2. 国家卫生健康委员会代谢性心血管疾病研究重点实验室，宁夏 银川 750004;
3. 宁夏血管损伤与修复研究重点实验室，宁夏 银川 750004
2. National Health Commission Key Laboratory of Metabolic Cardiovascular Diseases Research, Yinchuan 750004, China;
3. Ningxia Key Laboratory of Vascular Injury and Repair Research, Yinchuan 750004, China
急性肺损伤(acute lung injury, ALI)是呼吸系统一种严重的疾病，其死亡率高，发病率约为30%~40%[1]。越来越多的证据表明，过度炎症反应在ALI的发病中起关键作用[2-3]。作为革兰阴性细菌细胞壁主要成分的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)，体内外实验均表明，LPS诱导ALI是一种被广泛接受的细菌性脓毒症动物模型[4]。FoxO1作为Fox转录家族的主要成员之一，可以调节多种基因的表达，参与细胞分化、氧化应激、炎症反应、脂代谢等病理过程，并参与ALI疾病发生[5-6]。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases, MAPKs)信号通路是细胞内调控炎症产生的主要信号转导通路，与LPS诱发的ALI有密切关系[7]，p38 MAPK通过磷酸化被激活后，调控下游转录因子，促进IL-1、TNF-α等细胞因子的分泌，诱导一系列炎症反应[7]。因此，本研究通过LPS复制ALI体内外模型，探讨FoxO1 DNA甲基化及FoxO1/p38 MAPK信号通路在ALI中的作用及意义。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物20只SPF级CBS+/+ ♂小鼠饲养于宁夏医科大学实验动物中心标准屏障环境内，通风良好，期间自由活动和饮食，饲养8周后，体质量约25 g，实验动物合格证号：SCXK(京)2016-0006，根据实验安排和需要，对小鼠进行处理。
1.1.2 主要试剂LPS购自美国Sigma公司；小鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)ELISA检测试剂盒购自武汉江莱生物科技股份有限公司；RIPA裂解液检测试剂盒购自碧云天生物技术公司；苏木精-伊红(HE)染色液购自武汉塞维尔生物科技有限公司；蛋白提取试剂盒、蛋白定量试剂盒均为南京凯基，DNA、RNA提取试剂盒均为天根公司产品，逆转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒为北京TaKaRa公司；甲基化检测试剂盒为美国ZYMO RESEARCH公司；FoxO1单克隆抗体购自Abmart；DAB显色液、山羊抗兔IgG-HRP购自中杉金桥；引物由上海生工生物股份有限公司设计并合成。
1.1.3 仪器超净工作台(苏州，安泰)；CO2培养箱(德国，Heraeus)；5415D型微量台式离心机(德国，Eppendorf)；BS110S型精密天平(德国，Sartorius)；荧光定量PCR仪(美国，Bio-Rad)；垂直电泳仪、凝胶成像仪和Mod-el680全自动酶标仪(美国，Bio-Rad)，酶标仪(美国Bio-TEK)，普通PCR仪和qRT-PCR仪(德国，耶拿)。
1.2 方法 1.2.1 动物分组选取20只8周龄25 g左右的SPF级CBS+/+小鼠，随机分为LPS组和Control组，每组10只，饲喂普通饮食，参考文献说明[8]，术前将LPS溶解于无菌生理盐水中，小鼠禁食12 h后，LPS组根据5 mg·kg-1的剂量给予LPS腹腔注射，Control组给予等量的生理盐水腹腔注射。造模成功6 h后麻醉处理动物获取肺组织。本研究严格按照《实验动物管理条例》进行实验。
1.2.2 细胞培养PVEC使用含10%胎牛血清及1%的青链霉素的DMEM培养液，置于37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中常规培养，隔日换液，根据细胞生长状态，传至2~3代可用于后续实验。
1.2.3 细胞分组及转染实验组：PVEC转染si-FoxO1组；阴性对照组(negative control，si-NC)：转染对基因无影响的空载RNA；空白对照组(control)：加入等体积的完全培养基组。将处于指数生长期的细胞消化后细胞计数，等量接种于6孔板，待细胞生长到肉眼观60%~70%密度时进行转染。依据Lipofectamine2000 Reagent和si-FoxO1的说明书对各组细胞进行细胞转染实验，培养6 h后，换正常的培养基，48 h后进行后续实验。
