2. 武汉大学人民医院药学部，湖北 武汉 430060
2. Dept of Pharmacy, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, China
胃癌(gastric cancer)是一种全球性的常见恶性疾病[1]。据估计，每年新增病例超过100万例，是全球第五大确诊恶性肿瘤[2]。因其诊断常处于晚期，死亡率高，也是癌症相关死亡的第三大常见原因[2]。目前，胃癌的治疗主要以手术、放化疗、靶向药物治疗相结合的综合治疗。同时，研究开发预防胃癌复发和转移的有效药物也成为了推动癌症治疗的重大挑战[3]。
传统中医药已实践数千年，随着我国相关政策与研究的大力开展，目前被广泛接受作为癌症的替代治疗[4-5]。高良姜素(galangin，GLA)是一种无毒的黄酮类化合物，又称高良姜黄素，主要从姜科植物高良姜(Alpinia officinarum Hance)根中提取，已知具有多种治疗应用[6]。研究显示，GLA对于多种恶性肿瘤展现出明显的抑制作用[6-7]。此前，研究发现，GLA联合阿帕替尼可以抑制胃癌SGC-7901细胞株增殖、迁移和侵袭，并能诱导细胞凋亡[8]。但根据“治未病”、“既病防变”等中医学理论，进一步探讨GLA预防胃癌复发和转移的机制也是迫在眉睫的。
上皮间质转化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程[9]，已成为胃癌发生、发展及治疗的研究热点。相关研究报道，GLA可通过抑制EMT进程进而抑制肾细胞癌细胞侵袭[10]。
本研究中，采用氯化钴(CoCl2)诱导，体外模拟肿瘤缺氧微环境，使HIF-1α在细胞中累积，并通过研究GLA对HIF-1α的影响，探讨其对胃癌SGC-7901细胞株上皮间质转化的抑制作用。
1 材料与方法 1.1 主要试剂CoCl2(CAS：7646-79-9)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；GLA(CAS：548-83-4)购自武汉华联科生物技术有限公司；细胞培养等相关试剂均使用Gibco品牌，购买于赛默飞世尔科技(中国)有限公司；HIF-1α、Snail、Vimentin、E-cadherin和β-actin等抗体使用CST品牌，购买自武汉华联科生物技术有限公司；Matrigel基质胶、逆转录及qPCR反应试剂盒购买自翌圣生物科技(上海)股份有限公司；TRIzol®试剂购买自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；其余实验使用相应试剂均可在相关公司或代理商处购买。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养人胃癌SGC-7901细胞株由武汉协和医院中心实验室传代冻存，细胞复苏后培养于含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素溶液的DMEM培养液中。培养孵箱设为5% CO2，37 ℃，饱和湿度。当细胞密度达80%~90%后，可进行传代培养。使用PBS清洗细胞，随后加入消化液(0.25% Trypsin-0.53 mmol·L-1 EDTA)在37 ℃培养箱中消化孵育细胞1~2 min；加入培养液终止消化后，1 000 r·min-1离心8 min，弃上清，收集细胞；使用含胎牛的培养基重悬细胞，并进行分瓶培养。所有实验研究均采用对数生长期细胞。
1.2.2 细胞活力分析SGC-7901细胞(5×103/孔)接种于96孔板，37 ℃孵育至细胞贴壁。其后，使用50~250 μmol·L-1浓度的CoCl2处理细胞，并加或不加不同浓度的GLA用于细胞孵育。试剂诱导与治疗后，在每孔中加入20 μL CCK-8溶液，继续孵育2 h。最后使用酶标仪检测在450 nm处的吸光度(OD)，并计算细胞生存率/%=(实验组OD值-本底OD值)/(对照组OD值-本底OD值)×100%。
1.2.3 Transwell侵袭分析各组处理后的SGC-7901细胞经消化离心后，弃上清，制备成不含胎牛的2×108 L-1细胞混悬液。取100 μL细胞混悬液注入至涂有Matrigel基质胶的Transwell小室上层(通透膜孔径8 μm)。小室被置于24孔细胞培养板中，下室加入600 μL含10%胎牛血清的DMEM培养液。细胞培养24 h后，取出小室，用无菌棉签去除非入侵细胞，4%多聚甲醛室温固定细胞30 min。再用0.1%结晶紫溶液染色5 min，除去多余染液，在高倍显微镜观察随机视野并拍照计数。
1.2.4 Western blot分析使用RIPA裂解缓冲液提取收集的不同组别中SGC-7901细胞的总蛋白。用BCA测定法测定蛋白质浓度，并使用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质样品(40 μg/孔)。随后，冰浴按300 mA恒流转印蛋白条带至PVDF膜上。携带蛋白条带的PVDF膜在5 % 脱脂牛奶中室温条件，封闭处理1 h。其后，分别与稀释后的抗HIF-1α(1 ∶ 1 000)、Snail(1 ∶ 1 000)、Vimentin(1 ∶ 1 000)、E-cadherin(1 ∶ 1 000)和β-actin(1 ∶ 1 000)抗体4 ℃过夜孵育。最后，用稀释后的二抗孵育液(1 ∶ 10 000)室温孵育1 h。加入ECL溶液后，用凝胶成像仪实现蛋白印迹的可视化。使ImageJ分析蛋白质条带的灰度值，并计算每种蛋白质的相对表达水平。
1.2.5 逆转录定量PCR(RT-qPCR)分析收集不同分组的SGC-7901细胞，用TRIzol®试剂提取细胞总RNA。使用逆转录试剂盒遵照试剂说明合成cDNA。采用ABI 7500 Real-Time PCR仪，按照qPCR反应试剂盒说明书的进行PCR扩增(引物序列，如Tab 1)(扩增条件为，95 ℃ 5 min，(95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s) 40个循环)。以β-actin为内参进行归一化处理，采用2-ΔΔCt法计算基因相对表达水平。
