2. 南方医科大学，南方医院肾内科，器官衰竭防治国家重点实验室，国家肾脏病临床医学研究中心，广东 广州 510515
2. The State Key Laboratory of Organ Failure Research, Division of Nephrology, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China
肾间质纤维化是各种慢性肾脏疾病发展到末期的共同病理结果，常伴有肾小管萎缩和细胞外基质ECM(纤维连接蛋白和Ⅰ型胶原)沉积、肌成纤维细胞数量增加、毛细血管闭塞、大量炎症细胞浸润，其纤维化程度与肾功能衰竭程度密切相关[1]。全世界70岁以上的成年人中，有一半患有慢性肾病，占总人口的10%[2]。目前还没有减缓肾纤维化的靶向治疗方法，很大一部分慢性肾病患者最终发展为终末期肾功能衰竭，只能依赖透析或肾移植维持生命。随着全世界肾衰竭发生率的不断上升，慢性肾病已成为一个重大的公共卫生问题，预防或延缓导致终末期肾衰竭的肾功能不全是慢性肾病药物研发的最重要目标。因此，开发有效的治疗药物对于阻止疾病恶化至关重要。单侧输尿管梗阻(unilateral ureteric obstruction，UUO)模型是目前研究最广泛的肾间质纤维化动物实验模型，该模型造模时间短，重复性好，可很好的模拟临床上输尿管梗阻性疾病以及肾纤维化的过程[3]。
磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDEs)抑制剂是一种抑制PDEs活性的药物，广泛应用于勃起功能障碍、肺动脉高压、心衰、哮喘等疾病中[4]。越来越多的研究显示，PDE5抑制剂他达拉非[5]、西地那非、伐地那非[6]具有改善肾纤维化的作用。而传统的PDE5抑制剂选择性低、水溶性差、半衰期短(西地那非)，导致生物利用度低、副作用强，因此，本课题组在中国专利(CN102020645A)[7]公开的西地那非类似物WYQ基础上，对其结构继续进行优化改造，通过成盐和共晶筛选，最终选出优良晶型CPD1(Fig 1)，其水溶性及肠溶性得到大幅提升，降低了药物治疗剂量，从而提升生物利用度[8]。本课题组前期研究已经证实，CPD1可通过抑制肺动脉高压模型大鼠的肺动脉平滑肌细胞中钙通道功能治疗肺动脉高压[9]，因此，本研究继续探索了CPD1在肾脏疾病中发挥的作用。
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| Fig 1 The structural formula of CPD1 |
本研究使用UUO小鼠模型，观察新型PDE5抑制剂CPD1对肾纤维化病理学组织结构的改善，胶原纤维的沉积以及纤维化标志蛋白和肾损伤分子表达水平的影响。初步验证CPD1对肾间质纤维化的治疗作用，为进一步探讨CPD1作用于肾间质纤维化的分子机制奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物♂ C57BL/6 J小鼠(8周龄)，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司(43072711100365523)，饲养于广东药科大学实验动物中心，SYXK(粤)2017-0125。本实验方案严格遵循广东药科大学动物伦理委员会(编号：gdpulacspf2017027)制定的动物护理方针。
1.1.2 试剂CPD1(ET32637-37-P1)委托天津药明康德新药开发有限公司合成，CPD1经COA分析测定纯度达99%。青霉素、二甲苯、无水乙醇购自美国sigma aldrich公司。SDS、甘氨酸、吐温20、30%Acrylamide、1.0 mol·L-1 Tris-HCl(pH 6.8)、1.5 mol·L-1 Tris-HCL(pH8.8)、40×TBST粉剂均购自上海生工生物技术有限公司。HE染色试剂盒(C0105)，Sirius Red试剂盒(Solarbio，G1470)，SP试剂盒(中杉金桥，SP-9001)，DAB(中杉金桥，ZLI-9017)，RIPA裂解液(碧云天P0013B)、磷酸酶蛋白酶抑制剂(碧云天P1051)、PMSF(碧云天ST506)。一抗：α-SMA(CST 19245)、FN(ab 2413)、Collagen-I(CST 91144)、Kim-1(R&D AF1817)、α-tubulin(sigma T5168)，二抗(JAX 111-035-003)。脱脂奶粉，BSA(上海生工)。