1.2.4 HE染色处死小鼠后, 取左肺上叶组织置于4%的多聚甲醛固定24 h，进行常规脱水、石蜡包埋、切片，按标准操作进行HE染色，光学显微镜下观察肺组织的病理学变化。
1.2.5 免疫组化染色使用上述的方法制备的石蜡切片，经常规脱蜡水化，于0.01 mol·L-1柠檬酸盐溶液高温加热进行抗原修复2 min后，每张切片滴入0.3%过氧化氢以阻断内源性过氧化物酶的活性。经置室温冷却后，滴入10%山羊血清37 ℃封闭30 min，以减少非特异性染色。滴加抗FoxO1(1 ∶200)单克隆抗体在湿盒中4 ℃孵育过夜，次日滴加生物素标记的二抗，室温孵育1 h，加入DAB显色，再使用苏木精染色液对切片进行复染，常规脱水中性树脂封片，置于显微镜下观察并拍照。
1.2.6 肺组织炎症因子的检测各组小鼠处死后迅速取肺组织，称取约50 mg加入450 μL PBS，匀浆器充分研磨组织直至完全裂解，12 000×g离心10 min，取上清，按照ELISA说明书，检测肺组织中IL-6和TNF-α的含量。
1.2.7 Western blot检测FoxO1、DNA甲基转移酶和p38 MAPK的蛋白表达称取Control组及LPS组肺组织各0.6 g，用预冷的PBS冲洗组织2次，加入细胞裂解液，使用匀浆机将其破碎，在4 ℃摇床裂解组织2 h，离心机4 ℃，12 000×g离心5 min，提取上清液，即得总蛋白，采用BCA法测定各组蛋白含量，按每孔30 μg蛋白经煮沸8 min后，开始10% SDS-PAGE凝胶电泳，随后将蛋白质湿转到PVDF膜上。用5%脱脂奶粉室温封闭2 h。加入一抗(1 ∶1 000)孵育，4 ℃摇床过夜，次日PBST洗膜，10 min，洗3次，然后使用含HRP-二抗室温孵育2 h，PBST洗膜3次后将PVDF膜放入凝胶成像仪内，膜上滴ECL发光液，A液∶B液=1 ∶1，曝光，以β-actin为内参，Image Lab图像分析软件分析各组蛋白的相对表达。
1.2.8 qRT-PCR检测FoxO1和DNA甲基转移酶的mRNA水平称取各组组织约0.6 g，使用匀浆机将其破碎，加1 mL TRIzol RNA提取试剂，提取总RNA，测定样品纯度(A260/A280=1.80~2.0)与浓度后将mRNA逆转录为cDNA。将得到的cDNA按照Bestar SybrGreen qPCR Master Mix 10 μL、上游引物0.8 μL、下游引物0.8 μL、cDNA 2 μL、ROX 0.4 μL，灭菌蒸馏水6.0 μL，配成20 μL的PCR扩增体系。在NCBI查询各基因的CDS，用Premier 6.0软件设计引物。引物序列见Tab 1。扩增条件如下：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性10 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环，以GAPDH作为内参，目的基因的相对表达用2-ΔΔCT法分析。
| Gene | The primer sequence (5′-3′) | Prodsize(bp) |
| FoxO1 | F: GCCCCTGACACAATGGTCC | 107 |
| R: GTCTGGCCGGTGTACTCTG | ||
| DNMT1 | F: GGGTCTTTGTGGCTGGGTCAAG | 130 |
| R: AAGCAGCAGAGCAGAGCCTTTG | ||
| DNMT3A | F: GATGAGCCTGAGTATGAGGATGG | 101 |
| R: CAAGACACAATTCGGCCTGG | ||
| DNMT3B | F: CGTTAATGGGAACTTCAGTGACC | 169 |
| R: CTGCGTGTAATTCAGAAGGCT | ||
| GAPDH | F: AGGTCGGTGTGAACGGATTTG | 95 |
| R: GGGGTCGTTGATGGCAACA |
