表1(Table 1)
多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是一种常见的内分泌失调性疾病，以高雄激素血症、无排卵和卵巢多囊样改变为主要特征，常常合并肥胖、血脂异常和胰岛素抵抗[1-2]。胰岛素抵抗是PCOS发生发展的关键病机[3]。约50%~70%的PCOS患者表现为胰岛素抵抗和高胰岛素血症。多囊卵巢综合征伴胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)是一种慢性低度炎症状态，是引起代谢异常和卵巢功能障碍的发病基础[4]。研究显示，Toll受体4(Toll-like Receptor 4, TLR4)/核转录因子κB p65(nuclear transcription factor-κB p65, NF-κB p65)炎症信号的激活参与了多种免疫相关的疾病，在PCOS-IR的发病过程中扮演了重要的角色[5]。目前，临床上主要采用口服避孕药联合二甲双胍或吡格列酮等药物来干预PCOS-IR，可有效改善患者月经失调、高雄激素血症，提高妊娠率，但多为对症治疗，停药后易出现反弹，加重病情发展。
中医学认为，“肥人多痰”，体内脂肪多由痰湿痰浊积聚而成。《医宗金鉴》记载：“女子不孕之故，或因体盛痰多，脂膜壅塞胞中而不孕。”《傅青主女科》云：“妇人有身体肥胖，痰涎甚多，不能受孕者……湿盛之故乎”，说明痰湿阻滞，壅于胞宫是PCOS主要病机，治疗上宜化痰祛湿、降浊化瘀，同时控制饮食、减轻体重、改变生活方式[6]。本研究采用苍附导痰汤化裁而成，方中苍术醒脾助运、开郁宽中，为君药；法夏、陈皮、茯苓、泽泻化痰祛湿、健脾和胃，为臣药；佐以香附、枳壳理气导滞；使以甘草补脾和中。另加黄芪、菟丝子益气补肾；当归、丹参活血通脉，共奏健脾化痰、补肾调经之效，可调节PCOS患者内分泌激素和代谢水平，改善排卵，提高妊娠率，具有显著临床疗效[7]。但是，目前该方的作用机制研究尚处于摸索阶段，本研究基于PCOS慢性炎症状态，探讨苍附导痰汤对TLR4/NF-κB信号通路的调节作用，为防治PCOS-IR提供一定的理论依据。
1 材料与方法 1.1 动物选取SPF级SD大鼠48只，♀，体质量约180~220 g，周龄7~8周，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，使用许可证号SYXK(湘)2015-0008，动物合格证号：1107271911004991，实验伦理编号为：2019-0057。实验程序根据湖南省中医药研究院实验动物中心进行，室温(22±2)℃，相对湿度45%~65%，07：00-19：00光照循环下自由饮用水和食物。本研究经动物伦理委员会批准，按照与湖南省中医药研究院实验动物中心的有关协议进行。所有程序均按照中国科学技术部制定的“实验动物护理和使用指导意见”进行。
1.2 药物及试剂苍附导痰汤(CFDT)由黄芪30 g、苍术10 g、香附10 g、半夏10 g、陈皮6 g、茯苓15 g、枳壳10 g、神曲10 g、菟丝子20 g、泽泻20 g、当归10 g、丹参10 g组成，中药饮片均购自湖南省中医药研究院附属医院，经湖南省中医药研究院中药研究所徐琳本教授鉴定为正品，饮片经过中药研究所制剂室加入10倍、8倍、6倍体积纯净水煎煮3次，每次1 h，合并后浓缩制成流浸膏(相当于生药量2.898 kg·L-1)，按照人与大鼠药物剂量换算成等效剂量(14.49 g·kg-1)和等效4倍量(57.96 g·kg-1)，剂量的选择是根据前期实验设计，探讨苍附导痰汤药效实验中的梯度剂量4倍、2倍、1倍，发现4倍剂量效果最好，并进行一定的梯度剂量探讨；来曲唑片(规格：2.5 mg/片，国药准字：H19991001，江苏恒瑞医药股份有限公司)，盐酸二甲双胍片(规格：0.5 g/片，国药准字：H20023370，中美上海施贵宝制药有限公司)。酶联免疫吸附试验(Elisa)试剂盒：胰岛素(FINS，批号：JM-01993R1)，均购于江苏晶美生物技术有限公司；快速革兰染色液(批号MA0391-Jun-20E)，购于大连美仑生物；一抗TLR4(批号19811-1-AP)，NF-κBp65(批号10745-1-AP)，购于Proteintech；TLR4和NF-κBp65上下游引物，购自上海生物工程技术服务有限公司。
1.3 主要仪器血糖仪及血糖试纸(艾科)；Olympus生物显微镜(日本OLYMPUS公司)；TrilogyII型生化分析仪(Trilogy公司)；envision2105型酶标仪(PE公司)；生物组织切片机(THERMO SCIENTIFIC)；水平琼脂糖电泳槽(中国北京六一)；实时荧光定量PCR仪(美国Thermo)。
