表1(Table 1)
结直肠癌是常见消化道恶性肿瘤，预后较差，易复发，复发后侵袭性强[1]。尽管目前切除手术、化疗、放疗等治疗方案已改善结直肠癌患者的总生存率，但患者预后情况受化疗药物不良反应或产生抗药性影响，甚至部分患者出现癌症复发或晚期转移[2]。奥沙利铂(oxaliplatin，OXA)广泛用于治疗多种恶性肿瘤，如结直肠癌、非小细胞肺癌等[3]。OXA疗效优于顺铂与卡铂，可改善部分顺铂耐药患者的治疗效果，但长期使用OXA化疗，易诱发肝窦损伤、周围神经病变、骨髓抑制和胃肠道反应等不良反应，降低患者在化疗期间的依从性，甚至可能终止治疗计划[4-5]。临床上常采用OXA与其他药物联合使用的方式以减轻OXA引起的不良反应，增强药物疗效。
AG1478是常见的特异性表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)酪氨酸激酶抑制剂，具有抗氧化、抗糖尿病和抗肿瘤等作用[6]。酪氨酸激酶广泛分布于细胞膜，EGFR为常见的酪氨酸激酶型受体，通过与配体结合，发生自身磷酸化实现激活。EGFR是一种位于细胞膜表面的糖蛋白受体，在多种肿瘤细胞中高表达，参与多种肿瘤的发生发展[7]。EGFR高表达可以诱发癌症，EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)因其可实现靶向治疗、疗效高、低毒性、高选择性等在癌症治疗中有重要意义[8]。崔珊等[9]研究发现，OXA通过抑制EGFR-MAPK信号通路促进结直肠癌细胞凋亡。本文旨在探讨AG1478联合OXA对结直肠癌HCT116细胞增殖和凋亡的影响，以期为AG1478联合OXA临床应用于抗肿瘤治疗提供数据基础与理论依据。
1 材料与仪器 1.1 细胞株人结直肠癌细胞HCT116购自中国科学院细胞库。 1.2 药物与试剂OXA(货号08390，纯度≥99%，索莱宝)；AG1478(货号HY-13524，纯度≥99%，Med Chem Express)；胎牛血清、DMEM培养基、胰蛋白酶、青-链霉素(Gibco)；MTT(货号M8180，纯度≥98%，索莱宝)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(货号P0010，碧云天生物)；总RNA提取试剂盒(货号DP419，天根生物)；cDNA合成试剂盒(货号MR05101，莫纳生物)；PCR扩增试剂盒(货号MQ10301S，莫纳生物)；PCR引物(p53、caspase-3、Bcl-2、Bax，华大基因)；ECL极敏化学发光试剂(Affinity)；一抗(p53、caspase-3、cleaved-caspase 3、Bcl-2、Bax、p62、LC3，Abcam)。
1.3 仪器全波长微孔板检测仪(Bio-Tek)；Westernblot电泳转印系统(Bio-Rad)；化学发光成像系统(Bio-Rad)；荧光倒置显微镜(OLYMPUS)；超净工作台(Esco)；恒温CO2培养箱(Thermo)；超微量紫外分光光度计(IMPLEN)；PCR逆转录仪(Bio-Rad)；荧光定量PCR仪(Bio-Rad)。
2 方法 2.1 细胞培养从液氮罐中取出HCT116结直肠癌细胞冻存管，于37 ℃水浴锅中速溶后，将冻存液转移至离心管中，离心3 min (800 r·min-1)，弃去上清，用移液枪吹打重悬，取1/3接种，在37 ℃，5% CO2条件下培养。取对数生长期细胞进行后续实验研究。
2.2 MTT法检测细胞存活率 2.2.1 OXA对HCT116细胞存活率的影响将对数生长期HCT116细胞以5×107个/L密度接种至96孔板中，每孔滴加100 μL，培养12 h后弃去原培养基，再分别加入100 μL浓度为5、10、20、30、40、50、60、70、80 mg·L-1的OXA含药培养基。加药48 h后，每孔加入10 μL浓度为5 g·L-1 MTT溶液，继续孵育4 h，用DMSO溶解活细胞内结晶，490 nm处测定吸光度。
2.2.2 AG1478对HCT116细胞存活率的影响接种方式同“2.2.1”项，培养12 h后弃去原培养基，再分别加入100 μL浓度为2、4、8、12、16、20、24、28 mg·L-1 AG1478的含药培养基培养HCT116细胞。加药48 h后，细胞活力测定方法同“2.2.1”项。
2.2.3 AG1478联合OXA对HCT116细胞存活率的影响接种方式同“2.2.1”项，培养12 h后弃去原培养基，再分别加入浓度分组为20 mg·L-1 OXA组、10 mg·L-1 AG1478组、20 mg·L-1 OXA+10 mg·L-1 AG1478组、20 mg·L-1 OXA+20 mg·L-1 AG1478组的含药培养基。加药48 h后，细胞活力测定方法同“2.2.1”项。
2.3 分组给药根据MTT实验结果分组进行后续实验：对照组(0.1% DMSO)、20 mg·L-1 OXA组、10 mg·L-1 AG1478组、20 mg·L-1 OXA+10 mg·L-1 AG1478组。