| Gene | Forward (5′→3′) | Reverse (3′→5′) |
| HIF-1α | GTCTGCAACATGGAA GGTATTG | GCAGGTCATAGGTGGT TTCT |
| Snail | CAGATGAGGACAGTG GGAAAG | CCAAGGAAGAGACTG AAGTAGA |
| Vimentin | CCTGAACCTGAGGGA AACTAAT | CGTTGATAACCTGTCC ATCTCT |
| E-cadherin | TCGACAAAGGACAGC CTATTT | TGTGGGTTATGAAAC CGTAGAG |
| β-actin | GGCATTCACGAGACC ACCTAC | CGACATGACGTTGTT GGCATAC |
实验结果均采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析，实验数据用x±s表示，组间的比较则采用单因素方差分析(One-way ANOVA)及Tukey事后检验。
2 结果 2.1 CoCl2和GLA作用浓度筛选研究通过CCK-8细胞活性检测法，使用不同浓度的CoCl2处理SGC-7901细胞，筛选合适浓度的CoCl2进行后续诱导处理。结果如Fig 1所示，加入CoCl2后，SGC-7901细胞的活力随CoCl2浓度增加明显下降(P < 0.01)。结合细胞状态，选择CoCl2浓度100 μmol·L-1(细胞活力为76.6%±1.12%，n=3)作为模型组继续诱导实验。
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| Fig 1 CoCl2 interfered with SGC-7901 cell viability **P < 0.01 vs Control group |
在100 μmol·L-1 CoCl2诱导作为缺氧模型组的基础上，加入25~150 μmol·L-1的GLA处理细胞，通过CCK-8检测法，选择细胞活力有差异的处理浓度进行研究。结果如Fig 2所示，使用25 μmol·L-1和50 μmol·L-1 GLA处理细胞后，细胞活力较为相近，分别为71.1%±0.47%(n=3)和69.1%±0.68%(n=3)。并结合细胞状态，因此，选择GLA浓度50、100、150 μmol·L-1分别为GLA的低、中、高浓度进行后续研究。
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| Fig 2 Cell viability of SGC-7901 cells induced by CoCl2 treatment with GLA A: The cell vitality histogram. **P < 0.01 vs Control group, ##P < 0.01 vs Model group; B: Representative photos of cell growth. |
CoCl2诱导缺氧造模后，通过Transwell试验评估细胞侵袭能力，结果如Fig 3所示。与Control组相比，CoCl2诱导后(Model)细胞的侵袭数明显增加(P < 0.01)；与Model组相比，加入低、中、高浓度GLA后，细胞的侵袭率随GLA浓度增加逐渐下降，且差异具有显著性(P < 0.01)。说明缺氧条件可以促进SGC7901细胞的侵袭，而GLA的处理可以抑制癌细胞侵袭。
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| Fig 3 GLA inhibited CoCl2-induced invasion of SGC-7901 cells A: The cell invasion histogram. **P < 0.01 vs Control group, ##P < 0.01 vs Model group; B: Representative photos of cell invasion. |
结果如Fig 4所示，CoCl2诱导缺氧造模后，与Control组相比，SGC7901细胞中HIF-1α mRNA表达略有增加，但差异无显著性；而Snail和Vimentin的mRNA水平明显增加(P < 0.01)，E-cadherin mRNA水平明显下降(P < 0.01)。加入低、中、高浓度GLA后，细胞中HIF-1α的表达无变化；Snail和Vimentin的表达随GLA浓度的增加逐渐下降，而E-cadherin的表达随GLA浓度的增加逐渐上升，且当GLA浓度为100 μmol·L-1时，差异均有显著性(P < 0.05)。
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| Fig 4 GLA affected CoCl2-induced mRNA expression of genes related to EMT in SGC-7901 cells **P < 0.01 vs Control group, #P < 0.05, ##P < 0.01 vs Model group. |
Western blot检测相关基因蛋白水平，结果如Fig 5。CoCl2诱导缺氧造模后，与Control组相比，SGC-7901细胞的HIF-1α、Snail和Vimentin的蛋白水平明显增加(P < 0.01)，E-cadherin的蛋白水平明显下降(P < 0.01)。而加入GLA后，细胞中HIF-1α、Snail和Vimentin的蛋白表达随GLA浓度的增加逐渐减少，E-cadherin的蛋白表达随GLA浓度的增加逐渐提高，且当GLA浓度为50 μmol·L-1时，差异均有显著性(P < 0.05)。
