衰老是一种自然规律，在生命进程中无法避免，与心血管疾病的发生和发展有着非常密切的关系。心房颤动(atrial fibrillation, AF)为常见的心律失常，不仅影响日常活动，严重者还可并发中风和心衰，具有较高的致残率和致死率。AF与衰老相关，是一种“衰老病”，其患病率随着年龄增加而增长，但现有治疗手段疗效欠佳，复发率高，需进一步探究其发病机制，以寻找更好的治疗策略。
心房结构重构是AF的关键机制之一，心房纤维化是其重要特点。衰老可导致细胞外基质(extracellular matrix, ECM)成分增加和组成改变，在心脏纤维化中起重要作用。与年轻对照组相比，老年患者和动物的心脏胶原浓度明显增加，心脏成纤维细胞增殖能力减弱[1]。心房成纤维细胞衰老和心房纤维化紧密联系，衰老相关心房纤维化最终可导致心房结构重构和AF发生。但心房成纤维细胞是如何发生衰老，其相关病理机制尚需进一步阐明。
Piezo1是近年来新鉴定出来的一种非选择性机械敏感性阳离子通道，对Na+、K+、Ca2+和Mg2+等阳离子均具有通透性，略倾向Ca2+[2]。现有研究表明，Piezo1参与许多心血管疾病的病理过程。如Piezo1能将小鼠心肌细胞中的机械信号转化成Ca2+和活性氧信号，敲减Piezo1，可使心脏中的Ca2+和活性氧信号下降，进而导致心肌病的发生[3]。在心梗大鼠心脏中，肾素血管紧张素系统(renin angiotensin system, RAS)激活可促进Piezo1表达增加，进而导致心衰[4]。我们的前期研究发现，衰老心房成纤维细胞的mRNA-seq结果显示衰老细胞中Piezo1的基因表达明显升高，伴随纤维化因子表达增加；提示Piezo1通道可能在心房成纤维细胞衰老中起作用。
β-连环蛋白(β-catenin)功能多样，可与细胞骨架相互作用以辅佐细胞对外界变化作出反应，在细胞分化、增殖、衰老和凋亡方面起重要作用[5]。一方面，β-catenin作为一种黏附因子，与E-钙黏蛋白(E-Cadherin)的胞内部分相互作用，促进细胞之间的黏附反应；另一方面，Wnt信号激活，促进β-catenin从胞质转移到胞核，作为一种转录激活因子，启动促使细胞分裂的基因[5]。有研究显示，一些组织器官衰老过程与Wnt/β-catenin信号通路有关联：如与年龄相关的动脉硬化疾病中，发现β-catenin对细胞周期蛋白出现调控障碍[6]；在衰老肌组织中，纤维化的肌卫星细胞和经典Wnt信号通路激活相关[7]。然而，β-catenin是否参与心房成纤维细胞衰老的过程，并受Piezo1调控，尚不清楚。
因此，本研究拟证实新型机械敏感离子通道Piezo1，通过激活多功能蛋白β-catenin，参与心房成纤维细胞衰老，为临床上衰老相关AF的防治提供理论依据和新靶点。
1 材料与方法 1.1 动物本研究经广东省人民医院(广东省医学科学院)医学研究伦理委员会批准，批件号：No GDREC2017111A。实验动物来自南方医科大学实验动物管理中心，许可证号：SCXK(粤)2021-0041。SPF级雄性C57BL/6小鼠，3~4周龄36只，5月龄和18月龄各18只。
1.2 主要试剂和仪器0. 25%胰蛋白酶-EDTA(Stemcell Technologies，07901)；胎牛血清(Thermo Fisher Scientific，10099-141)；DMEM/F12培养基(Thermo Fisher Scientific，C11330500BT)；Piezo1 siRNA和阴性对照(锐博生物，SiR0001)；Lipofectamine 3000转染试剂盒(Thermo Fisher Scientific，L3000075)；叔丁基过氧化氢(tert-butyl hydroperoxide, TBHP)(Sigma-Aldrich，458139)；GsMTx4(MedChemExpress，HY-P1410A)；XAV939(MedChemExpress，HY-15147)；Yoda1(MedChemExpress，HY-18723)；衰老相关β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase, SA-β-Gal)染色试剂盒(Beyotime，C0602)；蛋白Marker(Vazyme，MP102-02)；anti-GAPDH一抗(Proteintech，075501)；anti-Piezo1一抗(Alomone Labs，APC-087)；anti-β-catenin一抗(Abcam，ab32572)；anti-p-β-catenin一抗(Abcam，ab75777)；anti-p53一抗(Santa Cruz，sc-126)；anti-p21一抗(Santa Cruz，sc-817)；anti-兔二抗和anti-鼠二抗(Jackson，115-035-003)；普通光学显微镜(Olympus); 蛋白电泳和转移设备(BIO-RAD)；化学发光成像仪(Cytiva，GE Healthcare Life Sciences)。