2.4 qRT-PCR法检测p53、caspase-3、Bcl-2、Bax的mRNA表达水平将HCT116细胞以2.5×108 L-1细胞密度接种于6孔板中，每孔2 mL。细胞贴壁后，细胞分组同“2.3”项。加药处理后，弃去培养基，参照试剂盒说明书完成RNA提取、cDNA合成及PCR扩增实验。引物合成由华大生物公司进行，序列见Tab 1。
| Gene | Sequence of primers |
| p53 | Forward：CCCTCCTCAGCATCTTATCC |
| Reverse：TGGTACAGTCAGAGCCAACCT | |
| caspase-3 | Forward：CAGAGGGGATCGTTGTAGAAG |
| Reverse：CCACTGTCTGTCTCAATGCC | |
| Bcl-2 | Forward：CCTTCTTTGAGTTCGGTGGG |
| Reverse：CGGTTCAGGTACTCAGTCATCC | |
| Bax | Forward：CCAGCAAACTGGTGCTCAAG |
| Reverse：CCACAAAGATGGRCACGGTC | |
| β-actin | Forward：TGACGTGGACATCCGCAAAG |
| Reverse：CTGGAAGGTGGACAGCGAGG |
接种方式同“2.4”项。细胞贴壁后，细胞分组同“2.3”项。加药处理48 h后，收集各组细胞沉淀。对细胞沉淀进行裂解提取蛋白。采用BCA试剂盒对各组蛋白进行定量，操作方案依照BCA试剂盒说明书进行。使用10% SDS-PAEG对蛋白样品(每孔10 μg)进行电泳(70 V，120 min)分离后，将凝胶上蛋白转印(260 mA，90 min)到PVDF膜上。使用5%封闭液将PVDF膜封闭2 h，一抗4 ℃孵育12 h(1 ∶1 000)，TBST快摇30 min洗脱(5次×6 min)。二抗慢摇孵育90 min(1 ∶5 000)，TBST快摇30 min洗脱(5次×6 min)。ECL化学发光法成像拍照。计算各实验分组目的蛋白表达水平。
2.6 统计学处理用SPSS 16.0软件进行数据统计分析，所有数据均用x±s表示。多组均数采用One-way ANOVA检验，组间两两比较采用LSD-t检验。
3 结果 3.1 OXA和AG1478对HCT116细胞增殖能力的影响MTT实验结果显示，不同浓度OXA、AG1478对HCT116细胞作用48 h后，与对照组对比，OXA对HCT116细胞增殖有明显抑制作用，IC50值为23.47 mg·L-1(Fig 1A)；AG1478对HCT116细胞增殖有明显抑制作用，IC50值为26.58 mg·L-1(Fig 1B)。后续研究中选择低于AG1478半数抑制浓度的剂量(10、20 mg·L-1)和低于OXA半数抑制浓度的剂量(20 mg·L-1)进行两药联合剂量研究。
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| Fig 1 Effects of OXA and AG1478 on cell viability of HCT116 cells detected by MTT assay(x±s, n=3) A: The IC50 of OXA in HCT116 cells; B: The IC50 of AG1478 in HCT116 cells.**P < 0.01 vs Control group. |
MTT实验结果显示，联合用药组与单药组存活率均明显低于对照组(P < 0.01)(Fig 2)；20 mg·L-1 OXA+10 mg·L-1 AG1478和20 mg·L-1 OXA+ 20 mg·L-1 AG1478联合用药组细胞活力低于OXA(20 mg·L-1)组和AG1478(10、20 mg·L-1)组(P < 0.01)，表明AG1478与OXA联合使用，明显降低HCT116细胞的增殖能力，联合用药对HCT116抑制作用明显高于单一药物，后续研究选择20 mg·L-1 OXA与10 mg·L-1 AG1478联合使用进一步探讨二者联合使用对HCT116细胞的影响。
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| Fig 2 Effects of AG1478 combined with OXA on cell viability of HCT116 cells(x±s, n=3) **P < 0.01 vs Control group; ##P < 0.01 vs OXA-20 group. |
使用Western blot检测细胞中LC3、p62和IL-6的蛋白表达情况(Fig 3)。与对照组比较，OXA单药组与联合用药组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、IL-6蛋白表达量均明显上调，p62蛋白表达量明显下调(P < 0.01)；与AG1478单药组比较，联合用药组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、IL-6蛋白表达量均升高，p62蛋白表达量下降(P < 0.01)；与OXA单药组比较，联合用药组IL-6蛋白表达量升高，p62蛋白表达量下降(P < 0.01)。
