2. 中国科学院西北高原生物研究所，青海 西宁 810008;
3. 青海省糖脂代谢疾病防控中医药重点实验室，青海 西宁 810001
2. Northwest Institute of Plateau Biology, Chinese Academy of Sciences, Xining 810008, China;
3. Qinghai Provincial Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Research for Glucolipid Metabolic Diseases, Xining 810001, China
肥胖症是一种多因素引起的慢性代谢疾病，主要表现为脂肪过度积累[1]。研究表明，人体内脂肪积累过多会导致2型糖尿病、脂肪肝、肝癌、高脂血症等疾病[2-3]。这些病症作为慢性疾病，大多数需长期服用药物，从而引起较多的毒副作用[4]，因此，从植物中发现一些有效成分，有助于开发治疗肥胖症的天然药物，推进对肥胖及相关代谢疾病的深入研究。
紫色悬钩子(Rubus irritans Focke)是蔷薇科悬钩子属植物，《晶珠本草》中记载，紫色悬钩子的茎叶作为一种藏药，是肥胖症及糖尿病治疗药方中不可缺少的一味药材[5]。综上，紫色悬钩子具有降糖降脂的潜力，但其作用机制少有报道，因此，其降低脂质积累的药效物质基础及作用机制值得进一步探讨。
本研究利用3T3-L1前脂肪细胞进行体外实验，探究紫色悬钩子提取物对脂肪细胞脂质积累及脂质代谢水平的影响，并从分子层面检测其对过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators-activated receptor γ，PPARγ)、CCAAT增强子结合蛋白(CCAAT enhancer-binding protein α，C/EBPα)、腺苷5′-单磷酸活化蛋白激酶[adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK]及磷酸化的AMPK(p-AMPK)蛋白表达的影响。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞小鼠3T3-L1前脂肪细胞购于中国科学院上海细胞库(目录号：GNM25)。
1.1.2 药物与试剂紫色悬钩子(Rubus irritans Focke)茎叶采自青海省西宁市大通县，经青海大学医学院杨仕兵副教授鉴定为蔷薇科悬钩子属(Rubus L.)植物悬钩子的茎叶；微孔树脂填料(MCI GELⓇ CHP20P，20 μm)购自日本三菱化学公司；PBS溶液(P1020)、0.25%胰酶(T1300)、青链霉素混合液(P1400)、MTT噻唑蓝(M8180)、芦丁对照品(SR8250，含量≥98%)购自北京索莱宝科技有限公司；DMEM高糖培养基(10-013-CVRC)、胎牛血清(35-075-CV)购自美国Corning公司；生物合成人胰岛素注射液(S20191005)购自诺和诺德中国制药公司；地塞米松(Dex，D4902)、1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤(IBMX，I7018)、油红O染料(O0625)购自美国Sigma公司；总胆固醇(TC)测定试剂盒(A111-1-1)、三酰甘油(TG)测定试剂盒(A110-1-1)购自南京建成生物工程研究所；BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)(P0009)购自碧云天公司；ECL发光试剂盒(WBKLS0500)购于美国Millipore公司；PPARγ抗体(2435S)、C/EBPα抗体(2843S)、AMPK抗体(2532S)、p-AMPK抗体(2535S)购自美国CST公司。
1.1.3 主要仪器制备型高效液相色谱仪(江苏汉邦科技有限公司)；中高压色谱塔(49 mm×460 mm，北京赛希望生物科技有限公司)；酶标仪(美国BIO-TEK公司)；高速冷冻离心机(Centrifuge5430R，德国Eppendorf公司)；全自动化学发光成像系统(Tanon5200，山东灏洋实验仪器设备有限公司)；微孔板孵育振荡器(EB-9010，江苏其林贝尔仪器制造有限公司)；倒置显微镜(DMI1，德国Leica公司)；紫外分光光度计(752型，上海舜宇恒平科学仪器有限公司)。
1.2 方法 1.2.1 紫色悬钩子提取物的分离及制备称取1.0 kg干燥的紫色悬钩子茎叶，粉碎后用70%乙醇浸提3次，每次12 h，合并滤液，减压浓缩提取液，放入烘箱中至无醇味，最终得到粗提取物。用中压色谱塔对粗提取物进行预处理，将样品与聚酰胺混合拌样，混匀装入小型中压色谱塔(26 mm×100 mm)中，并与MCI中压色谱塔(49 mm×460 mm)串联。制备条件：0~90 min，0~100%甲醇梯度洗脱，90~120 min，100%甲醇等度洗脱，流速为28 mL·min-1，在210 nm波长下检测。分析条件：0~50 min，5%~100%甲醇梯度洗脱，50~70 min，100%等度洗脱，含有0.1%甲酸。流速为1 mL·min-1，在210 nm波长下检测，柱子为Kromasil C18 (5 μm)。最终得到的紫色悬钩子提取物通过紫外分光光度计测定总黄酮含量。
