2. 贵州医科大学 天然药物资源优效利用重点实验室，贵州 贵阳 550025;
3. 暨南大学肿瘤药理研究所，广东 广州 510632
2. Key Laboratory of Optimal Utilization of Natural Medicinal Resources, Guizhou Medical University, Guiyang 550025, China;
3. Jinan University Institute of Tumor Pharmacology Research, Guangzhou 510632, China
乳腺癌是全球女性中最常见的恶性肿瘤[1]。约70%为雌激素受体(estrogen receptor，ER)阳性，抗雌激素的内分泌治疗是该类患者主要的治疗手段[2]。作为最有效和最常用的抗雌激素药物，他莫昔芬(Tamoxifen，TAM)已被证实可大大延长乳腺癌患者的生存期[3]。尽管大多数患者从这种治疗中获益，但临床数据显示，大约50%的患者对他莫昔芬产生耐药性，最终导致复发和死亡[4]。
G蛋白偶联雌激素受体(G-protein coupled estrogen receptor，GPER)，又称GPR30，在结构上不同于经典的ERα和ERβ，是一种新型雌激素受体，介导多种雌激素反应[5]，并在获得性他莫昔芬耐药中起重要作用。据有关文献报道，他莫昔芬对GPER具有激动作用，体内外研究数据表明，GPER的表达与他莫昔芬耐药密切相关[6]，同时也是影响他莫昔芬治疗过程的一个不利生存因素。G15是一种取代的二氢喹啉类似物，可抑制GPER，有望应用于增加他莫昔芬耐药细胞敏感性[7]。因此，本研究探讨GPER抑制剂G15能否增加TAM对T-47DTR耐药细胞诱导凋亡的作用，恢复耐药细胞对他莫昔芬的敏感性，为抑制GPER增加耐药细胞对治疗药物敏感性提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 药品与试剂人乳腺癌他莫昔芬耐药细胞株T47D Tam1(CRL-3436TM，T-47DTR)购自美国ATCC公司，人乳腺癌T-47D细胞株购于中国科学院昆明细胞库。高糖DMEM培养基(Gibco公司)，胎牛血清(Gibco公司)。4-OHT(Cat#ab143638)购自Abcam公司，G15(Cat#14673)购自Sigma公司；BCA蛋白定量试剂盒(Cat#23227)购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；细胞膜蛋白与细胞质蛋白抽提试剂盒(Cat#P0033)购自碧云天生物技术有限公司。MTT粉末(Cat#M8180)购自北京索莱宝公司。caspase-9/p35/p10单克隆抗体(Cat#66169-1-Ig)，caspase-3/p17/p19单克隆抗体(Cat#66470-2-Ig)，BAX多克隆抗体(Cat#50599-2-Ig)，Bcl2多克隆抗体(Cat#26593-1-AP)抗体均购自proteintech公司；Na+, K+-ATPase α1(Y10)多克隆抗体(BS1436)，β-actin(4D3)单克隆抗体-HRP(Cat#BS6007M)，羊抗鼠IgG(H+L)HRP(Cat#BS12478)，羊抗兔IgG(H+L)HRP(Cat#BS13278)抗体均购自Bio-World公司；GPER多克隆抗体(Cat#PA5-28647)购自美国Invitrogen公司。
1.2 主要仪器3111二氧化碳培养箱(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；ChemiDoc XRS+凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)；ACEA NovoCyte 3008流式细胞仪(美国艾森公司)；MicrofugeⓇ 20R冷冻离心机(美国Beckman Coulter公司)；ELX800酶标仪(美国BioTek公司)。
1.3 方法 1.3.1 细胞培养T47D Tam1(T-47DTR)细胞系按照ATCC的标准方案进行培养，在培养基中补充1 μmol·L-1 4-OHT以维持他莫昔芬的耐药性。其中T-47DTR使用含有10%胎牛血清(FBS)和10 mg·L-1胰岛素的DMEM培养液培养。T47D细胞系在添加10% FBS的DMEM中培养。所有细胞均在5% CO2和37 ℃条件下培养。
