帕金森病(Parkinson’s disease PD)又称为震颤麻痹，是一种影响患者活动能力的中枢神经系统慢性疾病，起病隐袭，进展缓慢[1]。其主要病理特征是中脑黑质致密部多巴胺能神经元损伤，神经元内出现以α-突触核蛋白(α-synuclein)为关键成分的路易小体(Lewy body)，进而引起神经元变性、凋亡，导致脑部多巴胺水平降低[2]。文献研究表明，减少多巴胺神经元凋亡可一定程度改善PD的症状。目前临床上用于治疗PD的药物(司来吉兰和美多巴)均是通过提高多巴胺水平，从而减少神经元凋亡。然而，这些药物只能改善PD症状，并不能阻止病情的进展，也无法治愈疾病[1-3]。因此，寻找新的靶点，在PD发病早期进行基因修饰，抑制神经元凋亡，进而改善PD症状，是极为迫切的事情。
FK506结合蛋白38 (FKBP38)是FKBP家族蛋白之一，特征在于其相应的mRNA在人脑组织中显著表达[4]，包含FK506结合域并表现出肽基脯氨酰异构酶活性[5-6]。在小鼠胚胎发育过程中，FKBP38可通过拮抗Shh通路延缓神经管的关闭[7-8]。并且FKBP38的丢失还会导致后神经管细胞凋亡增加和发育异常[9]。此外，还有研究表明FKBP38通过其C端跨膜结构域锚定在线粒体外膜上，招募并帮助抗凋亡蛋白Bcl-2来抑制细胞凋亡[10-11]。这提示FKBP38可能是一种重要的细胞凋亡抑制剂[12]。但是，尚未有研究报道FKBP38在帕金森病中对多巴胺能神经元的作用。
因此，本文旨在探讨在PD体内外模型中FKBP38蛋白表达情况，并选用神经毒素诱导的PD体外模型，研究过表达和敲减FKBP38后，对多巴胺能神经元凋亡的作用。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物8周龄♂的C57BL/6小鼠30只，体质量(20~25) g，购买于广东省医学实验动物中心(广东佛山，编号：44007200085200)。小鼠每笼5只，饲养温度(21~25) ℃，12 h昼夜交替，自由饮水摄食，每周更换3~4次垫料，动物在开展实验前先适应性喂养1周。
1.1.2 细胞和慢病毒MN9D(小鼠中脑多巴胺神经元)细胞购自广州吉尼欧公司。FKBP38慢病毒载体购自广州赛业公司，慢病毒载体为LV-EFS>mFKbP8-PGK>Puro和LV-CMV>eGFP/T2A/Puro(以下分别简写为OV-FKBP38及OV-NC)，LV-U6>mFKbP8[shRNA#2]-PGK>Puro和LV-U6 >Scramble-shRNA-PGK>EGFP/T2A/Puro(以下分别简写为sh-NC及sh-FKBP38)，该慢病毒中含有FKBP38全长cDNA，所有结构都经DNA测序验证，转染效果经免疫印迹(Western blot)验证。
1.1.3 试剂RPMI1640(Lot：PM150110A)购自武汉普诺赛公司；胎牛血清购自于美国Gibco公司；胰酶(Lot：2120649)购买于美国Gibco公司；CCK-8(cell counting kit-8，批号：G909FA003)购自上海生物工程有限公司；DMSO购自于美国sigma aldrich公司；FKBP38抗体购自R&D公司；α-synuclein、Tom20和Bax抗体购自美国CST公司；Bcl-2抗体购自英国Abcam公司；TH抗体购买于美国Gibco公司；鱼藤酮和MPTP购自中国阿拉丁公司；MPP+购买于美国Sigma公司。
1.1.4 仪器二氧化碳培养箱CLM-170B-8-NF型(ESCO，新加坡)；二级生物安全柜AC2-4S1型(ESCO，新加坡)；EPED-2TF纯水仪(中国)；DYY-6C电泳仪(中国)；多管架自动平衡离心机TDZ5-WS型(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)；流式细胞仪(DXP AthenaTM，美国)；Leica倒置显微镜(Leica，德国)；酶标仪CMAXPLUS+ (美国)；化学发光凝胶成像系统ChemiDoc+XRS(Bio-Rad，美国)。
1.2 方法 1.2.1 小鼠分组及给药小鼠随机分为2组，每组15只：对照组、模型组。以腹腔注射的方式给予模型组小鼠10 mg·kg-1的MPTP，给予对照组小鼠相同体积的PBS。3 d注射1次，连续注射7次，在末次注射后的d 2进行脱颈椎处死小鼠，立即取脑，冰上操作，剥离纹状体和黑质，液氮速冻，后转至-80 ℃保存备用。
1.2.2 细胞培养及药物处理MN9D细胞用添加10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，于37 ℃、5%二氧化碳细胞培养箱中进行常规培养，每隔1天进行换液，2~3 d进行传代，待细胞密度为85%左右，根据不同条件进行刺激。鱼藤酮及MPP+采用完全培养基溶解，刺激细胞时采取全换液的方式进行。
1.2.3 细胞分组及感染将MN9D细胞分为FKBP38过表达组(OV-FKBP38)及对照组(OV-NC)、敲减FKBP38组(sh-FKBP38)及对照组(sh-NC)，将细胞铺板接种于6孔板，每孔接种细胞数2×105个，放置于培养箱常规培养。待细胞密度长于30%~50%时进行感染慢病毒实验，收集细胞提蛋白进行Western blot检验慢病毒感染效率。
