0.05)；在尿液中，玉米须能显著回调核黄素等(P < 0.01，P < 0.05)，见Fig 5，6。其中玉米须中剂量组回调肾组织和尿液中的生物标志物相对优于低和高剂量组，并且与前期药效学结果基本一致，可能由于中剂量与临床给药剂量对等，效果最佳，也可能与高剂量水煎液相对浓稠有关，给大鼠灌胃后不易于消化，同时加重代谢的负担，导致对DN的干预作用较弱。另外，将肾组织和尿液的相关代谢通路作韦恩图，结果显示(Fig 7), 花生四烯酸代谢和酪氨酸代谢是肾组织和尿液代谢的共有通路，这两条通路可能是DN的潜在发病机制及玉米须干预DN的关键代谢通路。
|
| Fig 4 Metabolic pathway analysis in renal tissues and urine A: Renal tissue metabolic pathways associated with DN; B: Regulation of renal tissue metabolic pathway by corn silk; C: Urine metabolic pathways associated with DN; D: Regulation of urine metabolic pathway by corn silk. |
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| Fig 5 Effect of corn silk on normalized abundance of renal tissue differential metabolites K: Blank group; M: Model group; Y: Positive control group; YD: Corn silk low dose group; YZ: Corn silk medium dose group; YG: Corn silk high dose group.##P < 0.01 vs blank; *P < 0.05, **P < 0.01 vs model. |
|
| Fig 6 Effect of corn silk on normalized abundance of urine differential metabolites K: Blank group; M: Model group; Y: Positive control group; YD: Corn silk low dose group; YZ: Corn silk medium dose group; YG: Corn silk high dose group.##P < 0.01 vs blank; *P < 0.05, **P < 0.01 vs model. |
|
| Fig 7 Wayne diagram of metabolic pathway A: Renal tissue metabolic pathways associated with DN; B: Regulation of renal tissue metabolic pathway by corn silk; C: Urine metabolic pathways associated with DN; D: Regulation of urine metabolic pathway by corn silk. |
本实验采用UPLC/Q-TOF-MS技术，结合药效学指标和组织病理学观察，进行玉米须对DN大鼠的肾组织和尿液代谢组学的研究，并对所得的关键生物标志物和代谢通路进行阐释。药效学结果显示，模型组大鼠较空白组相关指标有显著性差异，肾脏发生病理改变，玉米须不同剂量组给药后各项指标均有不同程度的改善，表明玉米须对DN具有较好的干预作用。代谢通路分析表明，18种差异代谢物主要涉及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，核黄素代谢等18条代谢路径，其中花生四烯酸代谢和酪氨酸代谢是肾组织和尿液代谢的共有通路，核黄素代谢和苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成的Pathway impact值较大，现对这4条通路进行分析。
花生四烯酸(AA)是一种ω-6多不饱和脂肪酸，通过环氧合酶(COX)，脂氧合酶(LOX)和细胞色素P450代谢途径产生类花生四烯酸，包括前列腺素，白三烯，羟基二十碳四烯酸(HETE)等二十碳衍生物[13]。AA及其代衍生物具有很强的生物活性，有研究发现[14-15]，AA可引起人肾小球足细胞凋亡，并且其代谢产生的类花生四稀酸成分，能保护肾病患者的肾功能，减缓肾纤维化进程。本实验模型组大鼠尿液中白三烯C4(Leukotriene C4)含量明显降低(P < 0.01)，玉米须高剂量组能使其含量升高(P < 0.05)；而在模型组大鼠肾组织中AA和15(S)-HETE含量显著升高，可能由于DN发生发展中产生炎症，激活了COX、LOX和细胞色素P450途径，导致花生四烯酸代谢异常，经玉米须给药后恢复正常水平，说明玉米须能够通过调节花生四烯酸代谢来影响DN大鼠体内炎症反应，进而保护肾脏。
肾损伤与多种氨基酸代谢紊乱密切相关[16]，苯丙氨酸是机体的必需氨基酸，在苯丙氨酸羟化酶作用下可生成酪氨酸，当肾脏出现病变时，苯丙氨酸向酪氨酸转化受到抑制，抑制程度与肾脏病变程度相关。而酪氨酸为机体肾上腺素和去甲肾上腺素等单胺类神经递质的前体物质，单胺类物质代谢异常可引起组织氧化还原失衡[14]。酪氨酸可被ROS氧化，产生双酪氨酸(Dityr)及晚期蛋白质氧化产物(AOPPs)并在组织中堆积，有研究证实，慢性肾疾病患者体内有AOPPs堆积[17]。本实验模型组大鼠L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的水平明显增加，变肾上腺素水平明显降低(P < 0.01)，玉米须给药组可明显回调这3种代谢物的水平(P < 0.01)，表明玉米须可能通过调节苯丙氨酸和酪氨酸的合成、代谢，发挥抗氧化应激作用，减少肾损伤。
核黄素又称维生素B2，是谷胱甘肽还原酶的辅酶，能够维持体内还原性谷胱甘肽的浓度，减缓细胞损伤和凋亡，是机体抗氧化系统的重要组成部分。研究表明[18]，核黄素可以通过降低3-甲基戊二单酰辅酶A还原酶(HMGR)的水平来减少胆固醇的合成，调节血脂水平，防止脂质过氧化和蓄积，因此核黄素在能量代谢相关疾病中有着显著的疗效。本实验模型组大鼠尿液中核黄素的水平明显下降(P < 0.01)，玉米须给药组对核黄素有显著的回调作用(P < 0.05)，说明玉米须能够调节核黄素代谢，降低血脂浓度，干预DN的发展。
综上所述，本研究采用高糖高脂饲料和腹腔注射STZ造模法建立DN大鼠模型，通过药效学指标明确玉米须的干预作用，再从代谢组学角度探讨其作用机制。经阐释代谢通路的生物学意义发现，玉米须能够通过调节苯丙氨酸和酪氨酸的合成、代谢，花生四烯酸代谢，核黄素代谢等代谢通路，改善DN引起的机体氧化应激及炎症反应，达到干预DN的作用。在后续的研究过程中，可以利用分子生物学技术进一步探究玉米须干预DN的确切机制，对玉米须药材的资源开发利用具有深远意义。
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