2. 南京中医药大学第一附属医院，江苏 南京 210029
2. Dept of Traditional Chinese Medicine Pediatrics, the first Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210029, China
小儿哮喘是一种慢性气道炎症，反复发作，缠绵难愈，受遗传、环境等多种因素的影响[1]，近年来，儿童哮喘的患病率仍呈上升趋势。西医主要通过扩张支气管等达到止咳平喘的作用，但是难以达到有效且持久的效果。中医认为，小儿先天禀赋不足，哮喘多以肺脾气虚患儿为主[2]，中医治疗小儿哮喘贯穿“治病求本”理念，通过增强患儿体质，“扶正以祛邪”。近年来中医药治疗哮喘的效果较佳，但相关作用机制并不明确。固本防哮饮具有补肺固表、健脾化痰的功效。前期临床研究表明，固本防哮饮联合穴位敷贴治疗小儿哮喘的有效率明显优于西药，且复发率普遍降低[3]。网络药理学是基因组学、蛋白质组学、代谢组学等学科的集合与发展，为新药研发提供了重要思路[4]。因此，本研究拟通过网络药理学和分子对接术探讨固本防哮饮治疗小儿哮喘的作用机制，以有效指导临床通过中医药对小儿哮喘的辩证施治。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 动物15只健康SPF级雄性SD大鼠，7~8周龄，体质量(280~320) g，购于南京市江宁区青龙山动物繁殖场，许可证号: 202005A041，饲养于南京中医药大学动物管理中心。将大鼠随机分为3组: 空白血清组4只，固本防哮饮血清组6只、孟鲁司特钠血清组5只。本实验已通过南京中医药大学动物伦理委员会批准，伦理号为202005A041。
1.1.2 细胞人支气管上皮细胞(BEAS-2B)、人喉癌上皮细胞(Hep-2)由南京中医药大学儿科研究所药学组馈赠，培养地点为南京中医药大学儿科研究所细胞培养房。将冻存BEAS-2B细胞复苏后，培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育，采用传第2~3代的对数分裂期细胞。Hep-2细胞培养方法同上。
1.1.3 RSV病毒呼吸道合胞病毒A亚型(Long株)，由南京中医药大学儿科研究所馈赠，保存于南京中医药大学儿科研究所。根据前期课题组研究[5]用Hep-2细胞复苏扩增RSV，扩增效果最佳。因此，本实验用Hep-2细胞扩增RSV后收集病毒，用于后续病毒毒力的测定及细胞的感染。
1.1.4 药物孟鲁司特钠片：10 mg/片，杭州默沙东制药有限公司，产品批号：R033495。固本防哮饮每剂由以下药物组成：炙黄芪、党参、炒白术、茯苓、煅牡蛎、蝉蜕、陈皮、防风、辛夷、五味子、生甘草，按5 ∶ 3.33 ∶ 3.33 ∶ 3.33 ∶ 5 ∶ 2 ∶ 2 ∶ 1 ∶ 2 ∶ 2 ∶ 1的比例配制。实验用固本防哮饮药物配制：第1煎先加8倍量凉水浸泡30 min，煎煮30 min后滤过; 第2煎加6倍量水煎煮30 min, 将2次煎液过滤、蒸馏、浓缩至相当于生药2 kg·L-1的浓缩液，密封保存于无菌50 mL离心管，-20 ℃储存备用。
1.1.5 试剂人IL-4，IL-13, 鼠抗SRC单克隆抗体(南京柏赛生物，批号：MFP06004-05、SRP3274、ET1609-65)，兔抗TP53多克隆抗体(深圳市文乐生物科技有限公司，批号：D220082-0100)，羊抗兔多克隆IgG-H&L二抗(美国Proteintech公司，批号：K1225)，人Tublin内参引物(批号：232212)，细胞核蛋白质提取试剂盒(批号：C500009-0050)，RIPA(批号：RIPA-BL504A)，PMSF[生工生物工程(上海)股份有限公司，批号：PMSF-BL507A]，特级胎牛血清(深圳百泰克科技有限公司，批号：10099-141)，赛默飞RPMI 1640培养基(广州市鲁诚生物科技有限公司，批号：C11875)，CCK-8细胞增殖计数试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司，批号：A311-01)，Human IL-6 ELISA试剂盒(广州泰勒生物科技有限公司，批号：PI330)，糖原PAS染色液-细胞专用(北京索莱宝科技有限公司，批号：G1360)等。
1.1.6 仪器AF103型制冰机(美国Scotsman公司); 5810R型高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司); Power Pac Basic型垂直电泳仪，Trans-Blot Turbo全能型蛋白转印系统，Chemi-Doc型化学发光成像仪(美国Bio-Rad公司); TCSSP5型倒置显微镜(德国Leica公司)。