1.3.2 MTT法检测细胞存活率取对数生长期T-47D/TR耐药细胞或其亲本细胞T-47D, 按照8×103个/孔接种于96空板内，培养24 h后，给予不同浓度4-OHT(0.5、1、2.5、5、10 μmol·L-1)作用48 h，另设阴性对照(Control组)，每组5个复孔。然后将MTT溶液(5 g·L-1，20 μL)添加到每个孔中并再孵育4 h。然后除去培养基，加入DMSO(100 μL/孔)并充分混合。使用酶标仪在570 nm处测量吸光度(OD)值。重复3次，将所得数据进行计算，得出各浓度药物下的抑制率(inhibition rate，IR)，IR/%=[(OD对照组-OD4-OHT)/OD对照组]×100%。
1.3.3 Western blot检测蛋白表达取对数生长期T-47DTR耐药细胞接种于6孔板内，按照实验分组T-47DTR、T-47DTR+4-OHT(2 μmol·L-1)、T-47DTR+G15(5 μmol·L-1)和T-47DTR+4-OHT(2 μmol·L-1)+G15(5 μmol·L-1)给药48 h后。使用含有PMSF(1 mmol·L-1)和蛋白酶抑制剂混合物(1 ∶100)的裂解缓冲液提取细胞总蛋白，离心并收集上清，采用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。按照45 μɡ共20 μL分装各组蛋白并进行电泳，湿法转膜，2%牛血清白蛋白封闭。封闭完成后，根据抗体说明书稀释一抗，4 ℃孵育过夜，再加入相应二抗室温孵育90 min，采用Bio-Rad凝胶成像系统获取图像，并使用Image Lab分析软件计算蛋白印迹结果的灰度值。
1.3.4 细胞凋亡检测取对数生长期T-47DTR耐药细胞接种于6孔板内，按“1.3.3”项给药48 h后，用不含EDTA胰酶消化收集细胞，PBS洗涤细胞两次，2 000 r·min-1，5 min收集1×105细胞，进行FITC/PI双染，室温避光反应15 min后进行流式细胞仪检测。
1.3.5 膜浆分离分析根据试剂盒说明书方法，分离细胞膜蛋白和细胞质蛋白，通过Western blot定量分析GPR30在细胞内分布的变化。
1.3.6 统计学处理所有结果均表示为至少3个独立实验的平均值±标准差。使用t检验分析两组之间的差异，并使用单因素方差分析分析多组之间的差异。
2 结果 2.1 4-OHT对T-47D和T-47DTR细胞生长抑制的影响MTT结果显示，不同浓度4-OHT(0.5、1、2.5、5、10 μmol·L-1)作用48 h后，与T-47D亲本细胞相比，T-47DTR耐药细胞对4-OHT的抵抗性明显增强，其4-OHT对T-47D和T-47DTR细胞的IC50值分别为(2.69±0.16)μmol·L-1、(26.65±0.03)μmol·L-1，两者比较差异具有统计学意义(Fig 1)。
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| Fig 1 Effect of 4-OHT on growth inhibition of T-47D and T-47DTR cells(x±s, n=3) *P < 0.05, **P < 0.01 vs T-47D/TR |
如Fig 2所示，与T-47D亲本细胞相比，T-47DTR耐药细胞中GPER蛋白表达明显上调；在T-47DTR耐药细胞中，给予4-OHT作用48 h后，与空白对照组比较，GPER在细胞膜内易位增加，给予G15处理后能明显降低4-OHT诱导的T-47DTR细胞中GPER蛋白表达上调(Fig 3)。
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| Fig 2 Expression of GPER protein in T-47D and T-47DTR cells(x±s, n=3) A: The representative photographs; B: The statistical analysis. **P < 0.01 vs T-47D. |
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| Fig 3 Effect of G15 on GPER protein expression of T-47D/TR cells(x±s, n=3) A: The representative photographs; B: The statistical analysis. *P < 0.05 vs T-47D/TR; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs T-47D/TR; ΔP < 0.05, ΔΔP < 0.01 vs T-47D/TR+4-OHT. |