1.1.3 仪器分析天平(BP221S，德国Sartorius)，倒置显微镜(Leica德国)，ChemiDoc+XRS化学发光凝胶成像系统(Bio-Rad)，移液器(Eppendorf)，烘箱(DH6-9143B5-Ⅲ，上海新苗)，石蜡包埋机(MPS/P1，德国SLEE)，低温离心机(美国Thermo)，-80 ℃冰箱(中国美菱)，纯水仪(EPED-2TF)。
1.2 方法 1.2.1 UUO小鼠模型的构建将体质量为20~22 g的雄性C57BL/6 J小鼠随机分为3组，每组6只，分别为假手术组、单侧输尿管结扎组(UUO模型组)、单侧输尿管结扎CPD1干预组(UUO+CPD1(5 mg·kg-1))。手术前称重，用1.25%三溴乙醇腹腔注射麻醉小鼠，剔除小鼠左侧腹部毛发，75%酒精常规消毒后，将小鼠右侧卧固定于手术台上。于腹部左侧斜切约0.5 cm皮肤切口，逐层剪开腹壁，弯镊拨开脂肪暴露并游离左侧肾脏和输尿管，用5-0细线将输尿管两点结扎后从中间剪断。结扎成功后用抗生素清洗腹腔、逐层缝合、涂抹碘伏，并将小鼠置于恒温垫上待其苏醒。假手术组经过同样的操作步骤仅游离输尿管，不结扎。治疗组：将CPD1溶于生理盐水，于造模2 h后予以药物灌胃治疗，每天1次，持续7 d，假手术组和模型组予以同体积生理盐水直至模型结束。
1.2.2 标本收集实验结束时将小鼠安乐死，摘取小鼠患侧肾脏，快速投入冰PBS中清洗表明血渍，摘取的肾脏沿冠状面切开，一部分置于4%多聚甲醛固定液中固定，另一部分组织冻于液氮中保存进行后续Western blot检测。
1.2.3 肾脏HE、Sirius Red染色肾脏组织固定24 h，常规脱水、石蜡包埋，切成厚3 μm切片，进行HE和Sirius Red染色，观察肾脏病理形态学改变和肾脏胶原纤维的沉积。
1.2.4 肾脏免疫组化染色切片常规脱蜡至蒸馏水，PBST洗3次，抗原修复，加入金桥SP-9001试剂1阻断内源性过氧化物酶，室温孵育10 min。用山羊血清室温封闭1 h。孵育一抗α-SMA(1:100)/FN(1:100) 4 ℃过夜。d 2 PBST洗3次后，滴加生物素标记山羊抗兔IgG聚合物，室温孵育15 min，PBST洗3次。滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育15 min，PBST洗3次。DAB显色，苏木精复染3 min，分化、反蓝、脱水、透明、封片。
1.2.5 肾脏Western blot检测取适量肾脏组织于加入磷酸酶和蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液中，充分研磨后，4 ℃，12 000×g，离心20 min，取上清得组织总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，蛋白变性后于-80 ℃保存。制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶，每孔上样30~40 μg总蛋白，电泳，转膜，5%牛奶室温封闭2 h，一抗4 ℃过夜孵育：α-SMA(1:1 000)、FN(1:1 000)、collagen-I(1:1 000)、Kim-1(1:1 000)、α-tubulin(1:5 000)，室温孵育二抗(1:5 000)1 h。点化学发光试剂曝光显影，采用Image Lab软件进行半定量分析。
1.3 统计学分析采用Graphpad Prism8.0软件进行统计学分析。计量资料以x±s表示，两组之间比较采用Student′s t检验，多组比较采用单因素方差分析和Tukey’s检验。