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| Fig 3 Effects of AG1478 combined with OXA on expression of LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ, p62, IL-6 in HCT116 cells(x±s, n=3) *P < 0.05, **P < 0.01 vs Control group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs combination group. |
使用qRT-PCR检测细胞中p53、caspase-3、Bcl-2、Bax的mRNA表达情况(Fig 4)。研究结果表明，与对照组比较，OXA与AG1478联合用药组p53、caspase-3的mRNA表达上调(P < 0.01)；与OXA单药组比较，联合用药组p53、caspase-3的mRNA均升高(P < 0.01)；与对照组比较，OXA与AG1478联合用药组Bcl-2表达下调(P < 0.01)，Bax表达上调(P < 0.01)；与OXA单药组比较，联合用药组Bcl-2明显降低(P < 0.01)，Bax明显升高(P < 0.01)。
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| Fig 4 Effects of AG1478 combined with OXA on mRNA expression of p53, caspase-3, Bcl-2, Bax in HCT116 cells(x±s, n=3) *P < 0.05, **P < 0.01 vs Control group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs combination group. |
使用Western blot检测细胞中p53、caspase-3、cleaved-caspase 3、Bcl-2、Bax的蛋白表达情况(Fig 5)。结果显示，与对照组比较，OXA与AG1478联合用药组p53、caspase-3、cleaved-caspase 3的蛋白表达上调(P < 0.01)；与OXA单药组比较，联合用药组p53、cleaved-caspase 3的蛋白表达水平升高(P < 0.01)；与对照组比较，联合用药组Bax/Bcl-2表达上调(P < 0.05)；与AG1478单药组比较，联合用药组Bax/Bcl-2明显升高(P < 0.05)。
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| Fig 5 Effects of AG1478 combined with OXA on expression of p53, caspase-3, cleaved-caspase 3, Bcl-2, Bax in HCT116 cells(x±s, n=3) *P < 0.05, **P < 0.01 vs Control group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs combination group. |
OXA作为第三代铂类抗肿瘤药，被广泛用于消化道肿瘤患者，是转移性结直肠癌一线化疗药物[10]。OXA能改善一代、二代铂类抗肿瘤药物肝肾毒作用和骨髓抑制作用，耐受性较好，与顺铂无交叉耐药，其抗肿瘤活性更高[11]。OXA是一种双功能烷基化剂，可以与DNA发生共价交联，阻断DNA的复制与转录，参与癌细胞的死亡[12-13]。OXA在国内上市后，结直肠癌患者的生存率有所提升。然而，OXA作为我国肠癌治疗的基石药物，其诱导的外周神经毒性发生率高达90%，适当降低OXA临床用药剂量，使OXA临床用药安全性得到有效保障已迫在眉睫[13]。因此，寻找与OXA联合使用，能减少OXA用药剂量同时达到治疗效果的药物具有重大意义。
AG1478是新型EGFR靶向抑制剂，AG1478抑制非小细胞肺癌、胃癌、胶质瘤等多种恶性肿瘤细胞的增殖和侵袭[14]。AG1478竞争性与EGFR结构域中ATP结合位点结合，抑制EGFR磷酸化，阻断癌细胞信号转导[15]。Yu等[16]研究表明AG1478抑制EGFR激活，同时抑制其下游PI3K/AKT信号通路与MAPK-ERK1/2信号通路。AG1478抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路，与自噬密切相关。AG1478下调Bcl-2同时上调Bax表达，激活caspase蛋白，诱导宫颈癌Hela细胞发生凋亡[17]。正常的自噬功能保证癌细胞代谢正常，减少凋亡，过度或持续发生自噬会诱导癌细胞发生自噬性死亡，炎症反应异常为自噬功能异常表现之一[18]。在癌细胞中，凋亡与自噬的功能相互影响，相互作用。本研究发现AG1478与OXA联合用药能诱导凋亡并抑制增殖，且联合用药时作用效果明显强于OXA单用药组。AG1478对OXA具有增敏作用，AG1478有望成为一种新型EGFR靶向抗肿瘤药与OXA联合使用，研究结果为AG1478联合OXA抗肿瘤临床应用提供实验数据与理论基础。