与单用4-OHT组或对照组相比，4-OHT联用G15组总凋亡率增加，表明G15可增强4-OHT对T-47DTR细胞的抑制作用(Fig 4)，结果提示，G15能够增加T-47DTR耐药细胞对他莫昔芬的敏感性。
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| Fig 4 Apoptosis in T-47DTR cells induced by G15(x±s, n=3) A: The representative photographs; B: The statistical analysis. 1:T-47DTR; 2:T-47DTR+4-OHT; 3: T-47DTR+G15; 4: T-47DTR+4-OHT+G15. **P < 0.01 vs T-47DTR+4-OHT. |
Western blot结果显示，与单用4-OHT组或对照组相比，4-OHT联用G15处理48 h后，T-47DTR耐药细胞中Bax表达显著增加，Bcl-2表达显著降低；cleaved-caspase 3和cleaved-caspase 9表达增加(Fig 5)。表明G15影响凋亡相关蛋白的表达从而恢复T-47DTR耐药细胞对他莫昔芬的敏感性。
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| Fig 5 Effect of G15 on expression of apoptosis-related proteins in T-47DTR cells(x±s, n=3) A: The representative photographs; B: The statistical analysis. *P < 0.05, **P < 0.01 vs T-47DTR+4-OHT. |
他莫昔芬是一种选择性雌激素受体(ER)调节剂，是世界范围内ER阳性转移性乳腺癌女性最常见的内分泌治疗药物，或作为疾病早期的辅助治疗药物，虽然极大地提高了患者生存率，但并非所有患者都能从其使用中获益[8]。在治疗过程中，原发性或获得性耐药经常出现，并成为乳腺癌内分泌治疗的主要障碍[9]，因此，迫切需要探索新的治疗策略，通过克服乳腺癌细胞的耐药性来提高TAM的疗效。
GPER是一种新的膜结合雌激素受体，约在50%的乳腺癌患者中表达，并被认为可以在乳腺癌细胞[10]中介导雌激素的快速效应。在长期使用他莫昔芬治疗的过程中可导致耐药的发生以及GPER的激活[11-13]，这与细胞表面GPER的表达增加有关，导致与生长因子受体的串扰增加，并导致细胞增殖增加[14-16]。同样，与我们上述观察到的结果一致，GPER在TAM耐药细胞中表达明显高于其亲本细胞，表明TAM耐药细胞中GPER被激活，以及GPER的膜易位在4-OHT处理后在TAM耐药细胞中增加。提示，GPER受体在TAM治疗的过程中起着关键作用。然而，目前，并未有针对GPER的药物上市。因此，本研究探讨GPER特异性抑制剂G15诱导T-47DTR耐药细胞凋亡，恢复耐药细胞对他莫昔芬的敏感性。首先，我们检测了T-47DTR耐药细胞中4-OHT联用G15对T-47DTR耐药细胞中GPER蛋白表达的影响。结果显示，给予G15可显著减少GPER的表达，与单用4-OHT或对照组相比4-OHT联用G15显著减少GPER表达。
已有研究表明，在TAM耐药的乳腺癌细胞中，GPER通过激活MAPK/ERK-TRIM2信号减少Bim (仅BH3促凋亡蛋白家族成员BCL2-L11)，从而减少TAM诱导的凋亡，促进ER阳性乳腺癌细胞中的他莫昔芬耐药性[17]。与上述研究结果相似，本研究结果显示，联用G15能够增加4-OHT诱导T-47DTR耐药细胞发生凋亡，上调凋亡相关蛋白Bax、cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9的活性，下调抗凋亡蛋白Bcl-2，表明G15可增强T-47DTR对他莫昔芬的敏感性。
综上所述，本研究表明G15通过抑制GPER的表达影响T-47DTR耐药细胞凋亡，恢复其对他莫昔芬的敏感性，GPER受体抑制剂G15有望作为耐药增敏剂应用于临床肿瘤耐药患者的治疗。
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