NLRP3是核苷酸结合寡聚化结构域(nucleotide-binding oligomerization domain，NOD)样受体家族的重要成员之一，可以识别病原相关分子模式或损伤相关分子模式(danger-associated molecular patterns，DAMPs)，继而招募衔接蛋白凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)和半胱天冬蛋白酶Caspase-1前体(pro-Caspase-1)形成炎症小体复合物，介导pro-IL-1β和pro-IL-18的加工成熟以及引起细胞焦亡，参与固有免疫防御。然而，NLRP3炎症小体的过度激活会导致持续炎症反应和组织器官损伤[1-2]。冷炎素相关周期热综合征(cryopyrin-associated periodic syndrome，CAPS)即是NLRP3基因突变导致NLRP3炎症小体持续活化所引起的自身炎症性疾病[3]。此外，NLRP3炎性小体的异常活化还与心血管疾病、败血症、痛风、2型糖尿病、神经退行性疾病和肿瘤等多种疾病密切相关，使其成为研究热点[4-5]。本研究借助Cre-LoxP重组系统，建立新型的时间特异性NLRP3基因346位点苏氨酸(T)突变为甲硫氨酸(M)的点突变(对应人类CAPS患者T348M突变)转基因小鼠模型，旨在为相关机制的研究以及筛选和评价NLRP3炎症小体抑制剂提供新的实验动物模型。
1 材料 1.1 实验动物野生型(wild type，WT)C57BL/6J小鼠购自江苏集萃药康生物科技有限公司，广谱表达Cre重组酶的工具鼠CAG-Cre/ERT2(B6.Cg-Tg(CAG-cre/Esr*)5Amc/J小鼠，Strain：004682，以下简称CreT)购自美国Jackson实验室。实验动物均在无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级动物房饲养及实验，温度(22±2)℃，湿度40%~70%。实验过程中对小鼠的处置按照中华人民共和国科学技术委员会颁布的《实验动物管理条例》相关规定进行，所有操作经中国医学科学院基础医学研究所实验动物管理与伦理委员会批准(批准号：ACUC-A01-2018-013)。
1.2 实验试剂他莫昔芬(美国Sigma公司，#102394126)；2×Rapid Taq Master Mix(南京诺唯赞公司，#7E220D8)；蛋白酶及磷酸酶抑制剂(北京金普来公司，#01001)；ECL化学发光试剂盒(美国Thermo公司，#2130201)；RIPA裂解液(北京碧云天公司，#072021220104)；BCA蛋白定量试剂盒(北京普利莱公司，#2021E9DP1511)；PAGE凝胶快速制备试剂盒(上海雅酶公司，#03656300)；抗NLRP3抗体(美国Abcam公司，#GR295129-4)；抗Caspase-1抗体(美国Adipogen公司，#A40261903)；抗β-actin抗体、辣根过氧化物酶山羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶山羊抗小鼠IgG(北京中杉金桥公司，#211050922、#222070418、#219760423)。
1.3 仪器MiniAmpTM Thermal Cycler PCR仪(美国ABI公司)；BG-Power600通用电泳仪(北京百晶公司)；ST30-Tanon5800自动化学发光图像分析系统(上海天能公司)。
2 方法 2.1 NLRP3打靶载体的构建在小鼠NLRP3(Gene ID：2167994)4号外显子上制作T346M定点突变，该突变对应人类T348M突变位点。如Fig 1所示，将点突变与Cre-LoxP系统结合，根据小鼠NLRP3基因组序列(NC_000001.11)设计NLRP3点突变打靶载体，选择NLRP3-201(Transcript ID：ENST00000336119.7)作为转录本，在4号外显子上游插入Rox-differentiation-dependent self-deleting cassette (DDSDC)-Neo-Rox元件，在4号外显子下游引入含有T346M突变位点的反向外显子序列，并在打靶载体两端引入一对由LoxP和Lox2272(突变的LoxP，被Cre酶重组的方式与LoxP相同)组成的DIO序列(double-floxed inverted open reading frame)，构成flox区域。
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| Fig 1 NLRP3T346M knock in strategy |