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| Fig 5 GLA affected CoCl2-induced protein expression of genes related to EMT in SGC-7901 cells A: Representative bands of different proteins; B: Semi-quantitative histogram of protein bands. **P < 0.01 vs Control group, #P < 0.05, ##P < 0.01 vs Model group. |
胃癌是人类最常见的消化道恶性肿瘤之一，严重危害了人类的健康[11]。手术目前被认为是唯一的根治性治疗方法。然而，新辅助放化疗、分子靶向治疗、免疫治疗相结合及一些辅助药物开发呈了推动胃癌研究的主要方向。
值得关注的是，缺氧微环境是实体肿瘤的主要特征之一，可促进肿瘤的进程和转移[12]。同时，由于肿瘤微环境低氧，缺氧依赖的HIF-1α激活在协调先天和适应性抗肿瘤免疫反应的抑制中起着关键作用[13]。研究发现，与正常组织相比，HIF-1α在胃癌组织中存在过表达现象[14]。在本研究中，通过对CoCl2诱导模拟的缺氧胃癌细胞中HIF-1α表达水平检测发现，CoCl2诱导后，HIF-1α转录水平无明显变化，而蛋白表达水平明显提高，这与之前研究报道的趋势是一致的。
另外，研究揭示，缺氧可诱导肿瘤细胞EMT进程，使上皮细胞具有较高的迁移、侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质的能力[9]。其中，HIF-1α作为促进肿瘤细胞EMT的关键转录因子，通过参与多种靶基因的转录调控，影响肿瘤细胞能量代谢、增殖和凋亡，使细胞及组织产生一系列反应，以适应缺氧环境，同时增加肿瘤自身的侵袭性及对放、化疗的抵抗性，已成为肿瘤发生、发展及治疗的研究热点。HIF-1α的过表达可导致细胞黏附性丧失，抑制E-cadherin表达，提高间充质标记物Vimentin的获得，细胞运动性和侵袭性增加[15]。Chen等[16]在最新的报道中提出，过表达BHLHE41可通过调控HIF-1α/EMT通路减轻缺氧诱导结肠癌的恶性进程，并通过体内外研究证明其推论。在本研究中，胃癌细胞SGC-7901受CoCl2诱导干预后，伴随着HIF-1α蛋白表达水平的提高，E-cadherin表达水平被明显抑制，相反Snail和vimentin的表达增多，这与上述研究结果相似。
GLA作为一种鲜为人知的黄酮类化合物，已经被研究学者们初步证明是一种有潜在价值的癌症预防治疗药物[6]。例如，通过对食管癌细胞生长、细胞周期阻滞和细胞内活性氧水平检测发现，高良姜素联合小檗碱在体内外均表现出明显的协同抗癌作用[17]。本研究在CoCl2诱导SGC-7901胃癌细胞缺氧的基础上对GLA单独作用进行探讨。结果显示，GLA对胃癌细胞生长和侵袭具有明显的抑制作用，这与之前Liang等[18]对GLA的研究结果保持一致。重要的是，在后续的研究中，我们初步发现了GLA可明显抑制由于缺氧所导致的HIF-1α表达升高和EMT标志物表达异常。
综上所述，GLA可抑制肿瘤缺氧状态下HIF-1α过表达和EMT，抑制胃癌细胞的增殖和侵袭，从而抑制胃癌发展。未来，将关于GLA对肿瘤缺氧状态下HIF-1α过表达和EMT的作用机制在体内动物模型中做进一步验证。
| [1] |
Sung H, Ferlay J, Siegel R L, et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J]. CA Cancer J Clin, 2021, 71(3): 209-49. doi:10.3322/caac.21660 |
| [2] |
Smyth E C, Nilsson M, Grabsch H I, et al. Gastric cancer[J]. Lancet, 2020, 396(10251): 635-48. doi:10.1016/S0140-6736(20)31288-5 |
| [3] |
Johnston F M, Beckman M. Updates on management of gastric cancer[J]. Curr Oncol Rep, 2019, 21(8): 67. doi:10.1007/s11912-019-0820-4 |
| [4] |
Xiang Y, Guo Z, Zhu P, et al. Traditional Chinese Medicine as a cancer treatment: Modern perspectives of ancient but advanced science[J]. Cancer Med, 2019, 8(5): 1958-75. doi:10.1002/cam4.2108 |
| [5] |
胡灿, 金建伟, 陆仲夏, 等. 血根碱抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖、迁移和细胞周期的研究[J]. 中国药理学通报, 2019, 35(6): 844-9. Hu C, Jin J W, Lu Z X, et al. Sanguinarine inhibits proliferation, migration and cell cycle of human gastric cancer SGC-7901 cells[J]. Chin Pharmacol Bull, 2019, 35(6): 844-9. |
| [6] |
Rampogu S, Gajula R G, Lee K W. A comprehensive review on chemotherapeutic potential of galangin[J]. Biomed Pharmacother, 2021, 141: 111808. doi:10.1016/j.biopha.2021.111808 |
