表1(Table 1)
2. 安徽医科大学第二附属医院药物临床试验研究中心，安徽 合肥 230601;
3. 安徽理工大学第一附属医院，安徽 淮南 232001
2. Dept of Clinical Pharmacology, the Second Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230601, China;
3. The First Hospital of Anhui University of Science & Technology, Huainan, Anhui 232001, China
肝纤维化(hepatic fibrosis，HF)是慢性肝病的共有病理基础，严重影响患者的身体健康和生活质量，因此阐明肝纤维化发病机制，积极进行肝纤维化治疗十分必要[1]。HF与细胞外基质在肝脏中弥漫性过度沉积与异常分布有关[2]。肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)是细胞外基质的主要来源细胞，HSCs的活化是HF发生发展的关键因素[3]。N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine，m6A)修饰是在哺乳动物中mRNA生物发生的可逆且高度动态的表观遗传修饰，我们前期研究发现，m6A修饰在HF中扮演重要角色[4]。m6A修饰作为表观遗传学研究的重要内容之一，其在不改变碱基序列的前提下，能够影响mRNA的代谢并调控RNA的转录、输出、剪接、降解和翻译[5-6]。
阅读蛋白(readers)是一种RNA结合蛋白，能与特定的、发生m6A修饰的mRNA结合后影响其特定的生物学功能[7]。m6A-甲基化的各种转录后结果依赖于其阅读蛋白，文献表明m6A阅读蛋白YTHDF家族在癌症、发育、细胞分化等过程中发挥了核心作用[7-8]。其中，YTHDF2作为一个重要阅读蛋白，在其C端存在一个m6A识别结构域(YTH domain)，具有特异性地识别并降解结合m6A修饰的RNA的潜力[9]。YTHDF2在各类癌症中研究比较多，而在HF中的调控作用尤其对HSCs活化增殖与迁移的作用尚不清楚，有待进一步探究。因此，阐明YTHDF2对HSCs活化增殖和HF的影响具有重要意义，为临床防治HF提供新的靶点和理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞株大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)购自武汉普诺赛生命科技有限公司。
1.1.2 试剂DMEM培养基(Hyclone，SH30243)、胎牛血清(Gibco，10270-106)；TGF-β1(Peprotech，1020209)；胰蛋白酶(Multicell，325-043-EL)；PEI 40 K(Servicebio，G1802-1ML)；Transwell小室(Corning)；RIAP裂解液(Beyotime，P0013B)；Edu(Ribobio，C10310-1)；CCK-8试剂盒(Beyotime，C0038)；BCA试剂盒(Beyotime，P0012)；TRIzol(Invitrogen，15596018)；逆转录和RT-qPCR试剂盒(Accurate Biology)；DEPC水(Biosharp，BL510A)；亚甲基蓝溶液(Solarbio，G1300)；qPCR引物由上海生工公司合成，基因序列见Tab 1；Anti-GAPDH(Affinity，AF7021)、Anti-m6A(Proteintech，#202003)、Anti-α-SMA(Proteintech，23081-1-AP)、Anti-Collagen Ⅰ(Proteintech，14695-1-AP)、Anti-YTHDF2(Proteintech，24744-1-AP)；Goat anti-Rabbit IgG (H+L) HRP(Bioworld，BS13278)。
| Primer name | Forward | Reverse |
| YTHDF2 | 5′-GTTGCGCAGATTTTGGGTGT-3′ | 5′-TGGTACTGGAGTGATGCTCG-3′ |
| Collagen Ⅰ | 5′-GCAATGCTGAATCGTCCCAC-3′ | 5′-CAGCACAGGCCCTCAAAAAC-3′ |
| α-SMA | 5′-GGCATCCACGAAACCACCTA-3′ | 5′-GTATGCGTGTGACGGCTCTA-3′ |
| GAPDH | 5′-CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG-3′ | 5′-GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT-3′ |
| si-YTHDF2 | 5′-GCCCUAUCUAACUUCUUAUTT-3′ | 5′-AUAAGAAGUUAGAUAGGGCTT-3′ |
细胞培养超净工作台(苏州净化)；高压灭菌锅(上海博迅)；CO2培养箱(Thermo)；低温离心机(Eppendorf)；酶标仪(Varioskan LUX)；实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad)；激光共聚焦显微镜(Carl Zeiss)。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养商业性获得HSC-T6细胞在10%胎牛血清的高糖培养基中、在5%CO2环境中37 ℃培养。1~2 d更换1次培养基，当细胞达到70%~80%汇合度时，将其用于实验。
1.2.2 HSCs活化消化培养瓶中的HSC-T6细胞按照30%的密度接种于6孔板中，4 h后待细胞贴壁后，使用含有5 μg·L-1 TGF-β1的无血清DMEM培养基培养24 h。