1.4 方法 1.4.1 动物造模、分组及给药将48只SD大鼠按体重随机分为正常组(8只)和造模组(40只)，正常组予以普通饲料和纯净水喂养；造模组参照文献[8]方法造模，大鼠每日灌胃来曲唑溶液(1 mg·kg-1)，并给予高脂饲料(基础维持饲料61.5%、猪油12%、蔗糖5%、奶粉5%、花生5%、鸡蛋10%、麻油1%、食盐0.5%)和5%葡萄糖溶液饲养，连续灌胃30 d。造模d 23开始连续5 d进行阴道涂片，监测排卵周期，以出现阴道上皮细胞持续无角化或满视野白细胞，动情周期紊乱，代表模型复制成功。挑选24只PCOS-IR大鼠随机分为模型组、阳性药组(二甲双胍135 mg·kg-1)、苍附导痰汤低、高剂量(14.49，57.96 g·kg-1)组，每组各6只。正常组和模型组大鼠均给予等体积生理盐水，其余各组分别给予相应药物干预，连续21 d。
1.4.2 一般状态观察每周监测大鼠体重变化，以模型组大鼠平均体重高于正常组大鼠20%，视为肥胖模型；造模结束前和治疗干预结束前分别进行连续5 d阴道涂片，采用浸有生理盐水的无菌棉签插入大鼠阴道口，轻柔旋转4~5圈，然后均匀的涂在载玻片上，自然风干后，采用快速革兰染色液，根据试剂盒说明书，将玻片进行染色，显微镜下观察，判断大鼠动情周期变化以及排卵情况。
1.4.3 样本采集给药结束后，动物禁食不禁水12 h，鼠尾采血，利用血糖仪测定空腹血糖值(FBG)。然后，各组大鼠给予10%水合氯醛(3 mL·kg-1)腹腔注射麻醉后，腹主动脉取血、离心(3 000 r·min-1，15 min)，收集血清，-80 ℃保存待用。解剖分离卵巢和子宫组织，并称重，计算脏器指数=子宫或卵巢湿重(mg)/体质量(g)，将左侧卵巢保存在4%多聚甲醛固定液中，右侧卵巢液氮速冻，-80 ℃保存待用。
1.4.4 HOMA-IR和血脂检测按照ELISA试剂盒说明书操作，检测血清胰岛素(FINS)水平，并计算胰岛素抵抗指数HOMA-IR=FBG(mmol·L-1)×FINS(mIU·L-1)/22.5。采用生化分析仪检测血清总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平。
1.4.5 TLR4和NF-κB p65蛋白检测大鼠卵巢组织固定48 h以上后，石蜡包埋，制成5 μm的石蜡切片，60 ℃烤片12 h，切片脱蜡至水，抗原热修复，1 %高碘酸(室温、10 min)灭活内源性酶，PBS冲洗，孵育TLR4和NF-κB p65一抗(稀释比为1 ∶100)，4 ℃过夜，孵育二抗兔-IgG抗体-HRP多聚体，DAB显色，苏木精复染5~10 min，脱水封片，显微镜下观察，以细胞质的颗粒细胞呈现棕黄色和棕褐色为阳性表达，每张切片选择5个倍镜视野进行观察，采用Motic Images Plus 6.0分析累计光密度(IOD)及染色区域的面积(Area)，计算出平均光密度(AOD)=IOD/Area。取5个视野的平均光密度值作为代表TLR4、NF-κB p65蛋白表达强度。
1.4.6 TLR4和NF-κB p65 mRNA检测运用primer5软件设计引物。取冻存的卵巢组织约0.02 g，加入1 mL TRIzol于匀浆器中充分研磨，裂解5 min，提取组织样本总RNA，采用琼脂糖凝胶电泳进行定性，核酸蛋白测定仪测定260/280 nm处A值，进行定量。按照逆转录反应试剂盒说明书，合成cDNA。每个样本设置3个孔，PCR反应体系为2X SYBGREEN PCR Master Mix 15 μL，ddH2O 11 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，cDNA 1 μL。扩增条件为合酶活化95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，30 s；40个循环。以actin为内参，反应结束后以2-ΔΔCt法计算分析目的基因TLR4、NF-κB p65相对表达水平。引物由上海生工生物工程股份有限公司设计，引物序列为TLR4上游5′-GGCTTCTAACCTCAACGACCT-3′，下游5′-ATGATTCTTTGCCTGAGTTGCTT-3′，扩增长度112 bp；NF-κB p65上游5′-CAC CAAAGACCCACCTCACCG-3′，下游5′- CTTGCTCCAGGTCTCGCTTC-3′，扩增长度155 bp；β-actin上游5′-ACATCCGTAAAGACCTCTATGC-3′，下游5′- TACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3′，扩增长度223 bp。