1.2 方法 1.2.1 网络药理学和分子对接 1.2.1.1 固本防哮饮有效成分的筛选通过TCMSP 2.3数据库(http://tcmspw.com/tcmsp.php)及文献检索，整合固本防哮饮各个药物有效活性成分。将类药性(drug likeness，DL)≥0.18，口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%作为数据库ADME的筛选条件。
1.2.1.2 有效成分相关靶点的收集在TCMSP 2.3数据库筛选药物活性成分的相关靶点信息，并通过UniProt数据库(http://www.uniprot.org)进行靶点蛋白与基因名称的统一匹配。
1.2.1.3 疾病相关靶点的筛选以“children asthma”为关键词，在GeneCard数据库(https://www.genecards.org)、OMIM数据库(http://www.omim.org)、Drugbank数据库(https://www.drugbank.ca)进行检索，收集相关靶点。筛选GeneCard数据库中位数值，删去重复值得到哮喘的潜在靶点信息。
1.2.1.4 固本防哮饮“活性成分-靶点”网络构建采用Cytoscape 3.7.2软件构建“中药-成分-共同靶点”、“共同靶点互相作用”网络图，运用NetworkAnalyzer工具进行网络参数分析。其中Degree为重要参数，数值越大代表该节点越重要。
1.2.1.5 蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络构建利用Venney 2.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)在线平台对药物与疾病靶点绘制韦恩图，并提取交集基因。将交集基因上传String 11.0数据库，得到PPI网络TSV文件，借助Cytoscape软件进行节点网络分析，得到蛋白质相互作用网络图。结合内置插件“cytoHubba”分析，筛选出关键靶点。
1.2.1.6 基因本体(gene ontology，GO)功能及京都基因与基因组百科全书(kyotoen cyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析将固本防哮饮治疗哮喘的潜在作用靶点导入输入DAVID 6.8数据库(https://david.ncifcrf.gov/)，设置标识符为“OFFICIALGENESYMBOL”、物种选择为“homo sapiens”，其余默认选择，进行GO功能和KEGG通路富集分析。
1.2.1.7 分子对接通过TCMSP数据库及PubChem数据库得到小分子mol2格式文件，通过String数据平台(https://cn.string-db.org/)，PDB数据库(https://www.rcsb.org/)下载大分子靶蛋白的pdb格式文件。使用AutodockTool 4.0软件分别对小分子和大分子进行加氢、去水，借助PyMOL 2.5软件进行分子活性位点对接。
1.2.2 实验方法 1.2.2.1 含药血清的制备参照实验动物和人体临床用药剂量换算公式：dB=dA×RB+RA×
将对数生长期的培养液调细胞数至1×108·L-1，加至96孔细胞培养板，每孔100 μL，BEAS-2B细胞置于37 ℃，5% CO2培养箱培养24~48 h，细胞长成单层后，吸弃各孔培养液，将固本防哮饮含药血清按10倍梯度稀释8个浓度(10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%), 分别接种于96孔板，每个浓度设6个复孔，24 h后加入100 μL CCK-8溶液，同时设置空白组和对照组，避光孵育2 h，上机检测每孔的吸光度并进行记录, 通过计算每个稀释梯度的细胞存活率，存活率大于90%的稀释浓度代表药物最大无毒浓度。
RSV扩增 将Hep-2用如上方法接种于10 mL大皿中，将倍数生长期的细胞在10 mL无菌培养瓶中进行传代，待细胞贴壁60%时，分别加入20%、50%、80%稀释倍数的RSV病毒液，每天观察合胞生长情况，合胞脱落后，用细胞刮将细胞从壁上刮落，连同培养液一起转移至50 mL离心管，4 ℃，2 000 r·min-1离心10 min，将上清液进行分装，-80 ℃进行保存备用。
1.2.2.3 固本防哮饮对哮喘模型细胞的影响以杯状细胞作为模型细胞观察哮喘炎症指标。参考文献中白介素使用剂量，本实验用IL-4、IL-13各取50 mg·L-1，加/不加RSV[6]病毒液4 μL进行造模。以下药物组均为RSV+IL-4+IL-13造模。将细胞分为空白对照组(15%空白血清)、固本防哮饮组(10%，15%，20%固本防哮饮含药血清)、孟鲁司特钠组(15%孟鲁司特钠含药血清)，按照上述细胞培养方法，当细胞生长到60%~70%时，分别换成含药血清，继续培养24 h后，各组细胞弃去培养基，PBS清洗3遍后，参照PAS染色试剂盒说明书进行染色后，置于倒置显微镜下观察各组细胞形态变化。