1.2.2 3T3-L1前脂肪细胞的培养及诱导分化3T3-L1前脂肪细胞培养在含10%胎牛血清、1%双抗的高糖培养基中，将处于对数生长期的细胞以每孔1.5×105个接种到6孔板中，每孔3 mL置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。采用经典的“鸡尾酒法”对3T3-L1前脂肪细胞进行诱导[6]，待细胞密度生长至80%左右时，用含10%FBS的高糖培养基进行接触抑制2 d，随后进行诱导分化；用含0.5 mmol·L-1 IBMX、0.1 μmol·L-1Dex、10 mg·L-1胰岛素诱导分化2 d后，换用含10 mg·L-1胰岛素的培养基处理2 d，再用完全培养基培养4 d，在诱导的第8天，观察细胞内可见85%以上的细胞呈现出成熟脂肪细胞形态，通过显微镜观察细胞内具有大小不一的脂滴。
1.2.3 细胞活力的测定将对数生长期3T3-L1细胞以每孔5×103个接种至96孔板中，每孔100 μL置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。待细胞密度至80%以上，分别加入终质量浓度为0、10、20、50、100、150、200 mg·L-1的紫色悬钩子提取物，对照组加入等体积培养基。培养24 h后，每孔加入10 μL MTT(5 g·L-1)继续培养4 h。弃去培养液，加入150 μL DMSO，置于微量振荡器在37 ℃、600 r·min-1的条件下震荡10 min，使结晶物充分溶解，在490 nm波长处测吸光度(A)值，计算存活率。同时在倒置显微镜观察各组细胞生长状况。
存活率=样品A值的平均值/对照组A值的平均值×100%。
1.2.4 油红O染色将处于对数生长期的细胞以每孔1.5×105个的密度接种到6孔板中，每孔3 mL置于37 ℃、5%CO2培养箱中，待细胞密度至80%左右时进行诱导分化，诱导过程如“1.2.2”所述，在诱导的第8天用油红O染色，弃去培养基后用4%多聚甲醛室温固定细胞1 h，再加入1 mL的油红O工作液，避光静置1 h。用75%乙醇洗涤细胞，洗去多余染料，再用ddH2O洗涤3~4次，置于显微镜下观察并拍照。
1.2.5 细胞内脂质相关指标的测定将处于对数生长期的细胞每孔1.5×105个接种到6孔板中，每孔3 mL置于37 ℃、5%CO2培养箱中，待细胞密度至80%左右时进行诱导分化，诱导过程如“1.2.2”所述，分别收集第0、2、4、8天的细胞，按照试剂盒说明书对细胞进行处理，测定细胞内TC、TG水平。
1.2.6 紫色悬钩子提取物总黄酮含量测定 1.2.6.1 标准品处理精密称量芦丁对照品10 mg用70%乙醇充分溶解，并定容至50 mL，从中吸取1 mL，置于25 mL容量瓶中定容，然后精密吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL分别置于25 mL容量瓶中，再依次加入5% NaNO2溶液1 mL，10% Al(NO3)3溶液1 mL和4% NaOH溶液10 mL，用70%乙醇定容至25 mL，摇匀备用。
1.2.6.2 样品处理精密称量紫色悬钩子提取物粉末0.1 g用70%乙醇充分溶解，并定容至50 mL，从中吸取0.5 mL，置于25 mL容量瓶中再依次加入5% NaNO2溶液1 mL，10% Al(NO3)3溶液1 mL和4% NaOH溶液10 mL，用70%乙醇定容至25 mL，摇匀备用。
1.2.6.3 标准曲线的制作将标准品依次在510 nm处测定吸光度值，以芦丁对照品溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标进行线性回归并绘制标准曲线。
1.2.7 Western blot检测相关蛋白的表达在诱导的第0、2、4、8天分别加入紫色悬钩子提取物并收集细胞，加入含有10 mg·L-1PMSF、磷酸酶抑制剂2和磷酸酶抑制剂3的细胞裂解液，提取细胞总蛋白。采用BCA法进行蛋白定量。配制10%分离胶和5%浓缩胶，每孔上样量为5 μg，进行SDS-PAGE电泳，转膜，封闭，加入相应的一抗孵育过夜，再加入二抗孵育1 h，用ECL试剂盒曝光显色，扫描图片保存。
1.2.8 统计学分析数据采用GraphPad Prism 8.0软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，实验统计数据以x±s表示。