1.4.7 统计学方法数据分析采用统计软件SPSS 17.0，所有计量资料以x±s表示，多组总体比较，方差齐者采用单因素方差分析(One-way-ANOVA)，两两比较用q检验，方差不齐者采用t检验。
2 结果 2.1 动情周期变化正常组大鼠阴道涂片细胞呈现规律的周期性变化，在动情期可见足量角化上皮和少量角化上皮细胞；模型组大鼠动情周期紊乱，大多数处于动情间期，可见满视野的白细胞；阳性药组和苍附导痰汤高剂量组大鼠阴道细胞基本处于规律的动情周期，涂片观察可见角化上皮细胞和(或)大量有核上皮细胞，有排卵存在；苍附导痰汤低剂量组阴道细胞多见大量白细胞，少量有核细胞，大多处于动情前期或间期，有偶发排卵现象(Fig 1)。
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| Fig 1 Effect of Cangfudaotan Decoction on exfoliated cells in rat vagina(100×，n=6) Control: Control goup, Model: Model goup, Positive-Metformin: Positive drug group (Metformin 135 mg·kg-1), CFDT-High: Cangfudaotan Decoction High dose group, CFDT-Low: Cangfudaotan Decoction High low group |
与正常组比较，模型组大鼠体质量明显增加，子宫指数明显降低，卵巢指数上调(P＜0.05)；与模型组比较，阳性药组大鼠子宫指数增加，苍附导痰汤高剂量组可明显回调大鼠子宫指数，减少卵巢指数(P＜0.05)，体重存在降低趋势，但差异无统计学意义(Tab 1)。
| Group | Dose/g·kg-1 | Body mass/g | Uterine index/mg·g-1 | Ovarian/mg·g-1 |
| Control | - | 291.67±13.59 | 1.87±0.07 | 0.62±0.09 |
| Model | - | 366.83±21.61* | 1.08±0.10* | 0.75±0.07* |
| Positive-Metformin | 0.135 | 353.50±17.35 | 1.43±0.32# | 0.68±0.04# |
| CFDT-High | 57.96 | 347.83±18.40 | 1.36±0.24# | 0.66±0.08# |
| CFDT-Low | 14.49 | 353.33±9.46 | 1.18±0.20 | 0.70±0.09 |
| *P＜0. 05 vs Control; #P＜0. 05 vs model. Control: Control goup, Model: Model goup, Positive-Metformin: Positive drug group (Metformin 135 mg·kg-1), CFDT -High: Cangfudaotan Decoction High dose group, CFDT -Low: Cangfudaotan Decoction High low group | ||||
与正常组比较，模型组大鼠HOMA-IR、TC和TG水平明显增加(P＜0.05，0.01)；与模型组比较，阳性药组可降低大鼠HOMA-IR和TG水平，苍附导痰汤高剂量组也可降低这两个指标水平(P＜0.05)，但TC水平变化无差异(Tab 2)。
| Group | Dose/g·kg-1 | HOMA-IR | TC/mmol·L-1 | TG/mmol·L-1 |
| Control | - | 2.82±0.44 | 1.45±0.18 | 0.32±0.09 |
| Model | - | 5.12±0.84** | 1.67±0.15* | 0.55±0.13** |
| Positive-Metformin | 0.135 | 3.71±0.47## | 1.58±0.08 | 0.40±0.08# |
