2. 山东第一医科大学(山东省医学科学院)药学院，山东 泰安 271016;
3. 山东第一医科大学(山东省医学科学院)基础医学院，山东 泰安 271016
2. School of Pharmacy, Shandong First Medical University & Shandong Academy of Medical Sciences, Taian, Shandong 271016, China;
3. College of Basic Medical Sciences, Shandong First Medical University & Shandong Academy of Medical Sciences, Taian, Shandong 271016, China
心血管疾病(cardiovascular diseases，CVD)仍是威胁人类生命安全的一个危险疾病，而不良的膳食结构则是心血管疾病的主要危险因素。长期的高脂饮食会增加身体中的脂肪含量, 从而增加血液中的游离脂肪酸(free fatty acids，FFA)水平。棕榈酸(palmitic acid，PA)是血液循环中含量最丰富的FFA之一，其在血液中的累积可导致细胞脂毒性，最终诱导内皮功能障碍甚至细胞死亡[1]。
CVD发展过程中最重要的因素是血管内皮细胞的功能及结构是否完整，而一氧化氮(nitric oxide，NO)在调节内皮功能动态平衡中起关键作用[2-3]。NO主要来源于内皮，具有多种血管保护作用。PA可减少血管内皮NO的释放，并能抑制Akt和内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的磷酸化激活[4]。此外，PA诱导的ROS可促使内皮细胞发生凋亡，ROS的过量产生还能破坏氧化系统和抗氧化系统之间的平衡[5]。因此，减轻氧化应激可以成为治疗高脂饮食所致血管内皮损伤的一种策略。
氧化苦参碱(oxymatrine，OMT)是一种天然生物碱，具有广泛的药理作用和生物活性，包括抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤等作用[6]。OMT抑制促炎介质的释放，从而对高糖损伤的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)具有保护作用[7]。最近研究表明[8]，OMT通过Akt-eNOS-NO信号通路抑制Hcy诱导的HUVECs细胞凋亡。然而，OMT对PA致血管内皮细胞损伤的作用尚不清楚。因此，本研究选用体外培养的HUVECs作为研究对象，旨在探讨OMT对PA诱导的内皮细胞损伤的保护作用及其潜在机制。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞株HUVECs细胞购自于江苏凯基生物技术有限公司。
1.1.2 药物与试剂OMT(纯度>98%)购自西安嘉天生物科技有限公司；PA(货号：slcd8134)购于Sigma公司；DMEM培养基(货号：AG29643096)购自HyClone公司；胎牛血清购于杭州四季青公司；MTT(货号：TOX1)、二甲基亚砜(DMSO, 货号：D2650)均购自美国Sigma公司；Wortmannin(WT，货号：1232/5)购自英国Tocris公司；LDH试剂盒、SOD试剂盒、GSH-PX试剂盒、MDA试剂盒、NO试剂盒(货号分别为：A020-1-2、A001-1-1、A005-1-1、A003-1-2、A012-1-2)均购自南京建成生物科技有限公司；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(货号: C1067S)、ROS检测试剂盒(货号：S0033S)均购自碧云天生物公司；一抗抗体Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS、bax、bcl-2、caspase-3、β-actin(货号分别为：4691S、4060T、32027S、4223S、2772T、4060S、14220T、4970S)均购自美国CST公司；二抗兔抗IgG(货号：ZB-2301)、二抗鼠抗IgG(货号：ZB-2305)均购于北京中杉生物技术公司。
1.1.3 仪器流式细胞仪(美国BD公司)；电泳仪(伯乐，Bio Rad)；Infinite F 200型多功能酶标仪(瑞士Tecan公司)；超净工作台(苏州净化设备公司)；XPS-1 B型倒置显微镜(重庆电光仪器有限公司)。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养将从液氮中取出的细胞在DMEM高糖培养基(包括10% FBS、1%青链霉素)、5%CO2、37 ℃培养箱中培养。取第3~8代细胞供实验用。
