2. 广东药科大学中药学院, 广东 广州 510006
2. School of Traditional Chinese Medicine, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China
药物经皮吸收进入血液循环是一种给药途径，但是皮肤屏障在保护机体免受外界损伤的同时，也限制了药物经皮吸收的速率，应用皮肤吸收促进剂(PE)是增加药物经皮吸收的一种常用方法[1]。薄荷醇是一种单萜类物质，作为PE已得到广泛应用。目前针对薄荷醇促透机制的研究尚存在争议，如Yang等[2]研究认为，薄荷醇在低浓度下破坏角质层有序的脂质结构，高浓度改善药物在角质层中的分配发挥促透作用；Huang等[3]研究发现，薄荷醇可直接改变脂质的厚度和流动性，促进槲皮素的跨膜转运；Chen等[4]研究认为，薄荷醇发挥促透作用主要从两个方面，一是竞争脂质-脂质氢键位点，从而降低脂质稳定性，二是薄荷醇具有很强的胆固醇亲和力，可增加类脂膜的流动性。在本课题组的前期研究中通过光镜、扫描电镜、透射电镜观察发现，应用薄荷醇后可导致皮肤角质层细胞间隙增大和细胞排列发生改变[5-6]，但是，薄荷醇如何引起上述变化而发挥促透作用的分子机制尚不清楚。因此，本研究在体外建立角质形成细胞单层模型，考察薄荷醇的体外促透作用的可能机制。
1 材料与方法 1.1 试剂和抗体FITC-BSA购自于北京索莱宝科技有限公司(货号：SF063)；Keratinocyte-SFM培养基购自于美国Gibco公司(货号：1134210)；U73122购自于美国Sigma公司(批号：U6756)；硝苯地平购自于美国Sigma公司(批号：040M19120)；白屈菜红碱购自于上海晶纯试剂有限公司(批号：C107686)；薄荷醇购自于上海晶纯试剂有限公司(批号：110716)；考马斯亮蓝(R250)购自于北京鼎国生物技术有限责任公司(批号：69P10150)；ATP含量检测盒购自于南京建成生物工程所(批号：20120321)；超微量Ca2+-ATP酶试剂盒购自于南京建成生物工程所(批号：20121009)；Fluo-3/AM荧光探针购自于碧云天生物技术研究所(批号：S1056)；PLC ELISA试剂盒购自于上海百沃科贸有限公司(批号：BV-E121022)；PKC ELISA试剂盒购自于上海百沃科贸有限公司(批号：BV-E110905)。
1.2 KC的原代培养包皮组织移入0.25% DispaseⅡ分离表皮和真皮，表皮剪成碎片，37 ℃下使用胰蛋白酶水解消化5~7 min，离心5 min收集细胞。使用KC-SFM培养基，在5% CO2、37 ℃、90%湿度条件继续培养至融合度达到80%~90%，0.25%胰酶消化传代。
1.3 薄荷醇对KC单层细胞模型连接紧密性的影响胰蛋白酶消化重悬细胞，调整细胞数量为1×104/孔, 接种至12孔Transwell(孔径0.4 μm)小室内，培养至细胞完全融合。用含有不同药液的培养基培养细胞2 h后，检测细胞电阻抗(TEER)，每组设3个复孔。1×104 KC细胞接种至Transwell小室内至融合后，内室换为含0.05 g·L-1 FITC-BSA的培养基，外室中加入含有不同药液的培养基培养细胞6 h后，收集内室液体。激发波长520 nm，发射波长492 nm，荧光分光光度计测定内室液体吸光度值[7]。
1.4 薄荷醇对KC细胞内Ca2+浓度的影响KC细胞分为不同组别，添加不同组别的培养基继续培养5 min，离心沉淀细胞，吸去培养基。将细胞重悬于终浓度为2 μmol·L-1 Fluo-3/AM溶液，37 ℃避光孵育30 min。激发波长488 nm，发射波长525 nm，流式细胞仪测量细胞的荧光强度。
1.5 薄荷醇对KC细胞内Ca2+-ATP酶活性、PLC活性、PKC活性和ATP含量的影响将KC根据实验分组，加入相应的培养基后培养4 h。细胞消化，离心，收集细胞，匀浆器破碎细胞制备细胞悬液，采用试剂盒检测Ca2+-ATP酶活性、PLC活性、PKC活性。同法细胞培养4 h后，收集细胞，90 ℃~100 ℃水浴匀浆破碎，沸水浴中加热10 min，采用试剂盒检测ATP含量。
1.6 薄荷醇对KC微丝骨架结构的影响接种KC于预置玻片的6孔板中，细胞贴壁后48 h，加入相应的培养基后培养细胞4 h。参考文献方法[8]，对培养的细胞依次进行2.5%戊二醛固定、考马斯亮蓝染色，玻片置于甲醇冰醋酸溶液中脱色。倒置显微镜下观察、拍照。
1.7 统计学分析所有数据均以x±s表示，使用SPSS 19.0进行统计学处理，组间比较采用t检验和单因素方差分析。
2 结果 2.1 薄荷醇对KC单层细胞模型连接紧密性的影响分别采用0、50、100和200 μmol·L-1薄荷醇处理KC单层细胞模型，测定TEER和FITC-BSA渗透量。结果显示，薄荷醇能剂量依赖性降低TEER和增加FITC-BSA渗透量(P＜0.05)，表明薄荷醇能降低KC细胞间的连接紧密性。相对于200 μmol·L-1薄荷醇组，10 μmol·L-1 U73122+200 μmol·L-1薄荷醇组和100 μmol·L-1硝苯地平+200 μmol·L-1薄荷醇组TEER明显升高(P＜0.05)，FITC-BSA渗透量明显降低(P＜0.05)，表明PLC抑制剂U73122和钙通道阻滞剂硝苯地平可以逆转薄荷醇引起的KC连接紧密度下降，见Fig 1。