| CFDT -High | 57.96 | 3.62±0.72## | 1.61±0.14 | 0.34±0.07# |
| CFDT -Low | 14.49 | 4.63±0.58 | 1.67±0.17 | 0.37±0.07# |
| *P＜0. 05, **P＜0. 01 vs Control; #P＜0. 05, ##P＜0. 01 vs model. Control: Control goup, Model: Model goup, Positive-Metformin: Positive drug group (Metformin 135 mg·kg-1), CFDT -High: Cangfudaotan Decoction High dose group, CFDT -Low: Cangfudaotan Decoction High low group | ||||
免疫组化染色结果显示，正常组大鼠卵巢组织形态结构规则清晰，卵泡处于不同发育阶段，黄体清晰，颗粒层排列清晰紧密；模型组大鼠卵巢中可见大量未发育的成熟小卵泡，颗粒细胞层减少、排列疏松，卵巢囊性改变明显；苍附导痰汤高剂量组卵巢中未发育的成熟小卵泡明显减少，颗粒层细胞排列较紧密，层数增多，卵巢囊性改变减轻(Fig 2)；TLR4主要在胞质和胞膜中表达，NF-κB p65主要在胞质和胞核中表达，正常组大鼠卵巢中TLR4和NF-κB p65表达较少，模型组卵巢囊性改变明显，颗粒细胞层减少，TLR4和NF-κB p65阳性表达面积大量增加(P＜0.01)，黄色和棕黄色区域增加；与模型组比较，苍附导痰汤治疗后大鼠卵巢多囊性改变减轻，TLR4和NF-κB p65阳性表达面积明显减少(P＜0.05)，棕黄色区域面积和颜色相对减轻(Tab 3)，提示，TLR4和NF-κB p65蛋白表达减少。
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| Fig 2 Effect of Cangfudaotan Decoction on expression of TLR4 and NF-κB p65 protein in PCOS-IR rats Control: Control goup, Model: Model goup, Positive-Metformin: Positive drug group (Metformin 135 mg·kg-1), CFDT-High: Cangfudaotan Decoction High dose group, CFDT-Low: Cangfudaotan Decoction High low group |
| Group | Dose/g·kg-1 | TLR4 | NF-κB p65 |
| Control | - | 0.008 8±0.004 7 | 0.011 7±0.006 9 |
| Model | - | 0.035 9±0.007 4** | 0.043 2±0.005 8** |
| Positive-Metformin | 0.135 | 0.0183 7±0.004 3# | 0.024 6±0.009 4# |
| CFDT -High | 57.96 | 0.016 6±0.007 4# | 0.023 8±0.010 6# |
| CFDT -Low | 14.49 | 0.018 7±0.008 6 | 0.041 5±0.006 5 |
| **P＜0. 01 vs Control; #P＜0. 05 vs model. Control: Control goup, Model: Model goup, Positive-Metformin: Positive drug group (Metformin 135 mg·kg-1), CFDT -High: Cangfudaotan Decoction High dose group, CFDT -Low: Cangfudaotan Decoction High low group | |||
实时荧光定量PCR结果显示，与正常组比较，模型组大鼠卵巢组织中TLR4和NF-κB p65 mRNA的表达明显升高(P＜0.01)；与模型组比较，苍附导痰汤组大鼠卵巢组织中TLR4和NF-κB p65 mRNA的表达明显降低(P < 0.05, P＜0.01)(Tab 4)。
| Group | Dose/g·kg-1 | TLR4mRNA | NF-κB p65mRNA |
| Control | - | 1.11±0.14 | 1.17±0.31 |