2 结果 2.1 中压色谱塔对紫色悬钩子样品的预处理从1.0 kg紫色悬钩子的干燥茎叶中分离获得约183.5 g粗提物，提取率为18.3%。将浓缩提取物(43.0 g)和聚酰胺粉末(150.0 g)混合并干燥，研磨后加入小型中高压色谱塔(26 mm×100 mm)。MCI中压色谱柱连接制备液相色谱系统，如Fig 1所示，分别为制备色谱图(A)和分析色谱图(B)。经过3次MCI预处理后收集5个组分(Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4、Fr.5)。
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| Fig 1 Pretreatment (A) and fractions analysis chromatogram (B) of crude extract of Rubus irritans Focke by MCI medium pressure chromatography tower |
为了检测紫色悬钩子提取物对3T3-L1前脂肪细胞活力的影响，如Fig 2所示，用0、10、20、50、100、150、200 mg·L-1的5个组分处理细胞24 h。与对照组相比，当5个组分质量浓度不大于100 mg·L-1时，对细胞活力无明显影响(P>0.05)。
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| Fig 2 Effects of 5 components at different concentrations on viability of 3T3-L1 preadipocytes (x±s, n=6) *P < 0.05, **P < 0.01 vs 0 mg·L-1 |
对3T3-L1前脂肪细胞进行诱导8 d后，胞内产生大量大小不等的环形脂滴(Fig 3B、C)。为了探讨紫色悬钩子提取物对3T3-L1前脂肪细胞分化过程中脂质积累的影响，用100 mg·L-1的5个组分分别处理细胞，测定5个组分对不同分化时期细胞中TC、TG含量的影响。如Fig 4所示，与对照组相比，Fr.1能够提高TC、TG的水平，Fr.2、Fr.3、Fr.4、Fr.5能够降低TC、TG的积累(P < 0.05)，其中Fr.4作用最为明显。因此，选择Fr.1和Fr.4进行接下来的实验。
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| Fig 3 3T3-L1 preadipocytes and their morphology after differentiation and maturation A: 3T3-L1 preadipocytes; B: Induction of mature 3T3-L1 adipocytes; C: Oil red O stained mature adipocytes |
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| Fig 4 Effects of five components on lipid accumulation during differentiation of 3T3-L1 preadipocytes (x±s, n=6) *P < 0.05, **P < 0.01 vs Control. |
用油红O染色法观察脂肪细胞的分化程度。随着诱导天数的增加，细胞内TG、TC的含量也随之增加(P < 0.05)，脂肪颗粒分化成熟并呈现红色脂滴样(Fig 5)。与对照组相比，Fr.1高剂量组能够增加脂滴的数量，升高成熟脂肪细胞中TC、TG的含量，Fr.1中、低剂量组和Fr.4高、中、低剂量都能够减少脂滴的数量，降低脂肪细胞中TC、TG的含量(P < 0.05)(Fig 5B, C)。
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| Fig 5 Effects of Fr.1 and Fr.4 on accumulation of lipid droplets in mature cells and effects on TC and TG (x±s, n=3) #P < 0.05, ##P < 0.01 vs D0;*P < 0.05, **P < 0.01 vs Control. |
根据标准曲线所得的回归方程为：Ŷ=11.918 0X-0.015 2，r2=0.999 3，最终测得Fr.1总黄酮的平均含量为(7.16±0.021)%，Fr.4总黄酮的平均含量为(7.52±0.033)%。