2 结果 2.1 CPD1对UUO模型小鼠肾脏组织结构损伤的影响HE染色观察CPD1治疗对UUO小鼠患侧肾脏组织结构损伤情况的影响。结果显示：假手术组(sham)小鼠肾脏组织结构基本正常无病变，肾小管饱满；UUO模型组小鼠组织中肾小管扩张，肾小管上皮细胞可见疏松、肿胀和空泡变性，肾小球基底膜增厚，肾脏间质炎性细胞浸润明显，肾间质宽度增加，纤维化明显；与UUO模型组相比，UUO+CPD1治疗组中肾小管空泡变性较少，病变程度明显减轻(Fig 2)。提示CPD1可有效改善输尿管梗阻引起的肾脏组织结构损伤。
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| Fig 2 CPD1 alleviated UUO-mediated renal pathological injury HE staining of kidney tissue sections. Scale bar, 200 μm (A) and 100 μm (B). |
利用Sirius Red染色观察CPD1对UUO小鼠肾脏组织胶原纤维沉积情况的影响。结果显示：sham组小鼠患侧肾脏组织结构完整，基本无红色阳性着色，胶原阳性染色区域主要位于系膜区、肾小管间质的毛细血管周围；UUO模型组肾脏间质及小管处可见明显的天狼星红阳性区域，表明有大量胶原沉积；与模型组相比，UUO+CPD1治疗组中小管间质胶原沉积明显减少(Fig 3)，表明CPD1干预可明显减少输尿管梗阻引起的肾间质胶原纤维沉积，延缓肾纤维化的进展。
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| Fig 3 CPD1 alleviated UUO-mediated renal collagen deposition Sirius Red staining of kidney tissue sections. Scale bar=50 μm. |
为了进一步探究CPD1对纤维化标志蛋白表达的作用，利用免疫组化染色(IHC)和Western blot方法检测了小鼠肾脏组织中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤维连接蛋白(fibronectin，FN)、Ⅰ型胶原(collagen-Ⅰ)和肾损伤分子-1(kidney injury molecule-1，Kim-1)的分布情况及表达水平。IHC结果显示：与sham组相比，UUO模型组肾脏间质处可见大量α-SMA(Fig 4)和FN(Fig 5)着色阳性区域；UUO+CPD1治疗组中阳性着色面积明显低于模型组(P < 0.05)。Western blot结果显示：经CPD1干预后，纤维化蛋白标志分子FN、collagen-I、α-SMA的表达水平明显性降低，该结果与免疫组化染色结果一致。UUO+CPD1治疗组中肾损伤分子Kim-1的表达也明显低于模型组(P < 0.05)(Fig 6)，提示CPD1明显降低UUO小鼠患侧肾脏组织中纤维化标志蛋白的表达，减轻输尿管梗阻引起的肾损伤，有效延缓疾病进展。
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| Fig 4 Effect of CPD1 on α-SMA expression in UUO mouse kidney by IHC Scale bar, 200 μm (A) and 100 μm (B). Statistical analysis. **P < 0.01 vs sham; #P < 0.05 vs UUO (C). |
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| Fig 5 Effect of CPD1 on Fn expression in UUO mouse kidney by IHC Scale bar, 200 μm (A) and 100 μm (B). Statistical analysis. **P < 0.01 vs sham; #P < 0.05 vs UUO (C). |