1.3 主要方法 1.3.1 细胞分离培养与质粒转染SPF级雄性C57BL/6小鼠，3~4周龄，颈椎脱臼处死，剪开胸腔分离心脏，剪取左右心耳及心房组织，预冷的无菌PBS洗清残血后细剪成约1 mm3的小块。加入5 mL 0. 25%胰酶轻吹消化约5 min，静置约1 min，将上清转移至终止血清中终止消化，重复消化到组织块基本消失。过滤(100目过滤网)消化所得混悬液，1 500 r·min-1离心15 min，弃上清，用2 mL含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬后接种到25 cm2培养瓶，再往25 cm2培养瓶中加入3 mL含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，轻轻摇匀，放进37 ℃、5% CO2培养箱4 h后换液，继续培养。P2、P3和P4的细胞作为研究对象。用6孔细胞培养板接种细胞，细胞密度为70%~80%时进行质粒转染。分别取250 μL Opti-MEM培养基稀释5 μg质粒和6 μL Lipofectamine 3000试剂，充分混匀后孵育15 min，均匀滴加至细胞培养基中，6 h后换液，继续培养1~2 d。
1.3.2 SA-β-Gal染色细胞接种于6孔细胞培养板中，待密度达到约80%，弃培养基后PBS漂洗3次。加入固定液室温固定15 min，PBS漂洗3次。每孔滴加1 mL染色液(pH 6.0)，于37 ℃、不含CO2的干燥恒温箱孵育过夜(保鲜膜封住防止液体蒸发)。用显微镜观察，衰老细胞呈核周蓝染。
1.3.3 Western blot细胞加入RIPA裂解液后在冰上裂解30 min。4 ℃、12 000 r·min-1离心15 min，取上清，BCA法测定蛋白浓度。加入4×loading buffer到蛋白样品中，55 ℃或100 ℃变性10 min。8%或10%分离胶电泳分离蛋白后转移至PVDF膜。加入5%脱脂牛奶TBST室温下封闭1 h。TBST洗3次后加入稀释的对应一抗(1 ∶1 000)4 ℃孵育过夜。TBST洗3次后加入稀释的对应二抗(1 ∶5 000)室温孵育1 h。TBST洗3次，使用ECL试剂盒，通过化学发光成像仪让蛋白条带显影。
1.4 统计学处理采用SPSS 25.0统计，数据用x±s表示。两组间用t检验比较；多组间用单因素方差分析比较。
2 结果 2.1 5月龄与18月龄小鼠左心房组织的衰老程度及组织中Piezo1/β-catenin和衰老相关蛋白的表达老龄小鼠(18月龄)左心房组织的SA-β-Gal染色阳性组织明显多于对照组(5月龄)，见Fig 1A。且相比于5月龄小鼠，18月龄组小鼠左心房组织的Piezo1、β-catenin、p53和p21的蛋白表达水平明显升高(P＜0.01)(Fig 1B)。提示老龄小鼠左心房组织衰老率增加，而Piezo1/β-catenin可能与心房组织衰老相关。
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| Fig 1 The senescence degree and the protein expression levels of Piezo1/β-catenin and p53/p21 in left atrial tissue of C57BL/6 mice at 5- or 18-month old(x±s) A: The images of SA-β-Gal staining of left atrial tissue from 5-and 18-month mice. Scale bars, 100 μm; B: The protein expression levels of Piezo1, β-catenin, p53 and p21 in left atrial tissue of 5-and 18-month mice. **P < 0.01 vs 5m group. |
使用100 μmol·L-1 TBHP处理小鼠心房成纤维细胞(mouse atrial fibroblasts, MAFs)2 h，换液后继续培养48 h。SA-β-Gal染色显示，与对照组相比，TBHP处理组SA-β-Gal染色阳性的衰老细胞占比明显上升(P＜0.01)，提示TBHP可诱导细胞衰老(Fig 2A)。此外，TBHP(100 μmol·L-1)处理组细胞中Piezo1、β-catenin和p-β-catenin蛋白表达，以及衰老相关蛋白p53和p21表达均明显增加(P＜0.05)(Fig 2B)。以上结果提示，Piezo1表达增加，β-catenin激活可能参与MAFs衰老。
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| Fig 2 The senescence ratio and the protein expression levels of Piezo1, β-catenin, p-β-catenin and senescence-associated proteins in MAFs induced by TBHP(x±s) A: The SA-β-Gal staining of MAFs before and after treated with TBHP. Scale bars, 100 μm; B: The protein expression levels of Piezo1, β-catenin, p-β-catenin, p53 and p21 in MAFs before and after treated with TBHP. *P < 0.05, **P < 0.01 vs Control group. |
