2. 湖北药昇中药科技有限公司，湖北 枣阳 441200;
3. 浙江医药高等专科学校，浙江 宁波 315100
2. Hubei Yaosheng Chinese Medicine Science and Technology Corperation, Zaoyang Hubei 441200, China;
3. Zhejiang Pharmaceutical College, Ningbo Zhejiang 315100, China
藏药唐古特乌头Aconitum tanguticum (Maxim.)Stapf为藏药珍稀药材，藏药名为榜嘎，主要分布在中国青海、甘肃、西藏等高海拔地区，是藏药成方制剂中常用的药材，在藏医药中已使用了数千年的历史，深受各族人民的喜爱。本品性凉，味苦，具有清热解毒，生肌收口，燥湿之功效。其用于多种藏药成方制剂中，主治清热解毒，主要用于肝热、胆热、肺热、肝炎、肺炎、胃肠炎、流行性感冒、传染病引起的发烧、食物中毒、蛇蝎咬伤以及黄水病[1]。现代研究表明，榜嘎具有抗炎、抗病毒等药理活性[2]。
榜嘎化学成分主要以生物碱类和黄酮苷化合物为主。从榜嘎中分离得到的生物碱成分主要分为二萜类和苯丙胺类生物碱。目前，二萜类生物碱被认为是榜嘎发挥抗炎镇痛的主要活性成分[3]。据报道，阿替新(Atisine)和异叶乌头碱(Heteratisine)在榜嘎中的含量分别为0.084%和0.066%[4]；大麦芽碱含量为0.0238%[5]。唐古特乌头在藏药中应用广泛而且极为重要，在藏医临床应用方面，唐古特乌头同样发挥了举足轻重的作用，尤其是在冠状病毒防治上。在疫情爆发之初，西藏、青海等传承藏医药的省份就纷纷在防治方案中提到十二味翼首散、二十五味肺病胶囊、流感丸、二十五味主药散等藏医传统药物唐古特乌头的成方制剂，其中十二味翼首散早在“非典”时期就被广泛应用，对于藏医“年然”(意为疫病)引发的“炎症风暴”有着很好的防治作用，丰富了藏医药在治疗冠状病毒肺炎的应用[6]。虽然唐古特乌头在“炎症风暴”治疗领域做出了重要的贡献，但是目前仍缺乏其发挥治疗作用时系统的作用机制，所以，系统深入探索唐古特乌头抗炎作用机制显得尤为重要。网络药理学是一门新兴学科，涉及构建疾病表型、基因和药物的多层网络[7]。网络药理学有助于预测药物靶点、作用方式和相关通路。考虑到民族药成分和功能的复杂性，网络药理学被认为是识别关键靶点和信号通路的有效方法[8]。因此，本研究通过网络药理学方法，从系统、整体的角度将药物与疾病相联系，结合民族药物成分靶点网络与相关疾病靶点网络，从多个成分、靶点甚至多个通路预测民族药物作用于相关疾病的成分靶点和潜在作用机制；运用分子对接技术挖掘唐古特乌头活性成分抗炎的特异性及可能性；并且通过体外细胞实验验证网络药理学及分子对接预测结果。旨在系统阐述藏药唐古特乌头抗炎作用所涉及机制，为唐古特乌头的临床研究及潜在抗炎药物的发掘提供参考。
1 材料与方法 1.1 唐古特乌头的网络药理学研究 1.1.1 唐古特乌头活性成分的靶点预测通过文献检索、实验室前期研究等方法收集唐古特乌头的主要单体化学成分。使用PubChem数据库[9](https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、SwissTarget Prediction平台(http://www.swisstargetprediction.ch/)寻找唐古特乌头活性成分的相关靶点。
1.1.2 唐古特乌头抗炎的作用靶点预测及核心靶点筛选使用GeneCards(https://www.genecards.org/)、Omin(https://www.omim.org/)以及PHARMGKB(https://www.pharmgkb.org/)疾病靶点数据库，以“anti-inflammatory”、“inflammation”为关键词进行检索，并删除重复的基因。将唐古特乌头活性成分靶点和抗炎相关靶点导入Cytoscape Version 3.8.2软件，两者进行对比取交集，得出共同靶点，即为唐古特乌头抗炎的相关靶点。将共同靶点Degree参数值进行排序，以高于中位数的2倍为条件，即得出共同靶点中的核心靶点。
1.1.3 唐古特乌头抗炎作用的靶标蛋白之间的相互作用(protein protein interaction，PPI)网络构建将收集到的共同靶点导入到STRING数据库[10](https://www.string-db.org/)，设置物种及最高置信度为合适参数，构建PPI网络，通过Cytoscape Version 3.8.2软件将唐古特乌头的成分-靶点-疾病网络图进行呈现。
