单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)感染是影响全球人类健康的重要问题。HSV属于疱疹病毒科α疱疹病毒亚科，是一种线性双链DNA包膜病毒，根据包膜蛋白抗原性的差别可分为HSV-1及HSV-2两种类型[1]。免疫系统正常时，HSV主要造成口腔、生殖器及眼睛等部位的感染，而免疫受损的人群还会表现出脑炎症状[2]。HSV一旦感染，就会在宿主周围神经元中建立终生可逆的潜伏期[3-4]。HSV-1会导致口腔疱疹和角膜炎爆发，同时潜伏在三叉神经节内；而HSV-2通常侵入骶神经节，引发生殖器疱疹[5]。有报告称，生殖器疱疹会使艾滋病病毒感染的危险度增加3倍左右[6-7]。目前市面上用于治疗HSV感染的药物主要是阿昔洛韦(acyclovir，ACV)及其相关的核苷类似物，但是长期使用可能会产生不良反应和病毒耐药株[3]，并且目前尚无能够预防HSV的有效疫苗[6]。因此，寻找低耐药性的新型抗HSV药物尤为重要。
马兜铃酸(aristolochic acids，AAs)属于硝基菲类羧酸类化合物家族，是马兜铃、木通、细辛、广防己等植物的主要成分[8-9]。AAs具有多种药理活性，主要包括：抗病毒、抗炎、抗肿瘤等[8]。长期以来，含有AAs类化合物的中药制剂被广泛用于治疗各种疾病。但是，已有报道证明，AAs具有肾毒性，可导致马兜铃酸肾病(aristolochic acids nephropathy，AAN)。马兜铃酸I是AAs中含量最高、毒性最强的成分，小鼠以20 mg·kg-1剂量给药5 d即出现明显肾损伤现象[9]。综上，AAs用于临床时应严格把控剂量，合理使用。
目前为止，鲜有对AAs抗疱疹病毒活性的报道，本研究对AAs的体内外抗HSV作用及其作用机制进行了初步探究。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 药物AAs(313-67-7)购于陶素化工有限公司(中国上海)。ACV购于湖北午时药业股份有限公司。
1.1.2 细胞和病毒非洲绿猴肾细胞(Vero)培养于MEM培养基，添加10%胎牛血清(ExCell Bio，中国)，青霉素(100 kU·L-1)，链霉素(100 mg·L-1)，培养于37 ℃ 5% CO2的培养箱中。HSV-1 F株购于ATCC(美国)。HSV-2 333株来源于中国科学院武汉病毒研究所。
1.1.3 试剂4%多聚甲醛(上海源叶生物科技有限公司)；5%结晶紫染色液、5×蛋白上样缓冲液、PMSF、RIPA裂解液、碱性磷酸酶检测试剂盒、苏木素-伊红染色试剂盒购于碧云天生物技术有限公司，胎牛血清从ExCell Bio公司购买，琼脂粉、MEM干粉购于Gibco公司，0.25% 胰酶、双抗购于新赛美生物科技有限公司，β-actin抗体从Cell Signalling Technology公司购买，HSV gD、gB、ICP27抗体购于Abcam公司，RNA提取试剂盒购于Aid lab公司，One Step TB Green® Prime ScriptTM RT-PCR Kit Ⅱ试剂盒购于TaKaRa公司。
1.1.4 仪器Ⅱ级B2型生物安全柜购于新加坡Esco公司；CO2培养箱及台式离心机购于美国Thermo公司，酶标仪购于美国伯腾仪器有限公司；蛋白电泳和转膜设备从美国Bio-Rad公司购买；倒置相差显微镜购于日本Olympus公司；ABI 7500型定量PCR仪购于美国应用生物系统公司。
1.2 方法 1.2.1 细胞毒性实验接种Vero细胞于96孔板中，至其长满单层，吸弃原培养液，将梯度稀释的AAs(终浓度200、180、160、140、120、100、50、25 μmol·L-1)加入96孔板，每个浓度3个复孔，同时设有空白对照组。37 ℃ 5% CO2培养24 h后，吸弃药物，加入4%多聚甲醛室温固定15 min，吸弃，加入5%结晶紫室温染色15 min，清洗晾干后用酶标仪测定A540nm值。
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将AAs梯度稀释(终浓度50、25、12.5、6.25 μmol·L-1)，对HSV-1/HSV-2感染的细胞进行全过程给药(预处理细胞、预处理病毒、吸附时、吸附后)。预处理细胞(Pre+Cell)：AAs于37 ℃作用细胞1 h，吸弃，37 ℃吸附HSV(MOI=0.1)1 h，换成维持液；预处理病毒(Pre+Virus)：AAs与HSV于37 ℃混合孵育1 h后，加入吸弃原培养基的96孔板中，37 ℃作用1 h，换成维持液；吸附时(adsorption)给药：AAs与HSV(MOI=0.1)混合后加入96孔板中，于37 ℃作用1 h，换成维持液；吸附后(post-adsorption)给药：HSV于37 ℃吸附细胞1 h，换成含有AAs的维持液。每个浓度设有3个复孔，同时设有病毒对照组和空白对照组。30 h后按“1.2.1”方法检测A540nm，计算CPE抑制率。CPE抑制率/%＝(实验组A540nm-病毒对照组A540nm)/(空白对照组A540nm-病毒对照组A540nm)×100%。