1.2.2.4 ABC-ELISA法测IL-6表达水平ABC-ELISA称为桥联亲和素-生物素法，是基于传统ELISA法的升级。如上培养分组、造模、给药的BEAS-2B(除去固本防哮饮高剂量组, 只保留固本防哮饮低、中剂量组)，4 ℃、13 000 r·min-1离心30 min后取上清液，不加细胞裂解液，BCA法测定浓度并定量为等浓度。严格按ELISA试剂盒说明书进行操作。
1.2.2.5 Western blot法测SRC、TP53的表达水平参照上述细胞分组培养方法，细胞裂解后提取的蛋白均置于4 ℃，14 000 r·min-1，离心15 min，BCA法测定蛋白浓度进行定量。变性后取10 μL的蛋白在8%的预制胶进行恒压垂直电泳，用湿转法将胶上的蛋白转移到PVDF膜上，加1×Tris-HCl缓冲盐溶液(1×TBST)在摇床上清洗3次，每次10 min，用5%脱脂奶粉在摇床上封闭2 h，1×TBST再次清洗3遍后，4 ℃孵育SRC、TP53一抗过夜。TBST清洗后在摇床上室温孵育二抗(1 ∶ 5 000) 1 h，孵育结束后再次TBST清洗3次，加ECL发光液于曝光机上扫描胶片，进行显影、定影，采用Image Lab软件进行结果分析。
1.2.2.6 统计学方法采用SPSS 22.0统计软件进行统计学处理，计量资料服从正态分布用x±s表示，组间比较用单因素方差分析(One-way ANOVA)，两两比较采用LSD-t检验。
2 结果 2.1 网络药理分析及分子对接结果 2.1.1 固本防哮饮有效成分及靶点筛选结果经过TCMSP数据库、UniProt、化源网、SwissTargetPrediction及文献检索，收集整合，数据整理(排除检索有效成分靶点信息无果的成分)，共得到231个成分，其中五味子8个、黄芪21个、党参21个、白术7个、茯苓13个、煅牡蛎16个、蝉蜕15个、陈皮5个、防风18个、辛夷15、生甘草92个，1个成分为陈皮、防风、甘草共有，1个成分为陈皮、甘草共有，1个成分为党参、甘草共有，1个成分为党参、防风共有，1个成分为白术、黄芪共有，1个成分为茯苓、甘草共有，7个成分为黄芪、甘草共有。对筛选出的活性成分进行手动检索相关靶点信息，剔除未查询到相关靶点的成分，最终获得23个活性成分。在UniProt数据库、SwissTargetPrediction对以上活性成分进行检索或预测，删除无效值与重复值，共得到692个靶基因。
2.1.2 小儿哮喘疾病靶点预测结果将“children asthma”作为关键词在多个疾病数据库进行检索，GeneCard数据库获得3 868个基因，根据经验设定Relevancescore大于中位数的靶点为潜在作用靶点，Drugbank数据库113个、OMIM数据库38个靶基因，将以上靶基因进行整合、去重后，最终获得1 052个有效靶基因。
2.1.3 固本防哮饮“中药-活性成分-靶点”网络构建将固本防哮饮的成分、作用靶点导入Cytoscape 3.7.2软件，进行“中药-活性成分-靶点”关系图构建，见Fig 1。网络中共912个节点，3 881条边。
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| Fig 1 Gubenfangxiaoyin- pediatric asthma target Wayne diagram |
将整理得到的疾病和药物独立靶点导入微生信作图平台，得到242个交集靶点，绘制韦恩图，见Fig 1，将所得交集基因导入String数据库进行PPI分析，通过调试，最终将互动分数设置为高可信度，结果输出为TSV文件通过Cytoscape 3.7.2软件进行可视化处理，得到PPI网络图。共得到231个节点, 1 948条关系路线，平均节点度值为16.866，平均局部聚类系数为0.422，节点图形大小及颜色随着Degree值增大而变大、加深，连接线段也相应增粗。通过cytohubba插件，使用MCC算法筛选出排名前10的关键基因，见Fig 2，颜色越深代表基因的重要性越高。
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| Fig 2 Key nodes of PPI network |