1.1.4 富集分析将活性成分与疾病的交集基因在DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)中进行基因本体论(gene ontology，GO)功能和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)分析[11]，通过GO富集获得靶点基因在体内可能涉及的细胞组分(cellular component，CC)、参与的分子功能(molecular function，MF)及其涉及到的生物学过程(biological process，BP)，从而综合分析得到这些基因的生物学功能；通过KEGG通路富集靶点所涉及的信号通路，以P < 0.05为筛选标准，分析唐古特乌头抗炎的主要信号通路及生物过程。利用微生信平台，对GO富集与KEGG富集结果进行可视化呈现。
1.1.5 成分靶点分子对接以“1.3”项下筛选出的部分核心靶点为受体，通过PDB数据库(https://www1.rcsb.org/)查找受体的3D结构文件[12]；以“1.1”项下收集到的唐古特乌头化学成分中二萜类生物碱活性成分为配体，利用PubChem数据库网站导出配体的3D结构文件[9, 13]；通过AutoDock Vina(1.1.2版本)软件进行分子对接，并用PyMOL软件将对接结果进行可视化。
1.2 体外细胞实验 1.2.1 主要试剂与仪器脂多糖(lipopoly saccharide，LPS)，美国Sigma公司；噻唑蓝([3- (4，5-Dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，MTT)，Biosharp公司；胎牛血清(FBS)，杭州天杭生物科技股份有限公司；DMEM基础培养基，Gibco公司；NO检测试剂盒，碧云天生物有限公司；TRNzol Universal总RNA提取试剂盒，天根公司；ABScript Ⅱ RT Master Mix for qPCR和TB GreenTM Premix Ex TaqTM，武汉爱博泰克生物科技有限公司；荧光定量PCR仪(BD公司，美国)，多功能酶标仪(TECAN)。其它试剂均为分析纯。
1.2.2 唐古特乌头醇提物的制备取干燥的唐古特乌头(标本号：LQE-2019-066)地上部分15 kg，粉碎，过30号筛，用5倍量的体积分数为0.97的乙醇常温浸泡24 h，反复6次，过滤，用旋转蒸发器回收溶剂，得唐古特乌头醇提物(ATS)。
1.2.3 唐古特乌头醇提物(ATS)化学成分的鉴别使用高效液相色谱技术(HPLC)对唐古特乌头醇提物中部分化学成分进行鉴别，精密称取ATS 0.5 g，置于5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀后即得0.1 kg·L-1的溶液；精密称取2 mg苯甲酰异叶乌头碱(6-Benzoylheteratisine)对照品和关附甲素(Guan-Fu Base A)对照品，分别置于10 mL容量瓶中，同时精密称取20 mg异叶乌头碱(Heteratisine)对照品置于2 mL容量瓶中，将上述对照品加甲醇溶解并定容，摇匀。临用前，将已定容的样品溶液和标准对照品溶液用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，注入高效液相色谱仪。
1.2.4 细胞培养与给药浓度确定RAW264.7小鼠巨噬细胞，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(CTCC)。用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养RAW264.7细胞，37 ℃，5% CO2培养。将RAW264.7细胞以5×103个/孔的密度接种于96孔板，培养至细胞对数生长期。分别以终浓度为3.125-200 mg·L-1 ATS孵育细胞24 h，MTT法检测细胞活力，确定给药浓度范围。
1.2.5 唐古特乌头抗炎药效评价将RAW264.7细胞按每孔100 μL接种在96孔板中，分别加入0.01~5 mg·L-1的ATS孵育2 h，再加入LPS(1 mg·L-1)孵育24 h，另外设置空白对照组和模型组(LPS 1 mg·L-1)，每组6个复孔。细胞给药结束后，每孔收集细胞上清液50 μL置于新的96孔板中，用Griess法试剂盒测定给药组及模型组NO释放量，并计算抑制率。
抑制率/%=(模型组OD-给药组OD)/(模型组OD-空白组OD)×100%
