糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病相关的一种微血管并发症，其主要病理特点表现为肾小球基底膜增厚、结节性肾小球硬化、系膜基质扩张和小动脉透明质化，约30%~40%的糖尿病患者可并发DN，严重影响患者的生存及预后[1]。DN的发病机制目前尚不清楚，但肾小管间质纤维化被普遍认为是导致DN患者肾功能丧失的重要途径。已有研究证实，上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)可介导肾纤维化中细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的积累和沉积[2]。然而，肾小管EMT在DN早期进展中的分子机制仍未知。
鞘氨醇1-磷酸(sphingosine-1-phosphate，S1P)是一种中枢鞘脂分子，可以与1-磷酸鞘氨醇受体(S1PR1-5)结合，从而调节多种重要的细胞反应，包括增殖和迁移，并根据其作用部位调节炎症和纤维化反应[3]。近年来，S1P在肾脏纤维化中发挥的作用受到越来越多的关注，研究发现水蛭素可以通过S1P/S1PR2/S1PR3信号通路抑制蛋白酶激活受体1表达，从而减轻TGF-β诱导的肾近端肾小管上皮细胞纤维化[4]。另有研究指出，激活G蛋白偶联胆汁酸受体(takeda-G-protein receptor-5，TGR5)可以抑制肾小球系膜细胞中S1P/S1PR2信号通路并抵抗高糖诱导的纤维化[5]。然而，S1P/S1PR1在高糖诱导的肾小管上皮细胞的表达及其与EMT的关系尚未见报道，因此我们探究了S1P/S1PR1信号通路在高糖诱导的NRK-52E大鼠肾小管上皮细胞EMT中的作用机制。
1 材料与方法 1.1 材料NRK-52E细胞购自中国科学院上海细胞库；优质胎牛血清(W000100)购于上海四季青公司；胰蛋白酶(S01402)购自北京索莱宝生物科技有限公司；DMEM低糖培养基(C11885500BT)购自美国Gibco公司。S1P酶联免疫吸附测定试剂盒(MM-44778M1)购自江苏酶免实业有限公司；ROS测定试剂盒(E004-1-1)购自南京建成生物科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒(KGPBCA)购自江苏凯基生物技术股份有限公司；超敏ECL化学发光检测试剂盒(SW134-01)购自赛文创新北京生物科技有限公司；S1P(SML2709)购自Sigma公司; 逆转录(RR047A)、PCR试剂盒(RR820A)购自TaKaRa公司；小干扰RNA(siRNA)、引物E-cadherin、Vimentin、Fibronectin及Twist购自上海生物工程公司；兔抗E-cadherin(WL01482)、Vimentin(WL01960)、Fibronectin(WL00712)及Snail(WL01863)抗体购自沈阳万类生物科技有限公司；兔抗NF-κB(ab207297)、NLRP3(ab263899)、ASC(ab180779)及β-actin(ab8226)抗体购自Abcam公司。
1.2 细胞培养NRK-52E细胞置于37 ℃、5%二氧化碳培养箱中，使用含5%胎牛血清及l%双抗(100 kU·L-1青霉素和100 kU·L-1链霉素)的DMEM培养液培养，用胰蛋白酶消化，2 d传代1次。
1.3 细胞分组与处置将NRK-52E细胞分为4组：正常对照组(normal control, NC)，10、20及30 mmol·L-1葡萄糖浓度组，NC组细胞用低糖培养，分别作用24和48 h。
将NRK-52E细胞分成3组：NC组、HG组(30 mmol·L-1葡萄糖)、HG+siS1PR1组(转染si-S1PR1 48 h后加入30 mmol·L-1葡萄糖刺激24 h)。
将NRK-52E细胞分为3组：NC组、S1P组、S1P+siS1PR1组(转染si-S1PR1 48 h后用5 μmol·L-1 S1P激活剂作用12 h)。
1.4 ROS水平测定NRK-52E细胞接种于6孔板(5×104个细胞/孔)，24 h后收集细胞，DCFH-DA作为荧光探针检测细胞内ROS水平，孵育30 min后，PBS洗涤，收集细胞后通过流式细胞仪检测或倒置荧光显微镜拍照。