运用Metascape数据平台对242个共有靶点进行富集分析，以P值作为筛选条件，GO富集分析分别选取分子功能(molecular function，MF)、生物过程(biological process，BP)、细胞组分(cell composition，CC)的前10条通路进行展示，见Fig 3。根据富集分析结果，共有靶点GO的MF包括：G蛋白偶联胺受体活性(G protein couple damine receptor activity)、蛋白激酶活性(protein kinase activity)、细胞因子受体结合(cytokine receptor binding)等功能。GO-BP包括：细胞对有机氮化合物的反应(cellular response to organ onitrogen compound)、MAPK级联调节(regulation of MAPK cascade)、对激素的反应(response to hormone)、炎症反应(inflammatory response)等生物过程。GO-CC包括：膜筏(membraneraft)、膜侧(side of membrane)、受体复合物(receptor complex)、囊泡腔(vesicle lumen)、突触后(post synapse)等组分。
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| Fig 3 GO analysis |
以P值作为筛选条件，KEGG通路分析展示前20条通路，纵坐标代表富集通路名称，横坐标代表每条通路上的基因数占共有基因数的比例。由Fig 4可知，242个哮喘与固本防哮饮共有靶点主要富集在钙信号通路(calcium signaling pathway)、cAMP信号通路(cAMP signaling pathway)、AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、5-羟色胺能(serotonergic synapse)等多种通路上。
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| Fig 4 KEGG enrichment analysis |
通过分子对接术对筛选出的度值较高的成分及靶点进行活性成分对接，根据网络药理学分析结果，筛选出5′-hydroxyiso-muronulatol-2′、5′-di-O-glucoside、槲皮素、异鼠李素、山奈酚、木犀草素等小分子配体，STAT3、SRC、AKT1、TP53、TNF、MAPK3、IL-6等大分子受体，进行分子对接，其结合能见Fig 5。取结合能力最高的对接结果进行可视化处理，选取结合能分数最低的HQ19(5′-hydroxyiso-muronulatol-2′, 5′-di-O-glucoside)与SRC、TP53作图分析，结合模式如Fig 6、7。
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| Fig 5 Analysis of docking-binding energy |
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| Fig 6 Figure between SRC and HQ19 |
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| Fig 7 TP53 and HQ19 |
见Fig 8，与正常组相比，IL-4+IL-13组，RSV+IL4+IL-13组杯状细胞数量增多，并且RSV+IL4+IL-13组杯状细胞数量比IL-4+IL-13组杯状细胞数量稍多。与RSV+IL4+IL-13组相比，固本防哮饮中、高剂量组、孟鲁司特钠组杯状细胞数量减少，并且固本防哮饮中剂量组杯状细胞数量最少，固本防哮饮高剂量组与孟鲁司特钠组杯状细胞数量相比差别不明显。证明固本防哮饮可以降低炎症反应。
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| Fig 8 PAS staining of goblet cells (x±s, n=3) |
细胞培养上清IL-6的表达水平结果见Tab 1，与正常组相比，IL-4+IL-13组、RSV+IL-4+IL-13组IL-6的表达水平升高(P < 0.05)。与RSV+IL-4+IL-13组相比，固本防哮饮组、孟鲁司特钠组IL-6的表达降低(P < 0.05)。
| Group | IL-6(ng·L-1) |
| Blank | 10.85±0.47 |
| IL-4+IL-13 | 14.13±0.28* |
| RSV+IL-4+IL-13 | 15.98±0.53* |
| Gubenfangxiaoyin | 10.45±0.33 |
| Montelustride sodium | 12.16±0.39△ |
| *P < 0.05 vs blank; △P < 0.05 vs RSV+IL-4+IL-13 | |