| [1] |
Basak D, Uddin M N, Hancock J. The role of oxidative stress and its counteractive utility in colorectal cancer (CRC)[J]. Cancers (Basel), 2020, 12(11): 3336. doi:10.3390/cancers12113336 |
| [2] |
Haria P D, Baheti A D, Palsetia D, et al. Follow-up of colorectal cancer and patterns of recurrence[J]. Clin Radiol, 2021, 76(12): 908-15. doi:10.1016/j.crad.2021.07.016 |
| [3] |
Kim N R, Kim Y J. Oxaliplatin regulates myeloid-derived suppressor cell-mediated immunosuppression via downregulation of nuclear factor-kappaB signaling[J]. Cancer Med, 2019, 8(1): 276-88. doi:10.1002/cam4.1878 |
| [4] |
Kang L, Tian Y, Xu S, et al. Oxaliplatin-induced peripheral neuropathy: clinical features, mechanisms, prevention and treatment[J]. J Neurol, 2021, 268(9): 3269-82. doi:10.1007/s00415-020-09942-w |
| [5] |
Salat K. Chemotherapy-induced peripheral neuropathy-part 2:focus on the prevention of oxaliplatin-induced neurotoxicity[J]. Pharmacol Rep, 2020, 72(3): 508-27. doi:10.1007/s43440-020-00106-1 |
| [6] |
Sabbah D A, Hajjo R, Sweidan K. Review on epidermal growth factor receptor (EGFR) structure, signaling pathways, interactions, and recent updates of EGFR inhibitors[J]. Curr Top Med Chem, 2020, 20(10): 815-34. doi:10.2174/1568026620666200303123102 |
| [7] |
Ju X, Yang X, Yan T, et al. EGFR inhibitor, AG1478, inhibits inflammatory infiltration and angiogenesis in mice with diabetic retinopathy[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2019, 46(1): 75-85. doi:10.1111/1440-1681.13029 |
| [8] |
Gelatti A C Z, Drilon A, Santini F C. Optimizing the sequencing of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in epidermal growth factor receptor (EGFR) mutation-positive non-small cell lung cancer (NSCLC)[J]. Lung Cancer, 2019, 9(137): 113-22. |
| [9] |
崔珊, 黄金清, 韦东雪, 等. 奥沙利铂抑制EGFR-MAPK促进HCT116细胞凋亡[J]. 中国药理学通报, 2022, 38(8): 1279-80. Cui S, Huang J Q, Wei D X, et al. Oxaliplatin inhibits EGFR-MAPK to promoto apoptosis in HCT116 cells[J]. Chin Pharmacol Bull, 2022, 38(8): 1279-80. |