1.2.6 炎症通路相关基因水平的检测采用实时荧光定量RT-PCR方法，以GAPDH作为参照基因，检测iNOS及相关通路基因的mRNA相对于内参的表达水平。使用TRIzol试剂收集细胞样本，提取总RNA。试剂盒逆转录为cDNA，扩增体系如下：Stage 1 DNA聚合酶95 ℃预热变性，40 s；Stage 2循环体系95 ℃，15 s，58 ℃ 1 min中循环40次。相关基因扩增的引物序列如下：GAPDH：5′-ACCCAGA-AGACTGTGGATGG-3′(fw)，5′-TCAGCTCAGGGATGACCTTG-3′(rw)；JAK2：5′-TTGTGGTATTACGCCTGTGTATC-3′(fw)，5′-ATGCCTGGTTGACTCGTCTAT-3′(rw)；AKT1：5′-CTTTATTGGCTACAAGGAACGG-3′(fw)，5′-CAGTCTGAATGGCGGTGGT-3′(rw)；iNOS：5′-TGAGTTCCGAAGCAAGCCAA-3′(fw)；5′-AGACCTCAACAGAGCCCTCA-3′(rw)。
1.3 统计分析使用Microsoft Excel和GraphPad Prism 7软件进行统计分析。结果用x±s表示。组间差异采用ANOVA分析，并应用Dunnett检验分析各组数据差异。
2 结果 2.1 唐古特乌头主要活性成分及靶点筛选基于文献检索唐古特乌头的化学成分并根据本实验室前期研究获得唐古特乌头的主要活性成分17个。通过PubChem数据库、SwissTarget Prediction平台检索预测唐古特乌头活性成分的相关靶点，一共获得450个预测靶点。唐古特乌头主要活性成分信息见Tab 1。
| No | Name | CAS | Formula | Structure type |
| 1 | 6-Benzoylheteratisine | 99759-48-5 | C29H37NO6 | C19-diterpenoid alkaloid |
| 2 | Guan-Fu Base A | 1394-48-5 | C24H31NO6 | C20-diterpenoid alkaloid |
| 3 | Atisine | 52341-40-9 | C22H31NO5 | C20-diterpenoid alkaloid |
| 4 | Heteratisine | 3328-84-5 | C22H33NO5 | C19-diterpenoid alkaloid |
| 5 | Tangutisine B | - | C32H35NO9 | C20-diterpenoid alkaloid |
| 6 | Venulol | - | C20H27NO2 | C20-diterpenoid alkaloid |
| 7 | Barbisine | 128332-16-1 | C32H35NO9 | C20-diterpenoid alkaloid |
| 8 | Hordenine | 539-15-1 | C10H15NO | Amphetamines |
| 9 | heterophylline | 482-91-7 | C22H26N2O4 | C19-diterpenoid alkaloid |
| 10 | Naviculine B | - | C20H27NO2 | C20-diterpenoid alkaloid |
| 11 | Daucosterol | 474-58-8 | C35H60O6 | Daucosterol |
| 12 | Eucalyptone | 172617-99-1 | C28H38O7 | Monoterpene |
| 13 | tangutisine A | - | C41H43NO11 | C20-diterpenoid alkaloid |
| 14 | naviculine A | - | C20H27NO2 | C20-diterpenoid alkaloid |
| 15 | Hetisinone | 4829-55-4 | C20H25NO3 | C20-diterpenoid alkaloid |
| 16 | Dehydroheteratisine | 52341-40-9 | C22H31NO5 | C20-diterpenoid alkaloid |
| 17 | Heterophyllidine | - | C21H31NO5 | C20-diterpenoid alkaloid |
基于GeneCards、Omin以及PHARMGKB数据库共筛选出疾病相关基因靶点349 6个，将上述450个活性成分靶点与349 6个疾病靶点取交集得到284个共同靶点，将收集到的共同靶点导入到STRING数据库，获取靶标蛋白之间相互作用(PPI)数据，以degree参数值为筛选条件，筛选得到AKT1、JAK2、MAPK1、MAPK3、TNF、STAT3、SRC、EGFR等37个核心靶点，使用Cytoscape Version 3.8.2软件进行可视化，其中节点的大小及颜色的深浅变化代表Degree值的大小，见Fig 1。这些基因有可能是唐古特乌头发挥抗炎作用的潜在作用靶点。利用Cytoscape Version 3.8.2软件呈现出唐古特乌头抗炎的“成分-靶点-疾病”网络，见Fig 2。