| Model | - | 4.84±0.44** | 3.88±0.30** |
| Positive-Metformin | 0.135 | 2.89±0.57## | 2.48±0.64# |
| CFDT -High | 57.96 | 1.99±0.16## | 2.06±0.33## |
| CFDT -Low | 14.49 | 3.88±0.38# | 2.89±0.59 |
| **P＜0. 01 vs Control; #P＜0. 05, ##P＜0. 01 vs model. Control: Control goup, Model: Model goup, Positive-Metformin: Positive drug group (Metformin 135 mg·g-1), CFDT -High: Cangfudaotan Decoction High dose group, CFDT -Low: Cangfudaotan Decoction High low group | |||
育龄期女性常见的异质性生殖疾病之一是多囊卵巢综合征(PCOS)，其发病率正在逐年提升，严重危害女性的生殖和身心健康。50%以上的PCOS患者存在明显的肥胖或超重，尤以腹型肥胖为主，这与机体胰岛素抵抗、糖脂代谢异常密切相关，肥胖的存在显著影响PCOS的发生和发展[9]。本研究也发现，苍附导痰汤可改善卵巢子宫指数和排卵状况，这可能与减少PCOS大鼠体质量，调节糖脂代谢有关。肥胖通常以全身性和组织特异性脂肪形成为特征，胆固醇水平和脂质蓄积增加，可导致卵巢炎症、氧化应激和功能障碍[10]。而肥胖与PCOS低度慢性炎症的关系很可能是因为胰岛素的脂解作用降低，血清炎症介质如TNF-α和高敏CRP (hs-CRP)增加，导致β细胞功能障碍和胰岛素抵抗[11]；肥胖和胰岛素抵抗协同刺激卵巢和肾上腺的雄激素合成，随后进一步加剧PCOS腹型肥胖和血清炎性介质增加，形成恶性循环。因此，改善肥胖型PCOS-IR患者机体炎症状态成为其治疗的关键因素之一。前期研究发现[12]，苍附导痰汤对来曲唑联合高脂高糖饮食诱导的肥胖型PCOS-IR大鼠模型具有良好的改善胰岛素抵抗和炎性因子TNF-α和IL-1β水平，促进排卵作用，具体作用机制需进一步研究。
Toll样受体(TLRs)是机体参与先天免疫的一类重要蛋白，可以识别病原体并产生免疫细胞应答，在免疫炎症反应的诱导和调节过程中发挥主要功能。TLRs位于哺乳动物卵巢中，包括颗粒细胞、卵丘细胞和卵泡膜细胞，其异常表达可导致卵母细胞质量降低，影响受精率；TLR4作为TLRs家族成员之一，其大量激活可影响卵泡形成和有丝分裂[13]。临床研究表明，相比瘦弱的PCOS患者，肥胖型PCOS女性血浆中TLR4蛋白反应更高[14]。来自单核细胞的葡萄糖诱导的核因子-κB (NF-κB)激活可导致PCOS中的β细胞功能障碍和胰岛素分泌不规则[15]。NF-κB是炎症启动的关键转录因子，可调节多种细胞因子，包括TNF-α，IL-1β，IL-6和IL-18等。NF-κB的激活涉及两个保守的丝氨酸残基上IκB蛋白的磷酸化，这是由IκB激酶复合物完成的。IkB磷酸化并随后进行蛋白水解后，NF-κB转录因子p50/p65易位至细胞核，激活其靶基因的转录[16]。TLR4的大量活化，可与内源性配体低密度脂蛋白(ox-LDL)结合，激活NF-κB，产生大量促炎因子，进而促使卵巢多囊性改变[17]。文献调研也发现，TLR4/NF-κB信号途径在PCOS-IR的发病过程中发挥重要作用[5, 17, 18]。本研究通过免疫组化和RT-PCR法分别检测大鼠卵巢中TLR4和NF-κB p65蛋白和基因表达的变化，发现苍附导痰汤能够明显改善肥胖型PCOS-IR大鼠卵巢多囊性变化，增加颗粒细胞层，降低TLR4和NF-kBp65表达。由此推测，苍附导痰汤能够减轻肥胖型PCOS-IR患者胰岛素抵抗，促进排卵，改善卵巢生殖功能，其作用机制可能与调控TLR4/NF-κB p65炎症信号通路，减少下游炎症因子的释放，改善PCOS-IR慢性炎症状态有关。
综上所述，慢性炎症是卵巢的多囊样改变的重要因素之一，苍附导痰汤可通过多途径、多靶点改善肥胖型PCOS-IR大鼠卵巢多囊样变化，调节炎症信号通路TLR4/NF-κB并促进排卵。本研究的结果将为肥胖型PCOS-IR的中医药治疗提供新的选择，但针对肥胖与慢性炎症联系的具体作用机制有待进一步研究。
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