1.2.2 分组与药物干预细胞存活率和LDH指标检测实验中，将HUVECs细胞分为7组：正常对照组(control组)、PA组(0.5 mmol·L-1，模型组)、PA+OMT组(0.1、0.3、0.6 μmol·L-1，干预组)、WT+PA+OMT(0.6 μmol·L-1)组、WT(0.1 μmol·L-1)组。其他指标检测实验中，将HUVECs细胞分为5组: control组、PA组、PA+OMT(0.1、0.3、0.6 μmol·L-1)组。待细胞长到80%密度后吸出培养基，模型组只加入PA，干预组用相应浓度OMT提前预处理4 h后再加入PA，control组加入相同体积的培养基，细胞继续培养24 h，收集样品备用。
1.2.3 MTT检测细胞存活率细胞以每孔3 000个的密度接种于96孔板中，各组细胞加药处理24 h后，弃掉旧培养基，每孔加入0.5 g·L-1的MTT 100 μL，4 h后弃上清，每孔加DMSO 150 μL，振摇10 min结晶溶解，用多功能酶标仪在490 nm波长测定OD值，并计算细胞存活率。
1.2.4 Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡细胞以每孔5×104个的密度接种于6孔板中，细胞贴壁24 h后弃旧培养基，按分组加药处理细胞后于孵箱中继续培养24 h后弃旧培养液，使用PBS清洗两次，用不含EDTA的胰酶消化细胞，转移至流式管离心收集细胞。按照Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒说明书操作，用流式细胞仪检测细胞凋亡并进行数据处理。
1.2.5 DCHF-DA染色检测细胞内ROS生成细胞以每孔5×104个的密度接种于6孔板细胞中，按照DCHF-DA试剂盒说明书操作，用ELISA法检测细胞内ROS水平。
1.2.6 MDA、SOD、LDH、GSH-PX、NO含量测定收集细胞培养液，根据检测试剂盒使用明书进行实验操作，用ELISA法检测细胞培养液中MDA、SOD、LDH、GSH-PX和NO水平。
1.2.7 Western blot检测相关蛋白表达各组细胞处理后用预冷的PBS缓冲液冲洗3次，用含1 mmol·L-1 PMSF的RIPA细胞裂解液提取细胞总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。每孔加入15 μL的蛋白样品进行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，分离并转移至PVDF膜上，BSA封闭液封闭2 h。加入一抗(1 ∶1 000)于4 ℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶偶联的二抗(1 ∶5 000)，室温孵育1.5 h，增强化学发光法(ECL)暗室显影。利用Image-Pro Plus 6.0软件分析条带灰度值。
1.2.8 统计学分析所有实验结果数据均采用x±s表示，采用GraphPad Prism 7软件对实验结果进行统计学处理。多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验。
2 结果 2.1 OMT对PA处理的HUVECs细胞存活率的影响为了评估OMT对PA损伤的HUVECs细胞存活率的影响，使用MTT法检测细胞存活率。选用不同浓度的OMT(0.1、0.3、0.6、1、3、10、30、300 μmol·L-1)处理细胞，结果显示OMT对细胞存活率无影响(Fig 1A)。选用不同浓度的PA(0.1、0.25、0.5、0.75、1、1.5 mmol·L-1)处理细胞，结果显示PA呈剂量依赖性地降低细胞存活率(Fig 1B)。根据PA对细胞存活率的检测结果，选取0.5 mmol·L-1作为后续实验的损伤浓度。与对照组相比，PA组明显降低细胞存活率，而OMT干预组则浓度依赖性地提高细胞存活率，但此作用明显被WT所抑制(Fig 1C)。此外，LDH是膜损伤的重要标志物，因此使用ELISA法检测细胞培养液中LDH水平。如Fig 1D所示，PA显著提高细胞培养液中LDH水平，而OMT则抑制PA诱导的LDH水平上调，此作用也明显被WT所抑制。这些结果表明，OMT可以改善PA诱导的血管内皮细胞损伤。
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| Fig 1 Effect of OMT on HUVECs injury in response to PA(x±s, n=6) A: MTT assay showed cell viability after 24 h treatment with OMT (0~300 μmol·L-1); B: MTT assay showed cell viability after 24 h treatment with PA (0~1.5 mmol·L-1); C: Cells were incubated for 4 h with the indicated concentrations of OMT (0.1, 0.3, 0.6 μmol·L-1) and then stimulated with PA (0.5 mmol·L-1) for 24 h, WT(0.1 μmol·L-1) was added into the culture medium 1 h before pretreated with OMT. Cell viability was measured by MTT assay; D: The level of LDH in cell culture medium was measured by ELISA. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs PA group; △△P < 0.01 vs OMT(0.6 μmol·L-1)+PA group |
为了确认OMT是否能减少PA诱导的HUVECs细胞凋亡，采用Annexin V-FITC/PI双染的流式细胞术分析。与对照组相比，PA组细胞凋亡率明显增加。与PA组相比，OMT干预组呈剂量依赖性地下调细胞凋亡率(Fig 2)。同时，Western blot法检测细胞凋亡标志物bcl-2、bax以及caspase-3的蛋白表达。如Fig 3所示，OMT有效抑制PA诱导的HUVECs细胞bcl-2/bax比值下调和caspase-3蛋白表达升高。这些结果表明，OMT改善PA诱导的血管内皮细胞凋亡。
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| Fig 2 Effect of OMT on PA-induced apoptosis in HUVECs(x±s, n=3) The apoptotic rate was detected by flow cytometry. **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs PA group |
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| Fig 3 Effect of OMT on protein expression of bcl-2, bax and caspase-3 in HUVECs subjected to PA(x±s, n=3) Western blot analysis of protein expression of bcl-2, bax(A) and caspase-3(B)in HUVECs. **P < 0.01 vs control group; ##P < 0.01 vs PA group. |
为了明确OMT对HUVECs细胞的保护作用是否与氧化应激有关，采用DCFH-DA染色进行细胞内ROS的检测。与对照组比较，PA组明显增加细胞内ROS水平，而OMT干预组剂量依赖性地降低其水平(Fig 4)。此外，ELISA法检测氧化应激相关指标。如Fig 5所示，在细胞培养液中，与对照组相比，PA组明显上调MDA水平并下调SOD和GSH-PX水平，而OMT干预组则剂量依赖性地逆转上述变化。这些结果表明，OMT减弱PA诱导的血管内皮细胞氧化应激损伤。
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| Fig 4 Effect of OMT on PA-induced ROS production in HUVECs (x±s, n=3) Intracellular ROS level was detected by flow cytometry. a: Control; b: PA (0.5 mmol·L-1); c: OMT (0.1 μmol·L-1)+PA; d: OMT (0.3 μmol·L-1)+PA; e: OMT (0.6 μmol·L-1)+PA. **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs PA group |
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| Fig 5 Effect of OMT on PA-induced oxidative stress in HUVECs(x±s, n=3) The levels of MDA(A)，SOD(B)and GSH-Px(C)in cell culture medium were measured by ELISA. **P < 0.01 vs control group；#P < 0.05，##P < 0.01vs PA group. |
为了探究OMT对PA诱导的血管内皮细胞损伤的保护作用机制，采用Western blot法检测NO信号相关蛋白表达。与对照组比较，PA组明显降低HUVECs细胞中Akt和eNOS的磷酸化蛋白水平，而OMT组则剂量依赖性地上调Akt和eNOS的磷酸化蛋白表达(Fig 6A，B)。由于Akt和eNOS的磷酸化蛋白表达升高可促进内皮细胞NO分泌，因此采用ELISA法对细胞培养液中NO水平进行检测。如Fig 6C所示，PA组显著降低细胞培养液中NO水平，而OMT干预组则逆转这一变化。结果表明，OMT通过激活Akt-eNOS-NO信号通路减轻PA诱导的血管内皮细胞损伤。