1.2.4 CCK-8法检测细胞增殖活性将生长状态良好的MN9D细胞及转染慢病毒成功后的细胞制备成单细胞悬液并铺板接种于96孔板，每孔100 μL细胞悬液，每孔接种细胞数2×104个，放置于培养箱常规培养。实验分组为不同浓度(8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0)μmol·L-1的鱼藤酮处理MN9D组，及同浓度鱼藤酮分别处理OV-NC、OV-FKBP38、sh-NC、sh-FKBP38组。过夜培养待细胞贴壁后，吸出原培养基，更换为提前配好不同浓度鱼藤酮药物的培养基；继续放置培养箱培养不同时间后，向每孔添加10 μL CCK-8溶液，贴壁加入以免产生气泡，避光孵育，1~2 h后取出，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度(A值)。
1.2.5 Western blot检测蛋白水平在10 cm细胞培养皿中加入200 μL RIPA裂解液，裂解液含(RIPA、PMSF、蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂)，用无菌细胞刮缓慢刮下，置于冰上裂解10 min，超声破碎1~2次，每次30 s，4 ℃离心机12 000 r·min-1离心20 min后, 取上清于另一干净Ep管中，蛋白定量BCA法检测待测样品浓度。待测样品与5×上样缓冲液稀释混合，金属浴10 min。取同等质量蛋白样品在质量分数10%或12%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行电泳，恒压转膜至PVDF膜，室温下用5%脱脂奶粉封闭1 h或4 ℃过夜封闭。分别加一抗α-syn(1 ∶1 000)、FKBP38(1 ∶500)、Bax(1 ∶1 000)、TH(1 ∶1 000)、Tom20(1 ∶1 000)、Bcl-2(1 ∶2000)、β-actin(1 ∶5 000), 4 ℃孵育过夜。过夜孵育后TBST洗膜3次，二抗室温孵育1 h，再次TBST洗膜3次，ECL发光成像仪曝光。并应用ImageJ软件对目标蛋白和内参蛋白灰度值进行分析，相对表达量=目的蛋白灰度值/内参灰度值。
1.2.6 统计学方法采用GraphPad Prism 8.0软件进行数据处理，符合正态分布的计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVE)，组间多重比较采用Tukey法。
2 结果 2.1 PD体内模型中FKBP38表达情况如Fig 1所示，通过Western blot检测MPTP诱导的PD体内模型。结果显示，在小鼠脑纹状体和黑质区域，α-synuclein蛋白的表达量水平明显升高(P < 0.01)，TH表达量水平明显下降(P < 0.01)(Fig 1A)。而在MPTP诱导的PD小鼠脑纹状体区域中FKBP38表达水平明显下降(P < 0.01)，在黑质区域中FKBP38表达量无明显变化(Fig 1B)，说明在MPTP诱导的PD体内模型中FKBP38在纹状体中特异性下调，提示FKBP38与PD模型中的特异性蛋白(α-synuclein和TH)存在相关性。
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| Fig 1 Expression of FKBP38 protein in striatum and substantia nigra of PD model(x±s, n=3) A: α-synuclein/TH expression in striatum and substantia nigra; B: FKBP38 expression in striatum and substantia nigra. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control |
如Fig 2所示，通过Western blot检测鱼藤酮/MPP+(4 μmol·L-1)/(3 mmol·L-1)处理MN9D细胞24 h后的α-synuclein、TH、Tom20、FKBP38的表达。结果显示，在鱼藤酮刺激MN9D诱导的PD细胞模型中，α-synuclein表达水平明显升高(P < 0.01)，TH表达水平明显下降(P < 0.05)，表明鱼藤酮诱导的PD细胞模型构建成功(Fig 2A)，Tom20的表达水平没有变化，而FKBP38表达水平明显下降(P < 0.01)(Fig 2B)，表明FKBP38在鱼藤酮诱导的PD细胞模型中特异性降低。
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| Fig 2 Expression of FKBP38 in PD cell model(x±s, n=3) A: α-synuclein/TH expression in PD cells; B: Tom20/FKBP38 expression in PD cells. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control |