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| Fig 1 Effect of menthol on junction tightness of KC monolayer cell model (x±s, n=6) Left figure: The effect of menthol on Teer between KCs; Right figure: The effect of menthol on FITC-BSA penetrating KC monolayer. A: Control, B: 50 μmol·L-1 menthol, C: 100 μmol·L-1 menthol, D: 200 μmol·L-1 menthol, E: 200 μmol·L-1 menthol+100 μmol·L-1 nifedipine, F: 100 μmol·L-1 nifedipine, G: 10 μmol·L-1 U73122+200 μmol·L-1 menthol, H: 10 μmol·L-1 U73122. *P < 0.05, **P < 0.01 vs Control group; ##P < 0.01 vs 200 μmol·L-1 Menthol group. |
流式细胞仪结果显示，薄荷醇能剂量依赖性增加KC细胞内Ca2+浓度(P＜0.05)。10 μmol·L-1 U73122+200 μmol·L-1薄荷醇组和100 μmol·L-1硝苯地平+200 μmol·L-1薄荷醇组胞内Ca2+浓度明显低于200 μmol·L-1薄荷醇组(P＜0.05)，表明PLC抑制剂U73122和钙通道阻滞剂硝苯地平可以降低薄荷醇引起的KC细胞内Ca2+浓度升高，见Fig 2。
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| Fig 2 Effect of menthol on intracellular Ca2+ concentration of KC (x±s, n=6) A: Control, B: 50 μmol·L-1 menthol, C: 100 μmol·L-1 menthol, D: 200 μmol·L-1 menthol, E: 10 μmol·L-1 U73122+200 μmol·L-1 menthol, F: 10 μmol·L-1 U73122, G: 200 μmol·L-1 menthol+100 μmol·L-1 nifedipine, H: 100 μmol·L-1 nifedipine. *P < 0.05, **P < 0.05 vs Control group; ##P < 0.01 vs 200 μmol·L-1 Menthol group. |
薄荷醇能剂量依赖性降低KC细胞内Ca2+-ATP酶活性和ATP含量(P＜0.05)。10 μmol·L-1 U73122+200 μmol·L-1薄荷醇组胞内Ca2+-ATP酶活性和ATP含量高于200 μmol·L-1薄荷醇组(P＜0.05)，表明PLC抑制剂U73122可以降低薄荷醇引起的KC细胞内Ca2+浓度升高，见Fig 3。
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| Fig 3 Effects of menthol on Ca2+- ATPase and ATP in KC (x±s, n=6) A: Control, B: 50 μmol·L-1 menthol, C: 100 μmol·L-1 menthol, D: 200 μmol·L-1 menthol, E: 10 μmol·L-1 U73122+200 μmol·L-1 menthol, F: 10 μmol·L-1 U73122. **P < 0.05 vs Control group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs 200 μmol·L-1 Menthol group. |
薄荷醇能剂量依赖性增加KC细胞内PLC活性(P＜0.05)。10 μmol·L-1 U73122+200 μmol·L-1薄荷醇组胞内PLC活性低于200 μmol·L-1薄荷醇组(P＜0.05)，表明PLC抑制剂U73122可以降低薄荷醇引起的PLC活性升高，见Fig 4。
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| Fig 4 Effects of menthol on PLC in KC (x±s, n=6) A: Control, B: 50 μmol·L-1 menthol, C: 100 μmol·L-1 menthol, D: 200 μmol·L-1 menthol, E: 10 μmol·L-1 U73122+200 μmol·L-1 menthol, F: 10 μmol·L-1 U73122. **P < 0.05 vs Control group; ##P < 0.01 vs 200 μmol·L-1 Menthol group. |