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| Fig 1 The PPI network map of target protein |
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| Fig 2 Network of "ingredient-target-disease" |
将活性成分与疾病的共同靶基因导入到DAVID数据库中进行富集分析，以P < 0.05为条件，对共同靶基因进行GO的CC、MF和BP分析，得到CC条目68个，MF条目129个，BP条目474个。选取所含靶点数目在前10个的CC和MF条目，前20个的BP条目，利用微生信平台进行结果呈现，见Fig 3。结果显示，在细胞组分中，细胞质膜、细胞质基质、胞质、细胞核占较大比例；分子功能主要涉及蛋白质结合、ATP结合等功能；生物过程主要涉及参与信号转导、蛋白质磷酸化、对药物的反应、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、炎症反应、凋亡过程的负调控、细胞增殖的正调控等生物学过程。同样的，以P < 0.05为条件，对共同靶基因进行KEGG通路富集分析，得到相关通路108条，选取所含靶点数目在前15条的通路，利用微生信平台进行结果呈现，见Fig 4。结果显示唐古特乌头发挥抗炎作用可能与PI3K-Akt、Ras、MAPK、HIF-1等信号通路及一些癌症信号通路有关。
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| Fig 3 GO function enrichment analysis |
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| Fig 4 KEGG pathway enrichment analysis |
利用AutoDock Vina(1.1.2版本)软件预测配体与受体结合的Vina得分，一般认为，Vina得分越低，表明受体和配体亲和力越高，对接活性越大，发生作用的可能性越大。将配体和受体的3D结构在AutoDock Vina中进行分子对接，结果见Tab 2。唐古特乌头活性成分与所对接的核心靶点均具有较高的亲和力，通过KEGG通路富集分析预测的PI3K-Akt信号通路中的关键靶点AKT1，JAK2也与唐古特乌头关键药效成分具有较大的对接活性。故选取AKT1，JAK2与部分活性成分的对接图进行展示，如Fig 5。
| Key target | Core compounds | |||||||
| 6-Benzoylheteratisine | Guan-Fu base A | Atisine | Heteratisine | Venulol | Barbisine | Tangutisine A | Hetisinone | |
| AKT1 | -11.7 | -12.8 | -12.4 | -11.8 | -12 | -11.8 | -13.1 | -12.5 |
| JAK2 | -12.6 | -12 | -13.2 | -12.2 | -11.4 | -12.6 | -15 | -11.1 |
| MAPK3 | -12.9 | -12.8 | -12.3 | -11.5 | -11.8 | -13.1 | -14 | -12.3 |
| TNF | -12.6 | -12.3 | -11.5 | -11.1 | -11.1 | -12.8 | -13.7 | -11.4 |
| MAPK1 | -11.4 | -10.7 | -10.9 | -10.2 | -10.6 | -11.4 | -11.3 | -10.6 |
| STAT3 | -12 | -12.6 | -12.9 | -11.9 | -11.9 | -11.5 | -13.8 | -11.6 |
| SRC | -10.2 | -12.5 | -11.6 | -10.5 | -10.9 | -10 | -10.5 | -11.4 |
| EGFR | -12.2 | -12.9 | -13.4 | -11.8 | -11.8 | -11.5 | -12.2 | -12.6 |
| HSP90AA1 | -11.2 | -10.7 | -11.9 | -9.6 | -12.7 | -10.7 | -11.8 | -10.2 |
| APP | -12.1 | -12.6 | -10.9 | -10.6 | -10.3 | -12.2 | -13.1 | -10.9 |