如Fig 3所示，利用携带FKBP38的慢病毒感染MN9D细胞。随后，我们利用Western blot检测FKBP38的表达水平。与MN9D组相比，OV-NC组和sh-NC组的FKBP38表达量均没有明显变化，说明选择的载体合适。与OV-NC组相比，OV-FKBP38组的FKBP38表达量明显上升(P < 0.05)，说明FKBP38过表达细胞构建成功。与sh-NC组相比，sh-FKBP38组的FKBP38表达量明显下降(P < 0.05)，说明FKBP38敲减细胞构建成功。
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| Fig 3 FKBP38 lentiviral transfection of MN9D cells(x±s, n=3) **P < 0.01 vs control |
如Fig 4所示，CCK-8检测不同浓度(8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0)μmol·L-1的鱼藤酮处理MN9D细胞8 h后，结果显示，显著抑制细胞增殖(Fig 4A)(P < 0.01)，4 μmol·L-1浓度时，细胞活力下降到对照组的49.52%，且用鱼藤酮(4 μmol·L-1)处理MN9D细胞不同时间，发现随着处理时间的增加，细胞活力降低加剧(Fig 4B)(P < 0.01)处理8 h时，细胞活力为对照组50.08%。因此，选用鱼藤酮(4 μmol·L-1)处理MN9D细胞8 h进行后续研究。
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| Fig 4 Effect of rotenone on viability of MN9D cells(x±s, n=3) A: Effects of different concentrations of rotenone on the viability of MN9D cells; B: Effects of rotenone on the viability of MN9D cells at different time points, *P < 0.05, **P < 0.01 vs control |
如Fig 5所示，鱼藤酮处理MN9D细胞8 h后，与sh-NC组模型组相比，sh-FKBP38组模型组的细胞活力明显下降(Fig 5A) (P < 0.01)，表明FKBP38敲减后加剧PD细胞活力下降。而与OV-NC组模型组相比，OV- FKBP38组模型组的细胞活力明显增强(Fig 5B)(P < 0.01)，表明过表达FKBP38可以明显改善PD细胞活力下降。
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| Fig 5 Effect of FKBP38 on decreased viability of PD cells(x±s, n=3) A: Effect of sh-FKBP38 expression in PD cells; B: Effect of FKBP38 over expression in PD cells. **P < 0.01 vs control; ##P < 0.01 vs Model |
如Fig 6所示，Western blot检测结果显示，与对照组相比，模型组经鱼藤酮处理MN9D细胞8 h后，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达明显下调(P < 0.05)，凋亡蛋白Bax的表达没有差异，但Bcl-2/Bax比值降低(P < 0.05)，表明鱼藤酮引起了多巴胺能神经元的凋亡。与OV-NC组模型组相比，OV-FKBP38组模型组的Bcl-2蛋白表达上升(P < 0.01)，Bax的表达量没有差异，Bcl-2/Bax比值上升(P < 0.01)，说明过表达FKBP38可以明显改善鱼藤酮引起的多巴胺能神经元凋亡。与sh-NC组模型组相比，sh-FKBP38组模型组的Bcl-2和Bax的表达量均无明显差异，表明敲减FKBP38无明显加剧鱼藤酮引起的多巴胺能神经元凋亡。
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| Fig 6 Effect of FKBP38 over expression on expression of Bcl-2, Bax protein in PD cells(x±s, n=3) A: Western blot analysis of Bcl-2 and Bax proteins; B: Effect of overexpression of FKBP38 on the ratio of Bcl-2/Bax protein in PD cells; C: Effect of knockdown of FKBP38 on Bcl-2/Bax protein ratio in PD cells. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control; ##P < 0.01 vs control |