1.5 ELISA法测定S1P浓度细胞用不同浓度葡萄糖作用24 h或48 h，细胞沉淀用超声破碎仪破碎，1 000 r·min-1，4 ℃离心收集上清，根据ELISA试剂盒说明书测定S1P表达水平。
1.6 细胞转染细胞达到30%~40%融合后，按照说明书用siRNA在无血清培养基中转染NRK-52E。转染siRNA 48 h后进行下一步处理。
1.7 RT-qPCR检测E-cadherin、Vimentin、Fibronectin及Twist的mRNA表达用TRIzol提取总RNA，溶解在无RNA酶水中。反转录为cDNA后采用实时荧光定量PCR检测基因表达。反应条件：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，35 s；共40个循环。采用2-ΔΔCt分析法计算mRNA相对浓度。引物如下：GAPDH：上游5′-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3′，下游5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′; E-cadherin：上游5′-GTCTCTCTCACCACCTCCACAG-3′，下游5′-CTCGGACACTTCCACTCTCTTT-3′; Vimentin：上游5′-GAAGAGAACTTTGCCGTTGAAG-3′，下游5′-GAAGGTGACGAGCCATTTC-3′; Fibronectin：上游5′-AGGAAGCCGAGGTTTTAACTG-3′，下游5′-AGGACGCTCACAATGGTCACC-3′; Twist：上游5′-GCAAGAAGTCGAGCGAAGAT-3′，下游5′-GCTCTGCAGCTCCTCGAA-3′。
1.8 Western blot检测相关蛋白的表达使用裂解液提取细胞总蛋白后采用BCA法检测蛋白浓度，通过SDS-PAGE电泳分离蛋白，将目的蛋白转至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，TBST洗膜后分别加入一抗E-cadherin(1 ∶ 1 000)、α-SMA(1 ∶ 1 000)、Vimentin(1 ∶ 1 000)、Snail(1 ∶ 1000)、NLRP3(1 ∶ 1 000)、ASC(1 ∶ 1 000)、NF-κB(1 ∶ 1 000)和β-actin(1 ∶ 10 000)，于4 ℃条件下过夜孵育，TBST洗膜后加入羊抗兔抗体(1 ∶ 10 000)室温孵育1 h，TBST洗膜后使用ECL化学发光试剂盒显影，使用ImageJ分析蛋白的相对表达量。
1.9 统计学处理所有数据均以x±s表示，各组间差异由方差齐性和单因素方差分析确定，使用GraphPad Prism 6.0软件进行统计学分析。
2 结果 2.1 高糖刺激对S1P/S1PR1信号通路表达的影响为了探究高糖刺激对S1P/S1PR1信号通路的影响，ELISA法检测高糖作用24 h和48 h后细胞内S1P的表达，与NC组相比30 mmol·L-1组S1P表达明显升高(P < 0.01)。不同浓度葡萄糖刺激NRK-52E细胞24 h，Western blot结果显示，随着葡萄糖浓度升高，S1PR1蛋白表达逐渐升高，30 mmol·L-1组与NC组相比差异具有统计学意义(P < 0.05)，提示高糖可以激活NRK-52E细胞中S1P/S1PR1信号通路的表达(Fig 1)。
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| Fig 1 Effect of high glucose on expression of S1P/S1PR1 in NRK-52E cells (x±s, n=3) 1:NC; 2:10 mmol·L-1; 3:20 mmol·L-1; 4:30 mmol·L-1. A, B: The level of S1P in cells was detected by ELISA; C, D: Western blot detected the level of S1PR1 protein. *P < 0.05, **P < 0.01 vs NC. |