1.2.3 空斑实验接种Vero细胞于12孔板中，至其长满单层。按照“1.2.2”中4种不同方式分别加入AAs(终浓度20 μmol·L-1)；或者先用HSV-1(MOI=0.1)于37 ℃吸附细胞1 h，吸弃，然后加入不同浓度的AAs(终浓度40、20、10、5 μmol·L-1)处理细胞；此外，先用HSV-1(MOI=0.1)于37 ℃吸附细胞1 h，之后于吸附后不同时间段(0~2、2~4、4~6、6~8、8~10、10~12、0~6、0~12 h)加入AAs(终浓度20 μmol·L-1)。24 h后收取上清，同时设病毒对照组。收取的上清稀释10~1 000倍，于37 ℃吸附细胞1 h，吸弃，加入配制好的覆盖培养基，待其冷却凝固后，倒置于37 ℃培养箱中。至其出斑后，固定染色，进行空斑计数。
1.2.4 间接免疫荧光实验接种Vero细胞于3.5 cm玻底皿，待细胞长至密度30%~40%时，用AAs(终浓度20 μmol·L-1)按照1.2.2中4种不同作用方式处理HSV-1(MOI=1.0)，置于37 ℃培养箱中培养8 h。然后用PBS清洗细胞，4%多聚甲醛室温固定15 min，PBS清洗2 min，0.25% Triton X-100通透10 min，PBS清洗2 min，2% BSA于37 ℃封闭1 h，PBS清洗3次，加入ICP5的抗体(1 ∶100稀释)于4 ℃孵育16 h，清洗后加入DyLight 649®偶联二抗于4 ℃孵育4 h，清洗3次，DAPI处理10 min，清洗后进行共聚焦成像，并使用ImageJ(NIH)(美国)进行分析。
1.2.5 膜融合抑制实验接种Vero细胞于12孔板中，待细胞长满单层，用HSV-1/HSV-2(MOI=0.1)于37 ℃感染细胞1 h，然后将含有不同浓度AAs(终浓度20、10、5、2.5 μmol·L-1)的维持液加入相应孔中，同时设有病毒对照组和空白对照组。12 h后进行苏木精-伊红染色(HE染色)，显微镜下拍照后用ImageJ处理图像。
1.2.6 Western blot实验接种Vero细胞于6孔板中，待细胞长满单层，用HSV-1/2(MOI=0.1)于37 ℃感染细胞1 h，然后将含有不同浓度AAs(终浓度20、10、5、2.5 μmol·L-1)的维持液加入相应孔中，同时设有病毒对照组和空白对照组，16 h后收样；Vero细胞接种于12孔板中，HSV-1(MOI=0.1)于37 ℃吸附细胞1 h，于吸附后不同时间段(0~2、2~4、4~6、6~8、8~10、10~12、0~6、0~12 h)加入AAs(终浓度20 μmol·L-1)，16 h后收样；接种Vero细胞于6孔板中，待细胞长满单层，用HSV-1(MOI=0.1)于37 ℃感染细胞1 h，然后将含有不同浓度AAs(终浓度80、40、10、5 μmol·L-1)的维持液加入相应孔中，同时设有病毒对照组和空白对照组，24 h后收样。每孔加入100 μL细胞裂解液(800 μL RIPA，200 μL 5×蛋白上样缓冲液，10 μL PMSF)，冰上裂解17 min，将裂解液刮下后转移到EP管中，100 ℃煮样20 min，放在-20 ℃冰箱备用。用BCA试剂盒测定提取的蛋白浓度后进行SDS-PAGE电泳，将电泳胶通过半干法转移到NC膜上，将NC膜用5%的奶粉于4 ℃封闭过夜，1×TBST洗涤3次，用HSV-1/HSV-2 ICP27和gB蛋白抗体、抗磷酸化p38 MAPK和NF-κB的抗体稀释液(1 ∶1 000稀释)于37 ℃孵育2 h，继续洗涤3次，然后用二抗稀释液(1 ∶5 000稀释)于37 ℃孵育2 h。用碱性磷酸酶检测试剂盒显色，拍照后用ImageJ处理图像。