1.2.3 YTHDF2-siRNA转染使用5 μg·L-1 TGF-β1作用HSC-T6细胞24 h，诱导活化，通过PEI 40 K转染YTHDF2 siRNA和阴性对照siRNA，24 h后可用于后续实验。
1.2.4 m6A dot blot分离细胞的总RNA并纯化Poly(A)+ RNA或基因组DNA，65 ℃混合变性5 min。样品(400、200 ng)分别点在带正电尼龙膜上。紫外交联45 min，0.02%亚甲蓝染色。用5%脱脂牛奶阻断1 h后，4 ℃与m6A抗体孵育过夜，室温孵育二抗2 h。使用ECL成像系统拍摄，蓝点显示的是输入RNA的量，以消除mRNA的差异。
1.2.5 Western blot收集细胞并再RIPA裂解缓冲液中溶解，使用BCA蛋白测定法测定蛋白浓度。SDS-PAGE蛋白电泳，并转移到有PVDF膜的电泳仪上。膜与特异性一抗在4 ℃孵育过夜。用ECL检测试剂显示条带。使用ImageJ软件、用GAPDH控制进行密度定量分析。
1.2.6 RT-qPCR逆转录和qPCR详细步骤按试剂盒说明书操作，从细胞中提取总RNA进行逆转录，然后使用CFX96实时PCR系统进行PCR扩增。PCR引物序列见Tab 1。基因标准化GAPDH作为内部对照，结果采用2-ΔΔCt法计算。
1.2.7 CCK-8将2 000个细胞/孔接种到96孔培养板中，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养4 h贴壁后，使用si-RNA转染，每组设置6个复孔。转染24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续培养3 h，使用酶标仪在450 nm波长下检测吸光度。增殖率＝(实验组－空白对照)/(阴性对照－空白对照)×100%，实验重复3次。
1.2.8 Edu染色以每孔约4 000个细胞接种于24孔板中，按分组处理。按1 ∶1 000用完全培养基稀释制备适量Edu培养基，每孔加入500 μL，在培养箱中孵育2 h。4%多聚甲醛室温固定2 h，再用0.5% TritonX-100通透15 min，然后加入300 μL apolloⓇ反应缓冲液对Edu进行染色，最后用Hoechst 33342染色细胞核。染色完成后，立即使用激光共聚焦显微镜观测荧光差异。
1.2.9 细胞划痕实验将细胞接种在6孔板中，待细胞达到汇合状态时，使用无菌200 μL枪头尖端进行划痕。然后加入无血清的DMEM培养基以排除血清对细胞迁移的潜在影响，置于37 ℃的5% CO2培养箱中培养。用倒置显微镜分别观察0和48 h伤口宽度的变化，并使用ImageJ对划痕面积进行统计。
1.2.10 Transwell细胞迁移实验Transwell小室加入DMEM活化1 h，将100 μL含有2×105细胞的细胞悬液接种到上室，并将10% FBS培养基1 mL添加到下室。孵育30 h，用4%多聚甲醛室温固定30 min，再用0.1%结晶紫溶液室温下染色20 min。然后擦掉小室内膜上的细胞，在倒置显微镜下观察结果，每孔任意选择5个视野进行拍照，用ImageJ进行计数分析，每组取3个复孔，取平均值。
1.2.11 统计学分析所以数据采用GraphPad Prism 9.0进行分析，数据以x±s表示，组间差异采用单因素方差分析。
2 结果 2.1 YTHDF2在HSCs中的表达如Fig 1所示，与对照组相比，TGF-β1刺激HSCs后，YTHDF2 mRNA和蛋白水平均明显升高(P < 0.05)；与si-NC组相比，使用si-YTHDF2质粒转染后，YTHDF2 mRNA和蛋白水平均明显下降(P < 0.05)，提示YTHDF2被沉默。
|
| Fig 1 Expression of YTHDF2 in each group (x±s, n=3) 1:Control; 2:TGF-β1;3:TGF-β1+si-NC; 4:TGF-β1+si-YTHDF2. A: qPCR of YTHDF2;B: Western blot of YTHDF2, **P < 0.01 vs Control group. ##P < 0.01 vs TGF-β1+ si-NC group. |
Dot blot结果显示(Fig 2)，与Control组相比，TGF-β1刺激后m6A水平明显升高(P < 0.05)，与NC组相比，YTHDF2沉默后m6A水平明显降低(P < 0.05)，提示在HSCs活化时m6A水平升高，且可被YTHDF2沉默所抑制。
|
| Fig 2 Changes of m6A level in HSCs 1:Control; 2:TGF-β1;3:TGF-β1+si-NC; 4:TGF-β1+si-YTHDF2, RNAs were serially diluted and loaded equally with the amount of 400 ng and 200 ng (n=3). And methylene blue staining (right) served as a loading Control. |
RT-qPCR(Fig 3A)和Western blot(Fig 3B)结果显示：TGF-β1刺激HSCs活化后，Collagen Ⅰ、α-SMA水平明显升高(P < 0.05)；而YTHDF2沉默后，Collagen Ⅰ、α-SMA表达明显被抑制(P < 0.05)，提示YTHDF2可调控Collagen Ⅰ、α-SMA的表达。
|
| Fig 3 Effect of YTHDF2 on expression of collagen l, α-SMA (x±s, n=3) 1:Control; 2:TGF-β1;3:TGF-β1+si-NC; 4:TGF-β1+si-YTHDF2, A: qPCR of Collagen Ⅰ and α-SMA; B: Western blot of Collagen Ⅰ and α-SMA, **P < 0.01 vs Control group. #P < 0.05, ##P < 0.01 vs TGF-β1+ si-NC group. |