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| Fig 6 Effect of CPD1 on protein levels of of FN, collagen-I, α-SMA, Kim-1 in UUO mouse kidney by Western blot A: Representative results of Western blot. The numbers (1, 2, 3…) represent each individual mouse; B~E: Statistical analysis relative levels of fibronectin, collagen-I, α-SMA and Kim-1, *P < 0.05 vs UUO. |
肾纤维化是创面愈合过程的病理延伸，以损伤、炎症、肌成纤维细胞激活和迁移、基质沉积和重塑为特征，是所有慢性和进行性肾病的共同最终途径，也是肾功能不全的主要决定因素[10]。在UUO模型中，梗阻造成的压力使输尿管扩张，压力传至肾小管导致小管上皮细胞受到机械性损伤，肾小球滤过率(GFR)降低。在UUO早期的1~2 h内肾血流量(RBF)增加，随着阻塞时间的延长，RBF逐渐减少，使毛细血管收缩导致血供不足。当肾脏轻度损伤后，由肌成纤维细胞产生的细胞外基质最初可能有助于组织修复过程，随后即被再吸收。然而，在CKD发生的慢性损伤中，细胞外基质蛋白持续不受抑制的过度沉积，致使毛细血管稀疏，减少了肾小管周围的血流量，导致肾小管缺氧和肾单位脱落，最终破坏器官结构、导致肾功能衰竭。因此，抑制细胞外基质的沉积是改善肾纤维化的首要目标，我们的研究结果发现，CPD1可使肾脏组织结构得到改善，降低细胞外基质胶原的沉积。α-SMA是肌成纤维细胞的特异性标志蛋白，在生理状态下主要表达于平滑肌组织和心肌组织中，肾脏中表达较低。而在病理条件下，发生上皮间质转化(EMT)，使α-SMA的表达升高，因此α-SMA的表达水平反映了肾间质纤维化的进展。Fibronectin主要由肾小球系膜细胞分泌，分布在系膜区，在正常肾脏组织中表达较低，有研究发现，UUO模型中肾脏组织fibronectin的表达量与造模时间成正比，反映了纤维化的严重程度[11]。本研究结果显示，UUO模型小鼠经CPD1干预后，α-SMA和细胞外基质蛋白fibronectin、collagen-I的表达均得到明显抑制。Kim-1是一种磷脂酰丝氨酸受体，由受损的近端肾小管上皮细胞表达，在肾小管间质纤维化过程中起重要作用。在临床研究中，Kim-1被作为肾小管损伤的早期诊断指标[12]。本研究发现，CPD1干预可有效降低Kim-1蛋白的表达，表明CPD1通过下调细胞外基质ECM沉积，减少Kim-1介导的肾损伤，抑制单侧输尿管梗阻诱导的肾间质纤维化进展，CPD1可能参与了肾小管上皮细胞的上皮-间质转化以及对系膜细胞的激活抑制具有调控作用。
环磷酸鸟苷(cGMP)是重要的第二信使，在不同的器官和细胞类型中调节各种生理功能，如血管扩张、炎症和凋亡。有研究报道，提高cGMP水平对包括肾脏在内的各种器官均显示出有效的抗纤维化效果[13]。cGMP的细胞浓度是由其合成和降解之间的平衡决定的，磷酸二酯酶5(PDE5)是特异性催化cGMP水解的酶，可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)刺激剂和PDE5抑制剂，均可使cGMP浓度增加[14]。PDE5抑制剂通过其下游信号转导，在治疗慢性肾病(CKD)患者的肾纤维化方面显示出潜力[15]。本课题组自主研发的新型PDE5抑制剂CPD1克服了传统的PDE5抑制剂水溶性和肠溶性差、对PDE5特异性不强(西地那非对PDE5特异性仅为PDE6的10倍，而WYQ有3 000倍)、副作用较大的缺点，有效提高了药物生物利用度且具有更稳定的理化性质(中国发明专利申请号：201910505948.5)。本研究利用UUO模型，观察了CPD1对肾纤维化小鼠的治疗作用，从病理学以及分子层面进行验证。
综上所述，新型PDE5抑制剂CPD1改善肾纤维化的作用可能是通过降低纤维化相关蛋白的表达、减少Kim-1介导的肾损伤产生的，但其具体的作用分子机制还有待进一步探索，本研究对抗肾纤维化新药的开发和临床研究具有重要意义。
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