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| Fig 6 Effect of OMT on PA-induced endothelial Akt-eNOS-NO signaling pathways(x±s, n=3) The protein phosphorylation levels of Akt(A)and eNOS(B) were detected by Western blot; The level of NO(C)in cell culture medium was measured by ELISA. **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs PA group. |
CVD的防治一直备受医学界的关注，而血管内皮损伤是造成CVD的病理基础[9]。研究表明[10]，FFA对骨骼肌的胰岛素敏感性和内皮依赖性血管扩张造成损伤，而高脂增加血浆FFA水平会造成血管内皮损伤，进而导致血管并发症。PA是一种含16个碳的长链饱和脂肪酸，是最丰富的膳食脂肪酸，也是血浆中最常见的游离脂肪酸之一。本研究采用PA诱导的HUVECs细胞损伤模型，探讨OMT通过Akt-eNOS-NO信号通路改善PA诱导的HUVECs细胞损伤的作用。
脂毒性对血管内皮细胞具有损伤作用[10-11]。用PA处理HUVECs细胞后发现细胞存活率受到明显抑制，这与文献报道相符。LDH是一种存在于胞质中稳定的酶，是细胞受损或死亡的一个重要标志物。研究结果显示，PA诱导HUVECs细胞LDH水平的升高，而OMT则逆转此变化，表明OMT对PA诱导的细胞损伤具有保护作用。此外，用Akt抑制剂WT对细胞进行预处理后，显著抑制OMT升高HUVECs细胞存活率和降低LDH的效应，提示OMT对PA诱导的内皮损伤的保护作用与Akt信号通路的激活有关。
血浆中脂质的增加会引起氧化应激，并进一步触发血管内皮功能障碍和细胞凋亡[10-11]。PA诱导的细胞损伤主要是由于ROS生成增加和抗氧化酶受损[12]。正常生理条件下，ROS是重要的信号分子，当ROS的产生超过抗氧化能力时，就会发生氧化应激。研究发现，PA诱导HUVECs细胞产生大量ROS，而OMT则有效清除PA所产生的过量ROS，说明OMT能改善血管内皮细胞在高脂条件下所产生的氧化应激损伤。MDA是膜脂质过氧化的重要产物之一，是评价膜损伤程度的常用指标。许多抗氧化酶和非酶分子参与抵消ROS效应。线粒体产生的ROS的主要形式是超氧阴离子，而抗氧化酶SOD能将其转化为过氧化氢，随后可被GSH-PX转化为水[13]。通过测定抗氧化酶系统SOD与GSH-PX的活性，以及脂质过氧化物MDA的含量，发现OMT减弱PA诱导的MDA水平升高以及SOD和GSH-PX活性降低。表明OMT减弱脂质的过氧化，增强抗氧化酶活性，从而能改善细胞内的氧化应激状态。
血管内皮细胞中，线粒体不仅是ATP的主要来源，也是产生ROS的细胞器[14]，ROS是诱导凋亡的主要因素之一。Bcl-2家族分子接收和传递凋亡信号，负责凋亡上游的调控，主要通过线粒体途径来调控凋亡[15]。Bcl-2具有代表性的抗凋亡作用，大多位于线粒体外膜上，可调节线粒体外膜通透性。Bax是与bcl-2有拮抗作用的一种蛋白质，能够促进细胞凋亡。Bcl-2/bax比值是线粒体信号通路中的一个重要指标。研究结果显示，用PA刺激HUVECs细胞时，产生大量的ROS，而ROS的产生影响bcl-2和bax的表达，使bcl-2/bax比值降低，继而引起下游caspase级联反应中的caspase-3效应蛋白的表达，从而诱导细胞发生凋亡，但这种作用被OMT所阻断。提示OMT抑制PA诱导的内皮细胞线粒体依赖性凋亡。
血管内皮细胞是一种氧化还原敏感组织，对血管稳态的维持起着核心作用[8, 11]。NO是维持血管内环境稳定的重要信号分子，具有调节多种生命活动的作用，受eNOS催化前体L-精氨酸生成，并由Akt的激活触发[16]。血管内皮功能障碍的一个主要原因是NO的生物利用度降低，可能的原因是NO的合成减少，或者与氧化自由基的反应增加NO的分解有关[17-18]。研究发现，PA抑制HUVECs细胞中Akt和eNOS的磷酸化蛋白表达以及NO水平，而OMT的干预则逆转此种改变。提示OMT对PA诱导的血管内皮损伤的保护作用是通过Akt-eNOS-NO信号通路来实现的。
综上，OMT对PA诱导的血管内皮细胞损伤具有保护作用，其机制与Akt-eNOS-NO信号通路的激活有关。这些发现为OMT对血管内皮细胞损伤的干预提供科学依据。
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