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| Fig 5 Molecular docking of AKT1 and JAK2 with compounds |
HPLC分析表明唐古特乌头醇提物(ATS)中含有6-Benzoylheteratisine、Guan-Fu Base A、Heteratisine这3种单体成分，见Tab 3。
| Compound | Parameter | HPLC |
| 6-Benzoylheteratisine | ZORBAX Extend-C18 column 4.6×250 mm，5 μm; Mobile phase：acetonitrile (A) and triethylamine phosphate (B); Gradient elution mode：0~15 min，70% B~50% B; 15~30 min，50% B; Column temperature：30℃，flow rate：1.0 mL·min-1; Detection wavelength：230 nm，the injection volume was 10 μL. | 
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| Guan-Fu Base A | ZORBAX Extend-C18 column 4.6×250 mm，5 μm; Mobile phase：acetonitrile (A) and 0.1 % phosphoric acid phosphoric acid aqueous solution (B); Gradient elution mode：0~18 min，90% B~72% B; 18~30 min，72% B; Column temperature：30 ℃，flow rate：1.0 mL·min-1，Detection wavelength：208 nm，the injection volume was 10 μL. |
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| Heteratisine | ZORBAX Extend-C18 column 4.6×250 mm，5 μm; Mobile phase：acetonitrile (A) and 0.1% trifluoroacetic acid aqueous solution (B); Gradient elution mode：0~30 min，90% B~65% B; Column temperature：30 ℃，flow rate：1.0 mL·min-1; Detection wavelength：215 nm，the injection volume was 10 μL. |
采用MTT法考察不同浓度唐古特乌头醇提物(ATS)处理后RAW264.7细胞增殖活性的影响，见Fig 6。与正常对照组比较，ATS在给药浓度为0~50 mg·L-1时对细胞增殖活性无明显抑制作用。后续选用0.01~5 mg·L-1浓度范围进行药效学实验。
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| Fig 6 Effect of Aconitum tanguticum on cell viability of RAW264.7 cells (x±s, n=5) NC: normal control, **P < 0.01 vs normal control |
如Fig 7(A)所示，LPS作用于RAW264.7细胞，细胞上清液中NO的释放量明显升高，与正常对照组相比差异具有显著性(P < 0.01)，说明已经成功建立LPS诱导RAW264.7细胞的炎症模型，与LPS组相比，ATS各浓度细胞上清液中的NO含量明显降低(P < 0.01、P < 0.05)。如Fig 7(B)所示，在未加LPS刺激的正常组细胞中，iNOS mRNA表达量较少。与正常组比较，LPS可以使iNOS mRNA水平明显上调(P < 0.01)，ATS(0.01、0.5 mg·L-1)可以不同程度的下调iNOS mRNA表达(与LPS组比较，P < 0.01)。表明ATS具有较好的抗炎作用，这与网络药理学预测唐古特乌头可以通过调节炎症相关通路发挥抗炎作用的预测相一致。通过RT-PCR法检测PI3K-Akt信号通路中的关键靶点AKT1、JAK2基因的相对表达量，结果表明，与正常组相比，LPS组中的AKT1、JAK2表达均明显上升(P < 0.01)，在经过ATS治疗后，AKT1、JAK2表达均表现为不同程度的下降(P < 0.01、P < 0.05)，见Fig 7(C，D)。说明唐古特乌头可以通过调节PI3K-Akt信号通路进而发挥抗炎作用，与网络药理学预测结果基本一致。