RT-qPCR结果显示，高糖处理显著降低了E-cadherin mRNA的表达，阻断S1PR1后表达升高(P < 0.05)，与NC组相比，高糖组Vimentin、Fibronectin及Twist mRNA表达升高，阻断S1PR1后基因表达降低(P < 0.05)。Western blot结果也显示，阻断S1PR1后E-cadherin表达升高(P < 0.05)，α-SMA、Vimentin蛋白表达降低(P < 0.05，P < 0.01)，表明高糖刺激可以诱导NRK-52E细胞发生EMT，而阻断S1PR1后可显著改善EMT，提示S1P/S1PR1通路与EMT有关(Fig 2)。
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| Fig 2 Effect of blocking S1PR1 on NRK-52 EMT induced by high glucose (x±s, n=3) A: RT-qPCR was used to detect mRNA expression of E-cadherin, Vimentin, Fibronection and Twist; B, C: The protein levels of E-cadherin, α-SMA and Vimentin were detected by Western blot; *P < 0.05, **P < 0.01 vs NC, #P < 0.05, ##P < 0.01 vs HG. |
如Fig 3流式细胞术检测结果所示，与NC组相比，高糖刺激后细胞内ROS表达升高，差异具有统计学意义(P < 0.01)，表明高糖刺激可以激活细胞内ROS的产生；与高糖组相比，阻断S1PR1后ROS表达降低(P < 0.01)，提示高糖诱导的NRK-52E细胞ROS的产生是由S1P/S1PR1信号通路介导的。
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| Fig 3 Effect of blocking S1PR1 on ROS level induced by high glucose (x±s, n=3) A, B: ROS expression was detected by flow cytometry; **P < 0.01 vs NC, ##P < 0.01 vs HG. |
Western blot结果表明，与NC组相比，高糖诱导下NLRP3、ASC及NF-κB蛋白表达升高(P < 0.01)，阻断S1PR1后表达降低，与高糖组相比差异具有统计学意义(P < 0.05)，说明阻断S1PR1可以抑制高糖作用下炎症信号的产生(Fig 4)。
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| Fig 4 Effects of blocking S1PR1 on NF-κB, NLRP3 and ASC protein levels induced by high glucose (x±s, n=3) A, B: The protein levels of NLRP3, ASC and NF-κB were detected by Western blot; **P < 0.01 vs NC, #P < 0.05, ##P < 0.01 vs HG. |
免疫荧光结果表明，与NC组相比，激活S1P/S1PR1信号通路ROS水平表达升高(P < 0.01)，阻断S1PR1后可明显降低ROS的表达(P < 0.05)。Western blot结果显示，阻断S1PR1可以降低S1P刺激下Vimentin、α-SMA、Snail、NLRP3、ASC及NF-κB蛋白表达(P < 0.05)，提示S1P/S1PR1可能通过激活ROS/NLRP3促进NRK-52E EMT(Fig 5)。
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| Fig 5 Effects of blocking S1PR1 on ROS, EMT and inflammation levels under S1P stimulation (x±s, n=3) A, B: ROS expression was detected by immunofluorescence; C, D: The protein levels of Vimentin, α-SMA, Snail, NLRP3, ASC and NF-κB were detected by Western blot; *P < 0.05, **P < 0.01 vs NC, #P < 0.05, ##P < 0.01 vs S1P. |