按DNA提取试剂盒说明书提取各组细胞全基因组DNA，亚硫酸盐修饰法对全基因组DNA进行甲基化修饰。nMS-PCR法检测FoxO1启动子区DNA甲基化程度的改变。针对FoxO1启动子区，在线(http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi)设计一对外引物及两对内引物(外引物：上游：5′-TTTGTAGGTGTGTATAGG TAGGGTG-3′，下游：5′-AATACTCCAAACAAAACCCAAAC-3′；甲基化内引物：上游：5′-TAGAAAAGCGGTTTTTATAGAAGAC-3′，下游：5′-TACCTATACACACCTACAAAACGAA-3′；非甲基化内引物：上游：5′-TGGTAGAAAAGTGGTTTTTATAGAAGAT-3′，下游：5′-CCCTACCTATACACACCTACAAAACA-3′)。反应体系：MIX 12.5 μL、H2O 7 μL、上下游引物各1 μL、已修饰的DNA模板3.5 μL，共25 μL。外引物扩增的反应条件为：95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，20个循环，每个循环降0.5 ℃至50 ℃，72 ℃ 2 min。以外引物的PCR产物为模板，进行内外引物的扩增，反应条件同外引物。随后，取10 μL PCR产物于2%的琼脂糖凝胶上电泳，用凝胶成像分析仪成像并分析甲基化条带及甲基化条带的光密度，按如下公式进行计算：甲基化/%=甲基化OD值/(甲基化OD值+非甲基化OD值)×100%。
1.3 统计学方法采用prime 6.0软件进行统计学分析整理，实验数据均为计量资料采用x±s表示，两样本均数间比较采用Student′s t检验，多样本均数间比较采用One-way ANOVA检验。
2 结果 2.1 肺组织的形态学变化正常肺脏组织壁薄，无结缔组织增生、增厚；各级支气管结构完整清晰，染色较为均匀，未见明显变性坏死(Fig 1A)；LPS组小鼠肺泡结构被破坏，肺泡壁溶解断裂，局部肺泡腔狭窄甚至消失，肺泡壁、肺泡腔或间质炎细胞大量浸润(Fig 1B)。
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| 图 1 Lung pathological changes of mice in each group (200×) A: HE staining of lung tissue sections; B: LPS (5 mg·L-1) |
与Control相比，LPS组小鼠肺组织IL-6和TNF-α浓度及mRNA水平均明显升高，其中ELISA结果显示，IL-6和TNF-α浓度分别升高了38.9%和52.5%(Fig 2A，P < 0.05)，qRT-PCR结果显示，IL-6和TNF-α的mRNA水平分别升高了144.5%和246.9%(Fig 2B，P < 0.01)，且差异有统计学意义。
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| Fig 2 Expression of inflammatory cytokines IL-6 and TNF-α (x±s, n=6) A: IL-6 and TNF-α concentrations were detected by ELISA. B: The mRNA levels of IL-6 and TNF-α were detected by qRT-PCR. *P < 0.05, **P < 0.01 vs Control group. |
肺组织免疫组化分析显示：与Control组比较，LPS组FoxO1的表达高于正常肺组织的表达(Fig 3A)；qRT-PCR和Western blot分别检测肺组织中FoxO1 mRNA及蛋白的表达水平，结果显示：与Control组比较，LPS组FoxO1的mRNA和蛋白表达分别增加了134.9%和61.8%(Fig 3B和C)，且差异有统计学意义(P < 0.01)。
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| Fig 3 Expression of FoxO1 in lung tissues of mice(x±s, n=6) A: The expression of FoxO1 in lung tissues was detected by immunohistochemistry (400×, bar=50 μm; brown is FoxO1 expression); B, C: The expression level of FoxO1 mRNA and protein were detected by qRT-PCR and Western blot. **P < 0.01 vs Control group. |
利用生物信息学软件分析预测FoxO1启动子区结构，在启动子上游-1226~-1352和-1414~-1796 bp的位置存在两个CpG岛(Fig 4A)。利用nMSP检测FoxO1启动子区的改变，结果显示，与对照组相比，LPS组FoxO1启动子区甲基化水平降低了17.2%(Fig 4B，P < 0.05)。