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| Fig 7 Effect of Aconitum tanguticum on LPS-induced AKT1, JAK2 mRNA levels in RAW264.7 cells (x±s, n=3) NC: normal control, ##P < 0.01 vs normal control; *P < 0.05, **P < 0.01 vs LPS |
唐古特乌头是民族地区的常用药材，具有清热解毒、祛风止痛的功效。国内外学者对唐古特乌头化学成分进行了大量的研究，现代研究表明，其提取物在抗病毒及抗肿瘤等方面显示有较好的活性。Fan等[14]从甘青乌头中分离出多种二萜生物碱，并对其中两种化合物对H1N1诱导细胞病变的抑制作用进行评估，结果表明这两种化合物均表现出对病变的抑制作用；张春江等[15]等通过体外细胞培养和小鼠脑炎模型试验综合评价了唐古特乌头醇提物对单纯疱疹病毒II型(HSV-2)的抑制作用，实验结果表明其可能是通过直接灭活病毒起到抗病毒的作用的；Li等[16]还从甘青乌头地上部分首次分离得到Tangutidines A~C等3个生物碱，细胞毒性实验显示这3个生物碱均具有较低细胞毒性，这也与唐古特乌头在藏医药认为“白乌头性凉无毒”的描述相一致；在唐古特乌头中分离出的naviculine A被证明对人肠腺癌(LoVo)细胞具有抗增殖作用[17]，显示有抗肿瘤的潜力；此外，除唐古特乌头碱性化合物外，有研究者还评估了非生物碱成分的生物活性，并发现唐古特乌头醇提物中酸性及中性部位具有良好的抗炎镇痛活性[18]；据报道[19-20]，唐古特乌头总生物碱也具有很好的体内抗炎活性，但是其系统的抗炎机制却鲜见报道。本研究通过应用网络药理学，分析唐古特乌头抗炎作用靶点，构建唐古特乌头抗炎作用靶点的相互作用网络，预测了其发挥抗炎作用的潜在核心靶点，富集分析抗炎作用相关的生物学过程和信号通路，并运用分子对接技术和体外细胞实验验证唐古特乌头抗炎作用机制，为唐古特乌头的藏医临床研究及产品开发提供参考依据。
炎症反应是许多病理条件的中心特征，是机体在不断进化过程中形成的一种防御反应，也是促发多种疾病发展的主要病理过程。炎症反应前期阶段的目的是应对组织损伤和入侵的微生物[21-22]，活化的巨噬细胞通过产生细胞因子和其他促炎因子，从而介导大部分炎症细胞和病理学过程，此时的炎症反应有利于消除外界刺激，并且促进组织恢复其功能；但是随着炎症过程的持续，如反应时间过长或者反应过度时，会触发有害的免疫过程，其特征为不正常的产生促炎介质，进而促进多种疾病的发展，例如常见的心血管疾病、败血症和感染性休克等[23]。本实验通过网络药理学技术，得到了37个唐古特乌头发挥抗炎作用的潜在核心靶点，如TNF、AKT1、MAPK1、MAPK3、JAK2、TNF、STAT3等，这些靶点多与机体的免疫、炎症相关。NO是急性和慢性炎症的重要介质，LPS刺激RAW264.7细胞后，使得iNOS水平明显升高，接着诱导NO的过剩产生，进而刺激更多的炎症信号，加剧炎症反应[24]。通过对284个共同靶点进行GO、KEGG富集分析，最终得到多条与免疫炎症反应和癌症有关的信号通路，主要有PI3K-Akt、Ras、Rap1、MAPK、HIF-1等。分子对接结果显示，唐古特乌头关键活性成分如6-Benzoylheteratisine、Guan-Fu Base A、Atisine等与PI3K-Akt信号通路中的关键靶点AKT1、JAK2具有较高的对接活性，表明这几种成分单体可能是发挥抗炎作用的主要化学成分。体外细胞炎症模型进一步研究发现，唐古特乌头能够抑制LPS所致RAW264.7细胞上清液中NO的释放，并且减少iNOS的表达，表现出显著的抗炎药效。实时荧光定量RT-PCR检测表明，唐古特乌头抗炎药效与调节PI3K-Akt信号通路密切相关。LPS刺激的RAW264.7细胞通过激活AKT1，刺激NF-κB释放，并进一步促进炎症因子的表达[25]。
综上所述，本研究应用网络药理学，筛选出唐古特乌头发挥抗炎作用的潜在核心靶点和可能的信号通路，并通过分子对接验证了活性成分与靶点之间有较好的亲和力，且通过对接结果推测6-Benzoylheteratisine、Guan-Fu Base A、Atisine可能为唐古特乌头发挥抗炎作用的关键单体。通过体外细胞实验初步验证了唐古特乌头醇提物对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型的治疗作用及机制，证实其具有显著的体外抗炎活性。研究结果有助于更好地推进民族药唐古特乌头的开发应用。
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