通过电穿孔的方法将构建好的打靶载体序列注入小鼠胚胎干(embryonic stem，ES)细胞中，筛选出导入打靶载体DNA片段的中靶细胞，利用显微操作系统将中靶的ES细胞注射至假孕小鼠子宫中，自然分娩，产下的后代即为嵌合体小鼠。根据毛色鉴定嵌合效率，选取嵌合率在50%以上的flox雌鼠进行生殖系繁育，将其与Dre deleter小鼠杂交，在Dre重组下去除其识别位点的正筛选标记基因DDSDC-Neo，获得去除打靶载体中的Neo抗性基因的小鼠(NLRP3flox/+Dre+)。再与WT小鼠合笼，得到去除Dre基因型的NLRP3T346M flox杂合子(NLRP3flox/+)小鼠，以上实验由本课题组与江苏集萃药康生物科技有限公司合作完成。将NLRP3flox/+小鼠与CreT小鼠合笼获得NLRP3flox/+CreT+/-小鼠，NLRP3flox/+小鼠自交获得NLRP3flox/flox小鼠，此为F1代。将NLRP3flox/+CreT+/-小鼠与NLRP3flox/flox小鼠交配获得F2代，产生NLRP3flox/floxCreT+/-、NLRP3flox/+CreT+/-、NLRP3flox/floxCreT-/-、NLRP3flox/+CreT-/-4种基因型。其中NLRP3flox/floxCreT+/-为广谱表达NLRP3T346M的纯合小鼠(KI/KI)，NLRP3flox/+CreT+/-为广谱表达NLRP3T346M的杂合小鼠(KI/WT)，同窝WT型作为对照，见Fig 2。
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| Fig 2 Construction of NLRP3T346M knock in mouse model by Cre-LoxP system |
F2代小鼠6~8周时灌胃给予他莫昔芬(50 g·L-1，用10%的玉米油/无水乙醇配制)，每只鼠0.1 mL，连续给药4 d [6]。在他莫昔芬诱导下，定位于胞浆的Cre重组酶和雌激素受体结合蛋白转位至细胞核，Cre重组酶可特异性识别目的基因两端的LoxP和Lox2722位点，首先将方向相反的LoxP(或Lox2722)位点间的序列倒转，从而使2个Lox2722(或LoxP)的方向变为相同。随后，Cre酶特异性切除同向Lox2722(或LoxP)位点间WT型NLRP3基因序列，仅保留含有T346M突变位点的基因序列。
2.4 基因型鉴定 2.4.1 鼠尾基因组DNA提取剪取0.2~0.5 cm鼠尾放入1.5 mL EP管中，加入裂解液和蛋白酶K，55 ℃过夜消化，加入酚、氯仿和异戊醇后混匀，12 000 r·min-1离心5 min，吸取上层至另一EP管后加入等体积异丙醇，混匀，12 000 r·min-1离心10 min后弃上清，再加入75%乙醇，12 000 r·min-1离心5 min，弃上清，晾干，加入适量TE缓冲液溶解DNA。
2.4.2 去Neo小鼠PCR鉴定引物序列如Tab 1所示。PCR反应体系：2×Taq Master Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，Primer A(10 μmol·L-1) 1 μL，Primer B(10 μmol·L-1)1 μL，DNA Template(≈100 μL-1) 1 μL，共25 μL。扩增条件：预变性：95 ℃ 5 min；变性：98 ℃ 30 s；退火：65 ℃ 30 s；延伸72 ℃ 45 s，20个循环；98 ℃ 30 s；退火：55 ℃ 30 s；延伸72 ℃ 45 s，20个循环；最后延伸：72 ℃ 5 min，10 ℃保存。以2%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物：如条带为258 bp，则为带Neo标记；如为两条带，大小分别为405 bp和202 bp，则为NLRP3flox/+Dre+。
| Prime | Primer sequence (5′-3′) | Product length (bp) |
| NLRP3-tF1 | CGTCATTGATACAGAGTAGTGGCAC | 339 |
| NLRP3-tR1 | CTTCAATCTGGCATCCATCACAG | |
| DDSDC3.1-tF3 | TCTTATCATGTCTGGATCCGGG | 258 |
| NLRP3-rox-tR1 | CTGTAAGCCTTGGCAGCAATG | |