2.6 Fr.1和Fr.4高、中、低剂量组对3T3-L1脂肪细胞脂代谢相关蛋白表达的影响3T3-L1前脂肪细胞经诱导分化为成熟脂肪细胞是一个十分复杂的过程，其中主要受到一系列因子的调控，如C/EBPα、PPARγ等，这些因子主要参与形成和保持成熟脂肪细胞的形态与功能[7]。如Fig 6所示，对照组细胞通过正常诱导分化形成成熟脂肪细胞后，在其分化过程中C/EBPα、PPARγ都有高度表达。结果表明，与对照组相比，Fr.1高剂量组能够提高C/EBPα、PPARγ蛋白的表达；Fr.1中、低剂量组和Fr.4高、中、低剂量组都能够降低C/EBPα、PPARγ蛋白的表达，且Fr.4高剂量组作用最明显(P < 0.01)。
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| Fig 6 Effect of Fr.1 and Fr.4 on expression of PPARγ, C/EBPα protein in 3T3-L1 cells (x±s, n=3) *P < 0.05, **P < 0.01 vs Control. |
据文献报道，AMPK信号通路可以调控成脂转录因子PPARγ的合成和储存[8]。因此，本研究同时检测了AMPK蛋白的表达情况，如Fig 7所示，Fr.1低剂量组和Fr.4高剂量组能够增加p-AMPK的表达(P < 0.05)，但Fr.4中、低剂量组能够降低p-AMPK的表达。以上结果表明，Fr.1低剂量组和Fr.4高剂量组可以使AMPK活化，从而降低PPARγ、C/EBPα的表达。
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| Fig 7 Effect of Fr.1 and Fr.4 on expression of p-AMPK protein in 3T3-L1 cells (x±s, n=3) *P < 0.05, **P < 0.01 vs Control. |
悬钩子属植物中含有大量的膳食纤维和酚类活性物质，能够调节脂代谢[9]。有研究发现，从红树莓中提取的覆盆子酮具有抗肥胖，抑制脂肪堆积，调节脂代谢的作用[10]。3T3-L1前脂肪细胞向脂肪细胞的转化被广泛用于评估脂肪的生成[11]。脂肪细胞中脂滴数量的增加以及TC、TG的含量的升高是导致细胞肥大的主要原因。实验结果表明，当Fr.1质量浓度>100 mg·L-1时可促进脂质的积累，但Fr.2、Fr.3、Fr.4、Fr.5都可明显降低脂质的积累(Fig 4)。当紫色悬钩子提取物处理浓度为100 mg·L-1时，与对照组相比，Fr.1能够增加TC和TG的含量(Fig 5B)；Fr.4则降低了它们的含量，并随着剂量的增加而降低(Fig 5C)。由以上结果发现，紫色悬钩子提取物可减少脂滴的形成，其中的药效物质基础还需进一步实验进行研究讨论。
在3T3-L1前脂肪细胞分化的过程中，脂肪因子起着重要的调控作用，并且随着细胞的分化，脂肪因子的表达也会发生变化[12]。PPARγ和C/EBPα在前脂肪细胞中的表达较低，而在成熟的脂肪细胞或组织中表达可明显增高[13]，通过调节PPARγ和C/EBPα的表达，可以调控分化过程的脂肪特异性因子FAS的表达变化，从而调节脂肪细胞的分化[14]。已有研究表明，PPARγ信号通路能够调控3T3-L1前脂肪细胞的分化过程，并且PPARγ被用于筛选治疗肥胖药物的潜在靶标[15]。在这个过程中，为了进一步探究其对脂代谢的分子机制，本研究利用Western blot技术检测了PPARγ信号通路相关蛋白的表达。结果发现，与对照组相比，Fr.1对PPARγ、C/EBPα蛋白的表达呈现高剂量促进，低剂量抑制的趋势，而Fr.4高、中、低剂量组都能够降低PPARγ、C/EBPα蛋白的表达(Fig 6)。因此，紫色悬钩子提取物降低细胞内脂质水平，减少细胞中脂滴的积累可能是通过抑制PPARγ通路相关蛋白实现的。但是还有可能通过其他因素调控脂肪细胞中脂质的生成，这些将在后期实验中进一步研究验证。
有文献报道，通过上调AMPK信号途径相关蛋白的表达可以抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化[16]。AMPK做为细胞的能量传感器，是能量及脂质代谢的潜在靶标[17]。本研究中发现，Fr.1低剂量组和Fr.4高剂量组能够激活AMPK，增加p-AMPK的表达(Fig 7)，并且有文献报道，AMPK可以通过抑制PPARγ调控脂肪的合成及储存[18]，说明Fr.1低剂量组和Fr.4高剂量组可能是通过激活AMPK来抑制脂质生成的相关蛋白的表达，从而调节细胞中脂滴的积累。
综上所述，紫色悬钩子提取物能够降低3T3-L1脂肪细胞中脂质的水平，改善细胞中脂质的积累。探讨其潜在的机制，这可能与其降低PPARγ、C/EBPα的表达有关，并且是通过激活AMPK而发挥作用的。本研究初步阐明了紫色悬钩子提取物对脂质代谢的机制，为后续紫色悬钩子提取物中降脂药效机制研究奠定理论基础，提供科学依据，此外，紫色悬钩子提取物是否调控其他脂代谢途径需要进一步探索。
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