帕金森病是一种进展非常缓慢的疾病，发病因素复杂，且不同患者病情轻重也存在很大的差异[13]。多巴胺是一种神经递质，将信息从一个神经细胞传至另一个神经细胞，保证神经的传导性，由多巴胺能神经元合成并储存在囊泡中，而后通过胞裂外排的方式由神经元释放，多巴胺能神经元的病变会导致帕金森病。这也是临床上导致PD的主要病理特征，减少神经元凋亡对缓解PD进程有重要作用[14]。目前，关于帕金森病治疗手段只能延缓但无法阻止疾病的进展[15]。基因治疗是帕金森病治疗的新兴领域，由于其发病机制复杂，其中线粒体功能障碍在帕金森病发生中具有重要作用[16-17]。因此以线粒体相关基因为靶点寻找新的治疗方法具有重要意义。同时，应深入研究线粒体功能障碍分子机制，明确线粒体相关基因对帕金森病的影响。
为研究FKBP38对神经毒素诱导的帕金森病的影响，本课题组检测在PD体内外模型中FKBP38表达水平，实验结果发现，在PD体内模型中，与正常组相比模型组小鼠脑纹状体区域中FKBP38表达水平明显降低。同样，在PD细胞模型中，与正常组相比FKBP38表达水平明显特异性降低。猜测高表达FKBP38可能会延缓多巴胺神经元凋亡从而缓解PD进程。为进一步探究FKBP38对帕金森病的影响，我们在体外实验中通过使用FKBP38慢病毒转染MN9D细胞来检测其表型变化。实验结果显示，鱼藤酮可明显降低MN9D细胞活力，并通过降低Bcl-2的表达量引起MN9D细胞凋亡。而过表达FKBP38后能明显改善鱼藤酮引起的细胞活力下降，表明过表达FKBP38可明显提高PD细胞活力。过表达FKBP38后，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量明显升高，Bcl-2/Bax比值明显升高，表明过表达FKBP38改善鱼藤酮引起的多巴胺能神经元凋亡可能是通过线粒体内源途径Bcl-2/Bax通路诱导的。说明过表达FKBP38在帕金森病的发展过程中发挥着抑制多巴胺能神经元凋亡的作用。这与先前研究中FKBP38锚定在线粒体外膜招募Bcl-2从而抑制凋亡作用相一致[11]。
综上所述，FKBP38表达在鱼藤酮诱导的PD细胞模型被特异性下调，敲减FKBP38加剧鱼藤酮诱导的细胞损伤，通过过表达FKBP38能够明显恢复鱼藤酮诱导的细胞活力下降，并抑制鱼藤酮引起的细胞凋亡。提示FKBP38与多巴胺神经元凋亡相关，有望成为治疗或者减缓帕金森病进程的重要靶点。
| [1] |
Choong C J, Sasaki T, Hayakawa H, et al. A novel histone deacetylase 1 and 2 isoform specific inhibitor alleviates experimental Parkinson′s disease[J]. Neurobiol Aging, 2016, 37: 103-16. doi:10.1016/j.neurobiolaging.2015.10.001 |
| [2] |
Lambourne O A, Mehellou Y. Chemical strategies for activating PINK1, a protein kinase mutated in Parkinson′s disease[J]. Chem Bio Chem, 2018, 19: 2433-7. doi:10.1002/cbic.201800497 |
| [3] |
Kalia L V, Lang A E. Parkinson′s disease[J]. Lancet, 2015, 386(9996): 896-912. doi:10.1016/S0140-6736(14)61393-3 |
| [4] |
Xiao P T, Xie Z S, Kuang Y J, et al. Discovery of a potent FKBP38 agonist that ameliorates HFD-induced hyperlipidemia via mTOR/P70S6K/SREBPs pathway[J]. Acta Pharm Sin B, 2021, 11(11): 3542-52. doi:10.1016/j.apsb.2021.03.031 |
| [5] |
Yoo S M, Yamashita S I, Kim H, et al. FKBP8 LIRL-dependent mitochondrial fragmentation facilitates mitophagy under stress conditions[J]. FASEB J, 2020, 34(2): 2944-57. doi:10.1096/fj.201901735R |
| [6] |
Xu S S, Xu L G, Yuan C, et al. FKBP8 inhibits virus-induced RLR-VISA signaling[J]. J Med Virol, 2019, 91(3): 482-92. doi:10.1002/jmv.25327 |
| [7] |
Tian T, Cao X, Kim S E, et al. FKBP8 variants are risk factors for spina bifida[J]. Hum Mol Genet, 2020, 29(18): 3132-44. doi:10.1093/hmg/ddaa211 |