薄荷醇能剂量依赖性增加KC细胞内PKC活性(P＜0.05)。10 μmol·L-1 U73122+200 μmol·L-1薄荷醇组和5 μmol·L-1白屈菜红碱+200 μmol·L-1薄荷醇PKC活性低于200 μmol·L-1薄荷醇组(P＜0.05)，表明PLC抑制剂U73122和PKC抑制剂白屈菜红碱可以降低薄荷醇引起的PLC、PKC活性升高，见Fig 5。
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| Fig 5 Effects of menthol on PKC in KC (x±s, n=6) A: Control, B: 50 μmol·L-1 menthol, C: 100 μmol·L-1 menthol, D: 200 μmol·L-1 menthol, E: 10 μmol·L-1 U73122+200 μmol·L-1 menthol, F: 10 μmol·L-1 U73122, G: 200 μmol·L-1 menthol+5 μmol·L-1 chelerythrine, H: 5 μmol·L-1 chelerythrine. *P < 0.05, **P < 0.05 vs Control group; ##P < 0.01 vs 200 μmol·L-1 Menthol group. |
考马斯亮蓝染色结果显示，角质形成细胞呈不规则鹅卵石形状，细胞间连接紧密(Fig 6A)。薄荷醇处理以后，角质形成细胞显著收缩，细胞间可见明显的间隙(Fig 6B)。不同浓度白屈菜红碱处理后，可明显逆转薄荷醇引起的角质形成细胞间隙增大(Fig 6C和Fig 6D)。
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| Fig 6 Effects of menthol on microfilament skeleton structure in KC (1000×) A: Control, B: 200 μmol·L-1 menthol, C: 200 μmol·L-1 menthol+5 μmol·L-1 chelerythrine, D: 5 μmol·L-1 chelerythrine. |
既往的对PE促透机制研究多集中于促透剂对角质层中生化成分的结构、状态及构象的影响，如改变角质层脂质排列的有序性和相变温度[9]、加快角蛋白碳的运动、增加角质层的无序性而促进药物的吸收等[10]，而忽略了PE对细胞与细胞之间连接的影响。表皮分为基底层、棘层、颗粒层、透明层和角质层。角质层主要由KC细胞组成，相互连接的KC细胞构成了表皮的主要屏障。KC间连接的紧密程度直接影响表皮的渗透性及其功能[11]，而药物经皮吸收的一个重要途径就是细胞间隙扩散，细胞之间连接的紧密程度直接影响了药物的经皮吸收量。因此本文以人原代角质形成细胞为研究对象建立了KC单层模型，考察薄荷醇对KC细胞模型的连接紧密性的影响。研究结果显示，薄荷醇可明显的降低细胞间的连接紧密程度，降低细胞间TEER，增加FITC-BSA的跨膜渗透量。
在正常的表皮中，由内到外从基底层到角质层Ca2+浓度逐渐升高。Ca2+浓度对于维持KC细胞的正常功能具有重要作用，如促进KC细胞的增殖、分化和皮肤修复等[12]。有研究报道，KC细胞内外的Ca2+浓度发生变化，可导致KC细胞间的间隙增大，从而增大皮肤对药物的渗透性[13]。我们通过流式细胞术显示，薄荷醇可以增加细胞内的Ca2+浓度。因此，我们推测薄荷醇的促透作用可能与薄荷醇增加细胞内的Ca2+浓度有关。
那薄荷醇是如何影响KC细胞内Ca2+浓度的呢？细胞内的Ca2+主要来源于两个方面，一是由细胞膜上钙离子通道从胞外直接流入胞内，二是通过内源性钙池释放[14]。内源性钙池由PLC调控，细胞膜上的PLC被激活后可促进4, 5-二磷酸磷脂酰胺肌醇(4, 5-phosphate-dylinositidediphosphate, PIP2)水解形成三磷酸肌醇(inositol-1, 4, 5-tripho- sphate，IP3)和甘油二酯(duacykycerol，DAG)，IP3增加后可促进钙池释放Ca2+，从而使胞内Ca2+浓度升高[15]。PIP2水平下降可降低胞内Ca2+-ATP酶活性。DAG可促进ATP外流，降低胞内ATP浓度，ATP的减少同样可降低Ca2+-ATP酶活性[16]。Ca2+-ATP酶(即Ca2+泵)使胞内Ca2+不能泵出到胞外，进一步间接增加胞内的Ca2+浓度[17]。我们对KC单层模型分别使用钙离子通道阻滞剂硝苯地平和PLC阻滞剂U73122后，均可使胞内Ca2+浓度显著下降，薄荷醇引起的细胞间的连接紧密程度下降也被逆转。因此，薄荷醇可能通过增强PLC活性释放胞内钙池Ca2+，促进外源性Ca2+内流，共同增加胞内Ca2+浓度。
PKC是G蛋白偶联受体系统中的效应物，其激活既依赖膜脂甘油二酯的出现，又依赖细胞质中Ca2+浓度的升高[18]。PKC激活后，可参与多种生化反应和基因表达的调控。在表皮PKC激活后可使细胞某些蛋白磷酸化，而影响细胞的骨架结构和细胞膜稳定性，从而使屏障作用减弱。本实验证实薄荷醇可使KC细胞间的间隙增加，且该作用与PKC的活性有关。因此，我们推断薄荷醇通过增加KC胞内Ca2+浓度，上调PKC活性，从而降低细胞间的连接紧密性发挥促透作用。
综上，薄荷醇通过增加KC胞内Ca2+浓度发挥促透作用，其增加胞内Ca2+浓度作用与增强PLC活性，促进外源性Ca2+内流有关。
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