CCK-8和Edu用于检测细胞增殖能力。CCK-8结果显示(Fig 4A)，与Control组相比，TGF-β1刺激后明显促进HSCs增殖活性(P < 0.05)，而YTHDF2沉默后，细胞增殖活性明显被抑制。同时，Edu结果也提示同样的细胞增殖趋势(Fig 4B)，YTHDF2沉默可逆转TGF-β1活化引起的细胞增殖能力(P < 0.05)，提示沉默YTHDF2会抑制HSCs增殖活性。
|
| Fig 4 Effect of YTHDF2 on proliferation activity of HSCs 1:Control; 2:TGF-β1;3:TGF-β1+si-NC; 4:TGF-β1+si-YTHDF2, A: The results of CCK-8 assay of HSCs (x±s, n=6); **P < 0.01 vs Control group, ##P < 0.01 vs TGF-β1+ si-NC group; B: Representative Edu images of HSCs (n=3). |
细胞划痕和Transwell迁移实验用于检测细胞迁移能力。结果如Fig 5所示，与Control组相比，TGF-β1刺激后，HSCs迁移能力明显升高(P < 0.05)；而与si-NC组相比，使用si-YTHDF2质粒转染后，细胞迁移能力明显下降(P < 0.05)，提示沉默YTHDF2会抑制HSCs的迁移能力。
|
| Fig 5 Effect of YTHDF2 on migration ability of HSCs (x±s, n=6) 1:Control; 2:TGF-β1;3:TGF-β1+si-NC; 4:TGF-β1+si-YTHDF2, A: Wound healing of HSCs in various groups (×200); B: Migration of HSCs in various groups (×200); **P < 0.01 vs Control group, ##P < 0.01 vs TGF-β1+ si-NC group. |
越来越多的实验表明，阅读蛋白YTHDF2在各种疾病进展中发挥重要作用[10-11]。Yang等[12]研究发现，YTHDF2在肝癌组织中明显高表达，且YTHDF2表达过高对肝癌患者生存预后不利，是促癌因素。在本研究中，我们发现，与对照组相比较，TGF-β1刺激HSCs活化后YTHDF2表达水平明显升高，而在YTHDF2沉默后明显降低。研究表明，YTHDF2通常以m6A依赖的方式起作用[13]。我们的实验结果也揭示了这一点：我们观察到在TGF-β1诱导HSCs活化后，HSCs总mRNA的m6A水平明显增加，同时将YTHDF2沉默后与NC组进行比较，m6A水平明显被抑制，YTHDF2与m6A水平变化呈正相关。
为了进一步分析YTHDF2与HF的关系，我们使用5 μg·L-1 TGF-β1诱导HSCs活化，建立体外HSCs活化增殖模型，检测了纤维化的关键指标Collagen Ⅰ和α-SMA的变化，结果显示5 μg·L-1 TGF-β1刺激HSCs活化后，Collagen Ⅰ和α-SMA的表达均升高，YTHDF2沉默明显降低了Collagen Ⅰ和α-SMA的表达。增殖和迁移是HSCs活化的重要特征[14]，本文通过CCK-8、划痕以及Transwell等实验结果发现，TGF-β1刺激后HSCs的增殖和迁移能力明显增强，沉默YTHDF2后逆转了这种效应，进一步表明了YTHDF2可促进HSCs的活化。但YTHDF2调控HSCs增殖和迁移的机制有待进一步研究。众所周知，YTHDF2通过结合m6A甲基化转录物发挥作用，我们推测高表达YTHDF2可能通过促进某些纤维化基因相应靶标mRNA的降解或翻译，促进HSCs增殖和迁移，进而促进肝纤维化的发生发展。
综上所述，在TGF-β1诱导HSCs活化后，m6A水平明显升高，m6A甲基化修饰阅读蛋白YTHDF2特异性高表达，沉默YTHDF2能抑制α-SMA和Collagen Ⅰ的表达，同时抑制HSCs的增殖和迁移能力。提示YTHDF2可能通过调控m6A水平促进肝星状细胞活化增殖和迁移能力，进而促进肝纤维化的发生和发展。后期我们将继续研究YTHDF2是如何通过其下游靶点来发挥这种促纤维化作用的，以进一步阐明YTHDF2通过m6A依赖的方式调控HF进展的潜在机制，以期为HF的临床治疗提供新的理论依据和治疗靶点。
| [1] |
尤鸿美, 王凌, 卜芳田, 等. MicroRNAs在肝纤维化进展中的作用[J]. 中国药理学通报, 2021, 37(2): 171-5. You H M, Wang L, Bu F T, et al. The role of microRNAs in progress of liver fibrosis[J]. Chin Pharmacol Bull, 2021, 37(2): 171-5. |
| [2] |
Fondevila M F, Fernandez U, Heras V, et al. Inhibition of carnitine palmitoyltransferase 1A in hepatic stellate cells protects against fibrosis[J]. J Hepatol, 2022, 77(1): 15-28. doi:10.1016/j.jhep.2022.02.003 |
| [3] |
Trivedi P, Wang S, Friedman S L. The power of plasticity-metabolic regulation of hepatic stellate cells[J]. Cell Metab, 2021, 33(2): 242-57. doi:10.1016/j.cmet.2020.10.026 |