| [7] |
Heo M Y, Sohn S J, Au W W. Anti-genotoxicity of galangin as a cancer chemopreventive agent candidate[J]. Mutat Res, 2001, 488(2): 135-50. doi:10.1016/S1383-5742(01)00054-0 |
| [8] |
贺文煜, 张海明, 袁昌劲. 高良姜素通过PI3K/Akt及p38-MAPK信号通路增强胃癌SGC-7901细胞对阿帕替尼的敏感性[J]. 天津医药, 2019, 47(10): 1020-5. He W Y, Zhang H M, Yuan C J. Galangin enhanced antitumor effects of apatinib in gastric cancer SGC-7901 cells via PI3K/Akt and p38-MAPK signaling pathway[J]. Tianjin Med J, 2019, 47(10): 1020-5. |
| [9] |
Marie-Egyptienne D T, Lohse I, Hill R P. Cancer stem cells, the epithelial to mesenchymal transition (EMT) and radioresistance: Potential role of hypoxia[J]. Cancer Lett, 2013, 341(1): 63-72. doi:10.1016/j.canlet.2012.11.019 |
| [10] |
Cao J, Wang H, Chen F, et al. Galangin inhibits cell invasion by suppressing the epithelial-mesenchymal transition and inducing apoptosis in renal cell carcinoma[J]. Mol Med Rep, 2016, 13(5): 4238-44. doi:10.3892/mmr.2016.5042 |
| [11] |
Correa P. Gastric cancer: Overview[J]. Gastroenterol Clin North Am, 2013, 42(2): 211-7. doi:10.1016/j.gtc.2013.01.002 |
| [12] |
Jing X, Yang F, Shao C, et al. Role of hypoxia in cancer therapy by regulating the tumor microenvironment[J]. Mol Cancer, 2019, 18(1): 157. doi:10.1186/s12943-019-1089-9 |
| [13] |
Wang M, Zhao X, Zhu D, et al. HIF-1alpha promoted vasculogenic mimicry formation in hepatocellular carcinoma through LOXL2 up-regulation in hypoxic tumor microenvironment[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2017, 36(1): 60. doi:10.1186/s13046-017-0533-1 |
| [14] |
Li H, Jia Y, Wang Y. Targeting HIF-1α signaling pathway for gastric cancer treatment[J]. Die Pharmazie, 2019, 74(1): 3-7. |
| [15] |
Tirpe A A, Gulei D, Ciortea S M, et al. Hypoxia: Overview on hypoxia-mediated mechanisms with a focus on the role of HIF genes[J]. Int J Mol Sci, 2019, 20(24): 6140. doi:10.3390/ijms20246140 |
| [16] |
Chen S, Dong Q J, Wan Z A, et al. BHLHE41 overexpression alleviates the malignant behavior of colon cancer cells induced by hypoxia via modulating HIF-1alpha/EMT pathway[J]. Gastroenterol Res Pract, 2022, 2022: 6972331. |
| [17] |
Ren K, Zhang W, Wu G, et al. Synergistic anti-cancer effects of galangin and berberine through apoptosis induction and proliferation inhibition in oesophageal carcinoma cells[J]. Biomed Pharmacother, 2016, 84: 1748-59. |
| [18] |
Liang X, Wang P, Yang C, et al. Galangin inhibits gastric cancer growth through enhancing STAT3 Mediated ROS production[J]. Front Pharmacol, 2021, 12: 646628. |