1.2.7 实时荧光定量PCR接种Vero细胞于6孔板中，待细胞长满单层，用HSV-1/2(MOI=0.1)于37 ℃感染细胞1 h，然后将含有不同浓度AAs(终浓度20、10、5、2.5 μmol·L-1)的维持液加入相应孔中，同时设有病毒对照组和空白对照组。16 h后用RNA提取试剂盒提取总RNA。对提取的RNA进行浓度检测后，利用Applied Biosystems 7500 Fast Real Time PCR System，按照One Step TB Green® Prime ScriptTM RT-PCR Kit Ⅱ试剂盒的说明书进行操作。引物序列：HSV-1(gD) mRNA Forward primer：5′-AGCAGGGGTTAGGGAGTTG-3′; HSV-1(gD) mRNA Reverse primer：5′-CCATCTTGAGAGAGGCATC-3′; HSV-2(gD) mRNA Forward primer：5′-AGCATCCCGATCACTGTGTACTA-3′; HSV-2(gD) mRNA Reverse primer：5′-GCGATGGTCAGGTTGTACGT-3′; Actin mRNA Forward primer：5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′; Actin mRNA Reverse primer：5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′。
1.2.8 无病毒膜融合实验分别接种Vero细胞与BSRT7/5细胞于6孔板中，待细胞长至50%~70%，转染质粒。Vero细胞共转染pcDNA3.1(+) HSV-2-gB、pcDNA3.1(+) HSV-1-gD、pcDNA3.1(+) HSV-1-gH、pcDNA3.1(+) HSV-1-gL、pCAGGS-T7 luc质粒(以下简称gB、gD、gH、gL、T7 luc)，转染比例为1 ∶1 ∶2 ∶2 ∶4，BSRT7/5细胞共转染gB、gD、gH、gL质粒，转染比例为1 ∶1 ∶2 ∶2。转染后24 h，将两种细胞分别消化，1 ∶1混合接种于新的孔板中，同时给药组加入不同浓度的药物(杨梅素终浓度10、5 μmol·L-1，AAs终浓度20、10、5 μmol·L-1)，于37 ℃培养42 h后利用荧光素酶检测试剂盒进行检测。
1.2.9 动物实验使用3~4周龄的BALB/c雌鼠，体质量(14~15) g，动物许可证号SCXK(鲁)20190003。随机分为5组，每组12只：空白对照组，病毒对照组，阳性药ACV(10 mg·kg-1·d-1)组，AAs高剂量(10 mg·kg-1·d-1)组及AAs低剂量(5 mg·kg-1·d-1)组。采用滴鼻方式接毒[13]，接毒后4 h给药，连续给药5 d。接毒后72 h解剖，取小鼠的肺及脊髓，通过空斑实验及实时荧光定量PCR验证药物在体内抗HSV-1的作用效果。以接毒日为起始日，连续14 d观察小鼠临床症状，每天记录小鼠体质量变化及生存情况。
1.2.10 统计学分析数据分析及绘制统计图表均采用GraphPad Prism 8.0统计软件。各组数据先进行正态性和方差齐性检验，采用单因素方差分析和t检验比较组间的差异。
2 结果 2.1 AAs的细胞毒性实验将AAs稀释为终浓度25、50、100、120、140、160、180、200 μmol·L-1，分别处理细胞24 h，结果如Fig 1所示，AAs在25 μmol·L-1时，细胞存活率接近80%；随着浓度逐渐增大，细胞存活率逐渐下降，当浓度达到180 μmol·L-1时细胞存活率下降至50%左右。经计算，AAs对Vero细胞的半数细胞毒性浓度CC50值为193.1 μmol·L-1。
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| Fig 1 Cytotoxicity of aristolochic acids on Vero cells(x±s, n=3) |
我们进一步利用CPE抑制实验评价了AAs全过程给药对于HSV-1和HSV-2的抑制作用。结果如Fig 2所示，AAs在6.25~50 μmol·L-1的浓度范围内对HSV-1及HSV-2感染均有明显抑制作用。其中，AAs对HSV-1感染的抑制效果略优于HSV-2，其IC50值约为11.12±3.06 μmol·L-1，治疗指数为17.37(Tab 1)。同时设置ACV作为阳性对照组，结果显示AAs抑制HSV-1感染的IC50值略低于ACV，但抑制HSV-2感染的IC50值略高于ACV，说明AAs对HSV-1的抑制作用略优于ACV。根据CC50和IC50值计算治疗指数(SI)，结果表明ACV的SI值分别是AAs的7倍和10倍，说明AAs的药物安全性相对较差，其药物毒性问题仍需进一步解决。本研究中体外实验的AAs使用剂量以终浓度40 μmol·L-1为例，在Vero细胞上给药100 μL时AAs含量约为0.014 mg，相当于体内实验中一只15 g的小鼠以肾毒性剂量(20 mg·kg-1)给药时AAs含量(0.3 mg)的1/20。