| [4] |
Yang J-J, Wang J, Yang Y, et al. ALKBH5 ameliorated liver fibrosis and suppressed HSCs activation via triggering PTCH1 activation in an m6A dependent manner[J]. Eur J Pharmacol, 2022, 922: 174900. doi:10.1016/j.ejphar.2022.174900 |
| [5] |
Shi H, Wei J, He C. Where, when, and how: context-dependent functions of RNA methylation writers, readers, and erasers[J]. Mol Cell, 2019, 74(4): 640-50. doi:10.1016/j.molcel.2019.04.025 |
| [6] |
Ruan F, Zeng J, Yin H, et al. RNA m6A modification alteration by black phosphorus quantum dots regulates cell ferroptosis: implications for nanotoxicological assessment[J]. Small Methods, 2021, 5(3): e2001045. doi:10.1002/smtd.202001045 |
| [7] |
Zaccara S, Jaffrey S R. A unified model for the function of YTHDF proteins in regulating mA-modified mRNA[J]. Cell, 2020, 181(7): 1582-95.e18. doi:10.1016/j.cell.2020.05.012 |
| [8] |
Liu R, Jia Y, Kong G, et al. Novel insights into roles of N6-methyladenosine reader YTHDF2 in cancer progression[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2022, 148(9): 2215-30. doi:10.1007/s00432-022-04134-7 |
| [9] |
Hou G, Zhao X, Li L, et al. SUMOylation of YTHDF2 promotes mRNA degradation and cancer progression by increasing its binding affinity with m6A-modified mRNAs[J]. Nucleic Acids Res, 2021, 49(5): 2859-77. doi:10.1093/nar/gkab065 |
| [10] |
Wang W, Shao F, Yang X, et al. METTL3 promotes tumour development by decreasing APC expression mediated by APC mRNA N-methyladenosine-dependent YTHDF binding[J]. Nat Commun, 2021, 12(1): 3803. doi:10.1038/s41467-021-23501-5 |
| [11] |
Li J, Xie H, Ying Y, et al. YTHDF2 mediates the mRNA degradation of the tumor suppressors to induce AKT phosphorylation in N6-methyladenosine-dependent way in prostate cancer[J]. Mol Cancer, 2020, 19(1): 152. doi:10.1186/s12943-020-01267-6 |
| [12] |
Yang Z, Li J, Feng G, et al. MicroRNA-145 modulates -methyladenosine levels by targeting the 3′-untranslated mRNA region of the -methyladenosine binding YTH domain family 2 protein[J]. J Biol Chem, 2017, 292(9): 3614-23. doi:10.1074/jbc.M116.749689 |
| [13] |
Zhang C, Huang S, Zhuang H, et al. YTHDF2 promotes the liver cancer stem cell phenotype and cancer metastasis by regulating OCT4 expression via m6A RNA methylation[J]. Oncogene, 2020, 39(23): 4507-18. doi:10.1038/s41388-020-1303-7 |
| [14] |
Liu X, Xu J, Rosenthal S, et al. Identification of lineage-specific transcription factors that prevent activation of hepatic stellate cells and promote fibrosis resolution[J]. Gastroenterology, 2020, 158(6): 1728-44. doi:10.1053/j.gastro.2020.01.027 |