| [8] |
Nie H, Rathbun G, Tucker H. Smyd1C mediates CD8 T cell death via regulation of Bcl2-Mediated restriction of outer mitochondrial membrane integrity[J]. J Cell Signal, 2017, 2(3): 163. |
| [9] |
Shirane-Kitsuji M, Nakayama K I. Mitochondria: FKBP38 and mitochondrial degradation[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2014, 51: 19-22. doi:10.1016/j.biocel.2014.03.007 |
| [10] |
Tian T, Cao X, Kim S E, et al. FKBP8 variants are risk factors for spina bifida[J]. Hum Mol Genet, 2020, 29(18): 3132-44. doi:10.1093/hmg/ddaa211 |
| [11] |
闫云静, 王帅, 穆云萍, 等. FKBP38蛋白对人源子宫内膜癌细胞增殖及侵袭的调控[J]. 中国药理学通报, 2020, 36(8): 1140-5. Yan Y J, Wang S, Mu Y P, et al. Regulation of FKBP38 protein on proliferation and invasion of human endometrial cancer cells[J]. Chin J Pharmacol Toxicol, 2020, 36(8): 1140-5. doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2020.08.020 |
| [12] |
Misaka T, Murakawa T, Nishida K, et al. FKBP8 protects the heart from hemodynamic stress by preventing the accumulation of misfolded proteins and endoplasmic reticulum-associated apoptosis in mice[J]. J Mol Cell Cardiol, 2018, 114: 93-104. doi:10.1016/j.yjmcc.2017.11.004 |
| [13] |
Hariharan M, Polat K, Sindhu R. A new hybrid intelligent system for accurate detection of Parkinson's disease[J]. Comput Methods and Programs Biomed, 2014, 113(3): 904-13. doi:10.1016/j.cmpb.2014.01.004 |
| [14] |
Shuang F, Yan H, Shan W, et al. Lactoferrin ameliorates dopaminergic neurodegeneration and motor deficits in MPTP-treated mice[J]. Redox Biol, 2019, 21: 101090. doi:10.1016/j.redox.2018.101090 |
| [15] |
Radad K, Moldzio R, AL-Shraim M, et al. Recent advances on the role of neurogenesis in the adultbrain: Therapeutic potential in parkinson's and Alzheimer's diseases[J]. CNS Neurol Disord Drug Targets, 2017, 16(7): 740-8. |
| [16] |
Spinazzi M., Casarin A., Pertegato V., et al. Assessment of mitochondrial respiratory chain enzymatic activities on tissues and cultured cells[J]. Nat Protoc, 2012, 7(6): 1235-46. doi:10.1038/nprot.2012.058 |
| [17] |
Maio R D, Barrett P J, Hoffman E K, et al. alpha-Synuclein binds to TOM20 and inhibits mitochondrial protein import in Parkinson′s disease[J]. Sci Transl, 2016, 8(342): 342r. |