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| Fig 4 Expression of DNA methyltransferase in lung tissues (x±s, n=6) A: CpG islands in FoxO1 promoter region were predicted for bioinformatics analysis; B: The methylation level of FoxO1 gene was detected by agarose gel electrophoresis.(M is methylation; U is non-methylation).C, D: The mRNA and protein expressions of DNMT1, DNMT3A and DNMT3B were detected by qRT-PCR and Western blot. *P < .05, **P < 0.01 vs Control group. |
DNA甲基转移酶是维持DNA甲基化修饰的酶，主要包括DNMT1、DNMT3A和DNMT3B，qRT-PCR及Western blot分别检测了DNMT1、DNMT3A、DNMT3B的表达，结果显示，LPS组小鼠肺组织DNMT3A和DNMT1的mRNA水平分别降低了149.1%和59.8%(P < 0.05, P < 0.01)，DNMT3B变化差异无统计学意义(P>0.05, Fig 4C)；DNMT3A和DNMT3B的蛋白水平分别降低了142.1%和37.7%(P < 0.05, P < 0.01)，DNMT1的变化无统计学意义(P>0.05, Fig 4D)，综合以上数据，说明FoxO1启动子区发生甲基化主要受到DNMT3A的调控，从而参与LPS导致的肺损伤过程。
2.5 FoxO1甲基化水平与炎症的相关性分析Pearson相关性分析结果显示，FoxO1甲基化水平与小鼠肺组织IL-6及TNF-α浓度呈负相关(r2=-0.521 8，r2=-0.788 2)(Fig 5A，B，P < 0.05，P < 0.01)，该相关性分析表明，小鼠肺组织炎症因子的产生与FoxO1启动子区DNA甲基化水平相关。
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| Fig 5 Analysis of correlation between FoxO1 methylation level and inflammation A: Correlation analysis between IL-6 in lung tissues and FoxO1 methylation level; B: Correlation analysis between TNF-α in lung tissues and FoxO1 methylation level. |
与Control对照比较，LPS组肺组织p38 MAPK蛋白表达无差异(P>0.05)，而p38 MAPK磷酸化水平明显增加，升高了134.1%(P < 0.01)，见Fig 6。
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| Fig 6 The phosphorylation level of p38 MAPK(x±s, n=6) The phosphorylation level of p38 MAPK in lung tissues was detected by Western blot.**P < 0.01 vs Control group. |
为了进一步探讨FoxO1在肺损伤中的机制，构建FoxO1干扰片段并转染至PVEC 48 h，qRT-PCR结果显示，在引起FoxO1表达下调的3个干扰片段中，FoxO1-siRNA-1803(si-FoxO1)敲低效果最佳，可用于后续试验(Fig 7A)。Western blot验证其干扰效率，结果显示，FoxO1干扰片段筛选成功(Fig 7B)；为证明FoxO1在LPS诱导的肺损伤中调控作用，在LPS干预PVEC情况下转染si-FoxO1，Western blot检测p38 MAPK的磷酸化变化。结果显示，与LPS+si-NC组相比，LPS+si-FoxO1组p38 MAPK蛋白磷酸化水平明显降低(Fig 7C)，以上结果说明，FoxO1可以调控p38 MAPK的磷酸化水平。