为了进一步探索Piezo1在MAFs衰老中的作用，我们给予不同浓度(3、10 μmol·L-1)的Piezo1通道抑制剂GsMTx4干预MAFs 24 h后，加入100 μmol·L-1 TBHP处理2 h，换液后继续培养48 h。结果发现，GsMTx4 10 μmol·L-1可明显抑制TBHP诱导的MAFs衰老(P＜0.01)(Fig 3A)。且与TBHP组相比，加入GsMTx4后，Piezo1、β-catenin、p-β-catenin、p53和p21的表达量呈浓度依赖性下降，以10 μmol·L-1组下降最明显(P＜0.05)(Fig 3B)。提示，Piezo1通道抑制剂GsMTx4可减轻TBHP诱导的MAFs的衰老率，并抑制β-catenin激活和降低衰老相关蛋白的表达水平。
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| Fig 3 Role of GsMTx4 in the senescence ratio and the protein expression levels of Piezo1, β-catenin/p-β-catenin and senescence-associated proteins in MAFs treated with TBHP(x±s) A: Representative and qualification of SA-β-Gal staining of MAFs in Control, TBHP and TBHP+GsMTx4 10 μmol·L-1 group. Scale bars, 100 μm; B: The protein expression levels of Piezo1, β-catenin/p-β-catenin, and p53/p21 of MAFs in Control, TBHP, TBHP+GsMTx4 (3 or 10 μmol·L-1) group. *P < 0.05, **P < 0.01 vs Control group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs TBHP group. |
Piezo1 siRNA转染处理MAFs以敲减Piezo1的表达，转染24 h后加入100 μmol·L-1 TBHP处理2 h，换液后继续培养48 h。与阴性对照组(NC)相比，敲减Piezo1后MAFs衰老率明显减少(P＜0.01)，见Fig 4A；且β-catenin的表达和活性明显降低(P＜0.05)，衰老相关蛋白p53和p21的蛋白表达也明显减少(P＜0.05)，见Fig 4B。由此提示，Piezo1敲减后，可明显延缓MAFs衰老，可能是通过β-catenin激活减少来实现的。
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| Fig 4 Piezo1 knockdown reduced the senescence ratio and the protein expression levels of Piezo1, p-β-catenin, β-catenin and senescence-associated proteins in MAFs treated with TBHP(x±s) A: Representative and qualification of SA-β-Gal staining of MAFs in Control, Negative control and Piezo1 siRNA group. Scale bars, 100 μm; B: The protein expression levels of Piezo1, β-catenin/p-β-catenin and p53/p21 of MAFs in Control, Negative control and Piezo1 siRNA group. *P < 0.05, **P < 0.01 vs Negative control group. |
为了探索β-catenin在心房成纤维细胞衰老中的作用，我们给予不同浓度的β-catenin抑制剂XAV939(3、10 μmol·L-1)干预MAFs 24 h后，加入100 μmol·L-1 TBHP处理2 h，换液后继续培养48 h。如Fig 5A所示，与TBHP+DMSO组相比，TBHP+XAV939 10 μmol·L-1组的SA-β-Gal染色阳性细胞明显减少(P＜0.01)。且XAV939亦可减少TBHP诱导的心房成纤维细胞中β-catenin/p-β-catenin、p53和p21表达水平的增加，其中p-β-catenin、p53和p21的表达量呈浓度依赖性递减，以10 μmol·L-1组减低最明显(P＜0.05)(Fig 5B)；提示β-catenin参与TBHP诱导的MAFs衰老。
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| Fig 5 Role of XAV939 in the senescence ratio and the protein expression levels of β-catenin/p-β-catenin and p53/p21 in MAFs treated with TBHP(x±s) A: Representative and qualification of SA-β-Gal staining of MAFs in Control, TBHP, TBHP+DMSO and TBHP+XAV939 10 μmol·L-1 group. Scale bars, 100 μm; B: The protein expression levels of β-catenin/p-β-catenin, and p53/p21 of MAFs in Control, TBHP, TBHP+DMSO, TBHP+XAV939 (3 or 10 μmol·L-1) group. *P < 0.05, **P < 0.01 vs Control group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs TBHP+DMSO group. |