DN是糖尿病常见的微血管并发症，因其发病机制复杂，缺乏有效的诊断和治疗方法，目前仍是造成糖尿病患者终末期肾病的主要原因[1]。由于高糖、尿蛋白、氧化应激的存在，肾小管上皮细胞转化为肌成纤维细胞来抵抗环境破坏，然后进入间质，异常合成ECM[6]，最终导致肾小球基底膜增厚、足细胞消失、肾小球内结节性ECM积聚以及肾小管间质纤维化[7]。EMT已被证实是上皮细胞失去上皮细胞特征而获得间充质特征的严密调控过程，因此，预防EMT的发生发展是延缓小管间质损伤，减少肌成纤维细胞数量的主要措施。
S1P被证明可参与肾脏中多种细胞功能的调节，如细胞增殖和生存、迁移、炎症反应及ECM重塑等。S1P的大部分生物学功能是基于其与5种特异性细胞表面S1PRS的结合[8]。研究表明，S1P/S1PR2信号通路的激活与DN的发生和纤维化有关[9]，但未曾见S1P/S1PR1信号通路在DN中的报道，因此我们首先探究了在高糖诱导下大鼠肾小管上皮细胞中S1P/S1PR1信号通路的表达。结果显示在高糖诱导的肾小管上皮细胞中S1P/S1PR1信号通路表达明显升高，提示S1P/S1PR1信号通路可能与DN相关。有研究指出鞘氨醇激酶(SphK1和SphK2)催化鞘氨醇磷酸化生成S1P，敲除Sphk1可减轻单侧输尿管梗阻模型肾纤维化[10]，S1PR1也可通过PI3K/Akt通路抑制缺血/再灌注损伤所致的肾EMT[11]。基于此我们检测了高糖刺激后EMT相关指标的基因及蛋白水平表达，结果显示，阻断S1PR1可以抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞EMT，提示S1P/S1PR1信号通路可能与DN的EMT有关。
那么S1P/S1PR1信号通路是如何影响DN的EMT呢？越来越多的证据表明，炎症与DN的发展密切相关，其中NLRP3炎症小体在介导DN肾损伤中的机制被广泛研究[12]。在DN中，高脂高糖导致ROS、TGF-β1等因子水平升高，进而诱导肾小管上皮细胞发生EMT，慢性肾小管间质纤维化和炎症反应[13]。黄葵胶囊通过抑制NLRP3炎症小体激活和TLR4/NF-κB信号通路，减轻DN的EMT[14]，高血糖可通过ROS激活NLRP3炎症小体，诱导肾小管间质损伤和纤维化[15]。因此，我们猜测S1P/S1PR1信号通路可能是通过参与氧化应激、炎症来调控高糖诱导的肾损伤与纤维化。
有研究指出，高氧诱导的细胞胞质调节蛋白激活和ROS的产生是通过S1P转运蛋白Spns2和S1P/S1PR1，2信号轴介导的[16]。因此，我们检测了在高糖诱导的肾小管上皮细胞中S1PR1和ROS是否存在联系，在阻断S1PR1后发现ROS表达减低，提示在高糖诱导的肾小管上皮细胞中，S1P/S1PR1信号通路可以激活ROS。
另有研究报道，果糖可下调miR-330表达，增加SphK1/S1P/S1PR1/3信号通路，进而激活NF-κB/NLRP3炎症小体产生IL-1β，导致胰岛素信号通路受损[17]。同时，S1PR1可通过激活NLRP3炎症小体和IL-1β通路引起机械过敏[18]。提示S1P/S1PR1信号通路与NF-κB/NLRP3炎症小体激活具有相关性。在本研究中发现，阻断S1PR1后可抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞中NF-κB/NLRP3炎症小体的表达。而使用S1P激动剂作用于肾小管上皮细胞后，其结果与高糖刺激相同，因此我们认为S1P/S1PR1通路通过作用于ROS/NLRP3轴从而促进肾小管上皮细胞EMT的产生。
综上所述，本研究证实S1P/S1PR1信号通路在高糖刺激下表达升高，且高糖诱导NRK-52E细胞EMT的产生，其作用机制可能是S1P/S1PR1信号通路通过ROS/NLRP3轴促进NRK-52E细胞EMT进而导致肾脏纤维化。DN目前治疗较为困难，进一步研究S1P/S1PR1信号通路在肾间质纤维化中的作用机制，有望能够为糖尿病肾脏疾病提供新的治疗方向。因此，探索肾纤维化的新靶点和治疗方法对预防和治疗DN具有重要意义。
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