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| Fig 7 Changes of p38 phosphorylation level after interference with FoxO1(x±s, n=6) A: PVECs were transfected with FoxO1 siRNA, and the best interference fragment was screened by qRT-PCR; B: Western blot verified the silencing efficiency of interference fragments; C: On the basis of FoxO1 interference, the change of phosphorylation level of P38 was detected Western blot. 1:Control; 2:si-NC; 3:FoxO1-1362;4:FoxO1-1532;5:FoxO1-1803;6:si-NC; 7:si-FoxO1;8:LPS; 9:LPS+si-NC; 10:LPS+si-FoxO1. *P < 0.05, **P < 0.01 vs si-NC; ##P < 0.01 vs LPS+si-NC. |
脂多糖是革兰阴性菌细胞壁的主要活性成分，可诱导炎症反应的过度激活，现已被广泛应用于诱导ALI模型[9-10]。我们的实验给予小鼠腹腔注射LPS诱导构建了急性肺损伤小鼠模型，肺损伤小鼠模型中病理学表现为肺泡结构损伤，肺间质充血水肿、大量炎性细胞浸润，肺组织匀浆液TNF-α和IL-6含量也明显高于对照组，说明我们成功构建了急性肺损伤小鼠模型。
FoxO1作为人体最重要的转录因子之一，在多种细胞类型中广泛表达，可通过转录和翻译，调节细胞氧化应激反应、炎症及增殖等多种病理生理过程[11]。FoxO1自身的转录后修饰调节FoxO1的功能奠定了它在代谢、免疫等方面研究中的重要地位[12]。Artham等[13]发现，Akt1/FoxO1/stromelysin1通路参与了LPS诱导的ALI的发病机制中，而抑制FoxO1的表达后，可逆转脂多糖诱导的急性肺损伤。本研究结果显示：在LPS诱导的肺损伤模型中，FoxO1表达明显增加，表明FoxO1参与了肺损伤的过程，但其具体机制有待进一步研究。
DNA甲基化作为真核生物最常见的表观遗传修饰方式之一，目前，FoxO1DNA甲基化作为一种调控机制日益成为人们研究的热点，课题组前期发现，FoxO1启动子区的低甲基化造成FoxO1的表达增加，在Hcy诱导的肝细胞内质网应激未折叠蛋白反应中发挥重要作用[14]，但是，关于FoxO1基因DNA异常甲基化与肺损伤的相关性研究尚属于全新的领域，其具体作用尚不明确。我们通过生物信息学分析发现，FoxO1启动子区存在两个CpG岛，提示FoxO1的表达可能受甲基化调控。进一步用MSP检测FoxO1启动子区甲基化，结果显示，LPS组肺组织FoxO1启动子区甲基化水平明显降低，与其表达水平相反。由于DNA甲基化受甲基转移酶调控，进一步检测甲基转移酶的表达，发现LPS组DNMT3A表达明显降低，而DNMT1和DNMT3B无明显变化，提示DNMT3A表达降低使FoxO1启动子区发生低甲基化，进而调控FoxO1的表达。
p38MAPK作为MAPKs家族重要信号转导通路之一，在机体内被促炎细胞因子、内毒素等因素诱发后，介导机体的炎症、应激和损伤等信号传递过程，并且活化p38 MAPK信号通路，以磷酸化形式为主要特征[15]。Viji等[16]报道，高同型半胱氨酸血症通过扰乱FoxO1和MAPK信号级联反应来改变成骨细胞中的氧化还原调节机制。此外，亦有研究发现[17]，在肝细胞中，FoxO1通过增加p38活性，进而激活PKB和MAPK通路。提示FoxO1/p38 MAPK信号通路在多种生理和病理过程中起重要作用。本研究也发现，模型组肺组织p38 MAPK全蛋白无明显变化，但其磷酸化水平明显增加，为了进一步明确FoxO1 DNA甲基化水平与p38 MAPK磷酸化之间的关系，我们继续体外培养小鼠肺血管内皮细胞，并转染si-FoxO1干扰片段检测p38 MAPK的磷酸化水平，发现其磷酸化水平明显降低，提示脂多糖促使p38 MAPK信号通路活化，并参与调控小鼠肺损伤。
综上所述，LPS可诱导小鼠肺组织发生炎症反应，并通过激活相关的信号通路导致肺损伤，其作用机制可能与FoxO1启动子区DNA甲基化水平降低，进而上调FoxO1的表达并激活p38 MAPK信号通路有关。
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