MAFs以不同浓度的Piezo1特异性激动剂Yoda1(1、10 μmol·L-1)干预48 h。如Fig 6A所示，相比于DMSO组，Yoda1处理组的SA-β-Gal染色阳性的衰老细胞比例明显升高(P＜0.01)。且与DMSO组相比，Piezo1、β-catenin、p-β-catenin和p21的表达量以高浓度组上调最明显(P＜0.05)；p53在Yoda1 1 μmol·L-1组表达明显增多(P＜0.05)(Fig 6B)。提示Piezo1通道激动剂可通过激活β-catenin诱导MAFs的衰老。
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| Fig 6 Yoda1 increased the senescence ratio and the protein expression levels of Piezo1, β-catenin/p-β-catenin and p53/p21 in MAFs(x±s) A: Representative and qualification of SA-β-Gal staining of MAFs in Control, DMSO and Yoda1 10 μmol·L-1 group. Scale bars, 100 μm; B: The protein expression levels of Piezo1, β-catenin/p-β-catenin, and p53/p21 of MAFs in Control, DMSO, Yoda1 (1 or 10 μmol·L-1) group. *P < 0.05, **P < 0.01 vs DMSO group. |
研究结果表明，氧化应激(TBHP)可诱导MAFs衰老，同时细胞中的新型机械敏感离子通道Piezo1，β-catenin，以及衰老相关蛋白表达水平和活性明显上调。抑制Piezo1的功能和敲减Piezo1，以及抑制β-catenin，均可明显抑制MAFs衰老，明显降低β-catenin、p-β-catenin和衰老相关蛋白的表达。而Piezo1特异性激动剂Yoda1可促进MAFs衰老以及细胞内β-catenin表达和活性增加。上述结果提示，Piezo1可能通过β-catenin途径促进心房成纤维细胞衰老。
细胞衰老是指增殖中的细胞，随着细胞分裂次数增多或受到应激刺激，细胞周期停滞在G1期。衰老细胞表现为体积增加，轮廓缩窄，胞质空泡，胞核增大，核膜内折，且出现特异性的分子标志物，如SA-β-Gal、染色质集落和脂褐素颗粒等[8]。细胞衰老属于应激性的适应，有利于维持机体的内环境稳态。但衰老细胞堆积，可使炎症因子、生长因子和降解酶增多，对附近正常细胞产生不良影响，进而导致衰老相关疾病如AF、高血压、冠心病和糖尿病等的发生[9]。
心房纤维化是心房结构重构的关键特点，而衰老与心房纤维化有着紧密的联系。有研究表明，即使是健康个体，心脏结构和功能也会随着年龄增长出现改变，而衰老引起心脏结构重构与ECM组成变化及成分紊乱有关[10]。研究显示[11]，与年轻组相比，年老人左心房的纤维化程度更严重。与之相仿，在电生理刺激诱发AF的实验中，老年犬的左心房纤维化程度明显较年轻犬更严重[12]。但心房成纤维细胞衰老的分子机制尚未阐明。因此，本研究以MAFs为研究对象，使用TBHP建立细胞衰老模型，探索其相关机制。
Piezo1是一种新型机械敏感离子通道蛋白，参与许多心血管疾病的病理过程[13-14]。研究结果表明，心脏成纤维细胞中，牵张力能使Piezo1蛋白水平上调，推动Ca2+内流，启动p38MAPK，使炎症因子IL-6分泌增加，导致心脏结构重构[15]。高血压时，拉伸力增加，能激活小动脉平滑肌细胞的Piezo1，增加胞内Ca2+浓度，增强交联酶活性，导致小动脉管壁变厚，发生结构变化[14]。但Piezo1在心房成纤维细胞衰老中的作用尚无相关报道。本研究的结果显示，Piezo1通道蛋白参与MAFs衰老的病理过程。
此外，作为一种多功能蛋白，β-catenin普遍存在于各类细胞，如成纤维细胞、成骨细胞和内皮细胞等；而且主要在细胞膜，胞质中较少。游离的β-catenin能进入细胞核，调节基因表达。β-catenin是Wnt/β-catenin通路的转录因子，在Wnt通路被激活时，β-catenin大量聚集于胞质，并进入细胞核中，以转录因子的角色发挥功能[16]。β-catenin信号通路也与一些器官衰老相关纤维化有关：如衰老肾脏中Wnt/β-catenin信号和RAS活性上调，介导年龄相关性肾纤维化，并与线粒体功能障碍相关[17]；特发性肺纤维化中，慢性Wnt/β-catenin蛋白活性增加可使肺泡上皮细胞衰老增加，导致细胞功能障碍和肺修复受损[18]。本研究表明，在TBHP诱导衰老的MAFs中，β-catenin表达和活性增加，促进衰老相关蛋白的表达，并受Piezo1调控。
综上所述，本研究证实了机械敏感离子通道Piezo1通过激活β-catenin诱导心房成纤维细胞衰老。
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