结果见Fig 9。与空白组相比，IL-4+IL-13组、RSV+IL4+IL-13组SRC表达水平明显升高(P < 0.05);与RSV+IL4+IL-13组相比，固本防哮饮组、孟鲁司特钠组SRC的表达均降低(P < 0.05)。与空白组相比，IL-4+IL-13组、RSV+IL4+IL-13组TP53的表达均明显升高(P < 0.05)，与RSV+IL4+IL-13组相比，固本防哮饮组、孟鲁司特钠组、TP53的表达均降低(P < 0.05)。
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| Fig 9 SRC, TP53 protein expression levels in Beas-2b (x±s, n=3) A: Representative band of protein; B-C : Analysis of protein expression level. 1: Blank group; 2: IL-4 + IL-13 group; 3: RSV+IL-4+IL-13 group; 4: Gubenfangxiaoyin group; 5: Montelukast sodium group. *P < 0.05 vs the blank group, △P < 0.05 vs the RSV+IL-4+IL-13 group |
小儿哮喘属于中医“哮病”范畴，哮喘论述首见于《黄帝内经》，散见于《玉机真藏论》、《藏气法时论》、《咳论》等，奠定了后世防治哮喘的理论基础。哮病常反复发作，责之于宿根不除，反复受外邪引触之故。小儿哮喘以肺脾气虚、痰浊内阻为主，因此补肺健脾、祛浊化痰为治疗小儿哮喘的重要方法[7]。固本防哮饮是江苏省中医院经典方，具有补肺固表、健脾化痰的功效，对治疗哮喘缓解期患儿有独特功效。
根据网络药理学研究结果显示，固本防哮饮防治小儿哮喘的主要成分可能是槲皮素、异鼠李素、山奈酚等。槲皮素能够通过调节谷胱甘肽活性、清除活性氧，具有抗氧化、抗病毒、抗菌、抗炎和抗肿瘤等多种药理作用[8]。异鼠李素可抑制支气管上皮细胞炎症模型释放的大量促炎性因子、趋化因子，具有强抗氧化性，可抗炎、抗病毒、抗氧化和抗过敏，还可以调节免疫功能[9]。山奈酚具有抗炎、抗氧化以及抗癌活性，发挥抗氧化应激作用[10]。
本研究通过网络拓扑分析中的Degree值以及MCC算法，筛选出较为重要的靶点，包括STAT3、SRC、AKT1、TP53、IL-6等。SRC在促进气道平滑肌细胞生长和促进气道重塑中的迁移方面发挥重要作用，可以介导表皮生长因子受体(EGFR)反式激活[11]，有研究表明，通过SRC(SU6656)或EGFR(AG1478)抑制剂减少EGFR磷酸化和下游信号传导，从而抑制OVA诱导的支气管肺泡灌洗液中炎症细胞的募集，降低血管、支气管周围炎症、纤维化、杯状细胞化生和气道高反应性[12]。且患儿外周血中TNF、IL-6的分泌增加[13]，降低其分泌水平可能会减轻哮喘症状。
GO富集、KEGG通路分析及分析对接结果显示，STAT3、SRC、AKT1、TP53、TNF、IL-6等靶点，可能是固本防哮饮干预小儿哮喘的关键靶点，它们参与调控了钙信号通道、cAMP信号通路，AGE-RAGE信号通路、cGMP-PKG信号通路等多种通路。目前已被证实钙通道、cAMP通路信号传导失调与哮喘的发生密切相关。钙库控制的钙内流是介导细胞钙信号的重要途径之一，内质网上钙缺乏时，内质网膜上的基质相互作用分子1蛋白传递钙缺乏信号，激活细胞膜上的钙通道，介导钙离子进入胞质，参与气管收缩、气道炎症等许多生物反应[14]。cAMP是参与细胞内信号转导的第二信使，参与调控人类多种病理生理过程, 如炎症、细胞生长与分化、凋亡及代谢等。通过实验对分子对接结合能力最强的蛋白进行验证，发现RSV感染支气管上皮细胞哮喘模型，SRC、TP53、IL-6的分泌水平均增高，且RSV感染后，杯状细胞数目显著增加，提示固本防哮饮可能通过以上信号通路来调节炎症反应等病理反应，发挥防治哮喘作用，但是具体治疗哮喘的机制，尚需更多深入研究。
综上所述，本文借助网络药理学和分子对接初步分析发现，固本防哮饮可能通过槲皮素、异鼠李素、山奈酚等活性成分，作用于STAT3、SRC、AKT1、TP53、TNF、MAPK3、IL-6、JUN等靶点，调节钙、cAMP、cGMP-PKG等信号通路，发挥降低炎症反应，改善肺功能及微循环等作用，从而达到防治小儿哮喘的目的。本研究存在局限性，不论是中药有效成分，还是疾病靶点信息，在不同数据库之间存在差异，最终获取的信息可能会导致结果出现差异性。但本文在一定程度上验证了固本防哮饮作为临床治疗小儿哮喘常用药的可用性，也为今后相关实验研究、药物开发提供了理论依据。
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