| NLRP3-rox-tF1 | CTCTGTCCGGTCATACCACCTAT | KI(pre cre)=405 KI(post cre)=260 WT=202 377 |
| NLRP3-rox-tR1 | CTGTAAGCCTTGGCAGCAATG | |
| Cre KT 119 | TGCCACGACCAAGTGACAGCAATG | |
| Cre KT 120 | ACCAGAGACGGAAATCCATCGCTC |
引物序列如Tab 1所示。PCR反应体系：gDNA Template 2.0 μL，10×Taq Buffer(Mg2+ plus) 2.0 μL，dNTP Mixture(10 mmol·L-1)0.5 μL，Primer mix(10 mol·L-1)0.5 μL，Taq DNA polymerase(5×106 U·L-1) 0.5 μL，Milli-Q H2O加至20 μL。扩增条件：预变性：95 ℃ 5 min；变性：95 ℃ 30 s；退火：58 ℃ 30 s；延伸72 ℃ 30 s，40个循环；最后延伸：72 ℃ 3 min，25 ℃保存。以2%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，如产物为一条带，大小为405 bp，则为NLRP3flox/flox；如为两条带，大小分别为405和202 bp，则为NLRP3flox/+；如条带为377 bp，则为CreT+/-；他莫昔芬诱导入核后，如产物为一条带，大小为260 bp，则为NLRP3flox/flox；如为两条带，大小分别为260和202 bp，则为NLRP3flox/+。
2.5 Western blot检测组织NLRP3、Caspase-1蛋白的表达提取小鼠肝组织和心脏组织总蛋白，BCA试剂盒进行蛋白定量。采用12.5%的SDS-PAGE电泳，转膜后用含5%脱脂奶粉的TBST封闭1 h，加入一抗NLRP3(稀释度1 ∶ 500)、Caspase-1(稀释度1 ∶ 500)、β-actin(稀释度1 ∶ 1 000)，4 ℃孵育过夜。次日用TBST洗膜后，加入二抗(辣根过氧化物酶山羊抗兔IgG或辣根过氧化物酶山羊抗小鼠IgG，1 ∶ 4 000)，室温摇床孵育1 h，TBST洗膜后，ECL法显影，采集图像。
2.6 统计学方法应用GraphPad Prism 7.0数据分析软件进行分析。体质量的组间比较采用双因素方差分析(Two-way ANOVA)方法，其余指标的组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，两两比较采用Dunnett-t检验。
3 结果 3.1 去Neo小鼠的获得及基因型鉴定将嵌合体小鼠与Dre deleter小鼠杂交，经PCR确认，得到的9只小鼠均在405 bp和202 bp出现两条条带，且258 bp无条带，为去除Neo的NLRP3T346M flox杂合子(NLRP3flox/+Dre+)小鼠, 见Fig 3。
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| Fig 3 Genotyping identification of removal of neo gene mice by PCR method WT was C57BL/6J wild type, N was blank control, M was DNA marker. |
将经PCR检测得到的去Neo杂合小鼠(NLRP3flox/+Dre+)与WT小鼠合笼，得到去除Dre基因型的NLRP3flox/+小鼠，分别将NLRP3flox/+小鼠自交以及与广谱表达的CreT小鼠合笼获得F1代小鼠，剪尾进行PCR实验，见Fig 4A、4B，1、4、8和10号小鼠出现405 bp一条条带，且Cre酶表达为阴性，为NLRP3 flox/flox小鼠；2、3、5、6、7和9号小鼠出现405 bp和202 bp两条条带，且CreT酶表达为阳性，为NLRP3flox/+CreT+/-小鼠。
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| Fig 4 Genotyping identification of F1 generation mice by PCR method A: PCR amplification results of NLRP3; B: PCR amplification results of Cre. P was positive control, B6 was negative control, N was blank control. |