| [10] |
Jahanafrooz Z, Mosafer J, Akbari M, et al. Colon cancer therapy by focusing on colon cancer stem cells and their tumor microenvironment[J]. J Cell Physiol, 2020, 235(5): 4153-66. doi:10.1002/jcp.29337 |
| [11] |
Rogers B B, Cuddahy T, Briscella C, et al. Oxaliplatin: detection and management of hypersensitivity reactions[J]. Clin J Oncol Nurs, 2019, 23(1): 68-75. |
| [12] |
Kubo K, Kimura N, Watanabe R, et al. Oxaliplatin-associated amaurosis fugax[J]. Case Rep Oncol, 2021, 14(2): 832-7. doi:10.1159/000516271 |
| [13] |
崔珊, 黄金清, 李金娣, 等. 奥沙利铂通过丝裂原活化蛋白激酶通路对直肠癌作用的研究进展[J]. 中国临床药理学杂志, 2021, 37(6): 759-63. Cui S, Huang J Q, Li J D, et al. Research progress on the role of oxaliplatin on rectal cancer through mitogen activated protein kinase pathway[J]. Chin J Clin Pharmacol, 2021, 37(6): 759-63. |
| [14] |
Chen L, Du L, Zhang L, et al. EGFR inhibitor AG1478 blocks the formation of 3D structures mainly through ERK signaling pathway in Matrigel-induced 3D reconstruction of eccrine sweat gland-like structures[J]. J Mol Histol, 2020, 51(2): 191-7. doi:10.1007/s10735-020-09869-6 |
| [15] |
梁少华, 于振海, 纪丕友. 联合应用PI-103和AG1478抑制SH-SY5Y细胞增殖并促进其凋亡[J]. 中国组织化学与细胞化学杂志, 2017, 26(5): 456-61. Liang S H, Yu Z H, Ji P Y. Inhibition of proliferation and promotion apoptosis in SH-SY5Y neuroblastoma cells by treatment with combination of PI-103 and AG1478[J]. Chin J Histochem Cytochem, 2017, 26(5): 456-61. |
| [16] |
Yu Y, Fan S M, Ye Y C, et al. The tyrphostin AG1478 augments oridonin-induced A431 cell apoptosis by blockage of JNK MAPK and enhancement of oxidative stress[J]. Free Radic Res, 2012, 46(11): 1393-405. doi:10.3109/10715762.2012.720017 |
| [17] |
马聪玲, 殷一萍, 毛婷婷. EGFR抑制剂AG1478对宫颈癌HeLa细胞凋亡的影响[J]. 实用医学杂志, 2017, 33(2): 202-5. Ma C L, Yin Y P, Mao T T. Effect of epidermal growth factor receptor inhibitor AG1478 induces cell death in HeLa cells[J]. J Pract Med, 2017, 33(2): 202-5. |
| [18] |
Young T M, Reyes C, Pasnikowski E, et al. Autophagy protects tumors from T cell-mediated cytotoxicity via inhibition of TNFα-induced apoptosis[J]. Sci Immunol, 2020, 5(54): eabb9561. |