将基因型为NLRP3flox/+CreT+/-的小鼠与NLRP3flox/flox小鼠交配获得F2代小鼠，待F2代小鼠成熟后连续给予他莫昔芬4 d，剪尾进行PCR实验，检测其基因型及Cre酶的表达。如Fig 5所示，1-3号为KI/WT小鼠，4-7号KI/KI小鼠。上述结果从基因水平证明本研究成功建立了NLRP3T346M点突变小鼠模型。
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| Fig 5 Genotyping identification of F2 generation mice after tamoxifen induction by PCR method A: PCR amplification results of NLRP3; B: PCR amplification results of Cre. P was positive control, B6 was negative control, N was blank control. |
提取他莫昔芬诱导后的转基因小鼠肝脏和心脏组织蛋白，Western blot检测NLRP3、pro-Caspase-1和Caspase-1的表达水平。结果显示，肝脏和心脏中NLRP3和pro-Caspase-1表达水平在KI/KI、KI/WT和WT三组之间没有差异；而NLRP3炎性小体效应蛋白Caspase-1的蛋白表达水平在KI/KI小鼠肝脏中以及在KI/KI小鼠和KI/WT小鼠的心脏中均明显高于WT组小鼠，见Fig 6。提示，经他莫昔芬诱导后，NLRP3T346M转基因小鼠出现自发性NLRP3炎性小体活化，成功构建了时间特异性NLRP3T346M转基因小鼠模型。
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| Fig 6 NLRP3 inflammation expression in tissues A: NLRP3 inflammation expression in liver; B: NLRP3 inflammation expression in heart. |
NLRP3受体可以通过形成NLRP3炎症小体这一多蛋白复合物，将pro-Caspase-1剪切为有活性的Caspase-1，后者将无活性的pro-IL-1β和pro-IL-18切割为成熟形式并释放到胞外[7]。NLRP3炎症小体在机体免疫应答中具有重要作用，一直是免疫炎症领域的重点研究对象，因此，构建合适的相关动物模型是研究的关键问题[8]。
基因敲入技术是近年来生命科学研究领域的重大突破，通过同源重组的方式编辑目的基因从而构建人类疾病的动物模型[9-10]。研究证实，NLRP3基因突变可导致NLRP3炎症小体持续活化，引起CAPS[3]。因此，构建CAPS相关的突变NLRP3转基因动物模型，可使动物出现自发性NLRP3炎症小体持续活化，用于NLRP3炎性小体相关疾病的研究。文献报道，NLRP3A350V/+、NLRP3L351P/+以及NLRP3N475K/+小鼠表现出类似CAPS的系统性炎症、生长迟缓和早期死亡[11-12]。NLRP3D301N/+小鼠亦表现出系统性炎症，肝脏中出现严重的炎症、纤维化，用于NLRP3介导肝损伤的研究[13-14]。NLRP3A350V/+CreT小鼠在使用低剂量脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激后，心脏中Caspase-1被活化，出现心功能障碍[15]。然而，对于CAPS患者常见的T348M突变位点，目前尚无相应的转基因动物模型[16]。因此，本研究构建了对应人NLRP3基因T348M突变位点的小鼠T346M突变基因敲入模型。
时间特异性基因编辑技术以Cre-LoxP系统为基础，通过诱导剂来控制Cre酶的时间表达。因此，通过控制他莫昔芬的给予时间，可在特定时间点获得表达目的基因的转基因小鼠。目前，很多NLRP3 KI小鼠模型是非时间特异性的，小鼠出生后即出现严重的系统性炎症，随即很快死亡。在本研究中，NLRP3flox/+CreT+/-小鼠与NLRP3flox/flox小鼠交配得到的转基因小鼠在他莫昔芬诱导前表达野生型NLRP3，只有在他莫昔芬作用下才能诱导Cre重组酶表达，表达突变的NLRP3蛋白。
综上所述，本研究成功建立了时间特异性的NLRP3T346M点突变转基因小鼠模型，为阐明NLRP3炎症小体的活化机制奠定基础，也为探究NLRP3活化在相关疾病中的作用以及评价NLRP3抑制剂提供了一种新的实验动物模型。
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