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| Fig 2 Inhibition of HSV-1/HSV-2 infection by aristolochic acids on Vero cells(x±s, n=3) |
| CC50/μmol·L-1 | HSV-1 IC50/μmol·L-1 | SI(CC50/IC50) | HSV-2 IC50/μmol·L-1 | SI(CC50/IC50) | |
| Aristolochic acids | 193.1±36.6 | 11.12±3.06 | 17.37 | 25.42±4.36 | 7.60 |
| Acyclovir | 1387±278 | 11.36±1.98 | 122.10 | 17.6±2.88 | 78.80 |
AAs以4种作用方式作用于HSV感染的Vero细胞后，24 h收取上清液。用收取的上清液进行空斑实验，检测病毒滴度，进一步评价AAs对病毒增殖的抑制作用。结果如Fig 3所示，预处理细胞组、预处理病毒组、吸附时给药组对病毒滴度降低的作用不大，但是吸附后给药组明显降低病毒滴度，在20 μmol·L-1的浓度下几乎完全抑制了HSV的增殖。这说明AAs主要作用于病毒吸附后的感染阶段。
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| Fig 3 Results of plaque assay of aristolochic acids in different treatment conditions on HSV infection(x±s, n=3) A and B: Plaque assay of HSV-1 titers in aristolochic acids treated Vero cells under different treatment conditions; C and D: Plaque assay of HSV-2 titers in aristolochic acids treated Vero cells under different treatment conditions. *P < 0.05, **P < 0.01 vs virus control. |
我们进一步利用间接免疫荧光实验评价AAs在不同作用方式下对HSV-1病毒蛋白gD表达的抑制作用。AAs按照上述4种不同作用方式处理细胞或病毒，8 h后利用免疫荧光检测病毒gD蛋白的表达情况。结果如Fig 4A所示，无药物处理的病毒组可以检测到大量gD蛋白的红色荧光，预处理细胞、预处理病毒及吸附时给药组的红色荧光相对于病毒组大幅减少，而吸附后给药组的红色荧光最弱。因此，AAs在吸附后给药对于HSV蛋白表达抑制作用最强。
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| Fig 4 Inhibition of aristolochic acids on viral titer in HSV infected Vero cells(x±s, n=3) A: Immunofluorescence assay of HSV-1 gD protein in aristolochic acids treated Vero cells under different treatment conditions; B: Plaque assay of HSV-1 titers in aristolochic acids or acyclovir treated Vero cells.*P < 0.05, **P < 0.01 vs virus control. |
此外，我们还评价了不同浓度的AAs以吸附后给药的方式作用于Vero细胞对于HSV增殖的抑制作用，设置ACV作为阳性对照组。即在HSV感染24 h后收取上清液，用收取的上清稀释液进行空斑实验，检测病毒滴度。结果如Fig 4B所示，AAs在2.5~40 μmol·L-1的浓度范围内能明显抑制HSV在Vero细胞中的增殖，且呈现明显的剂量依赖性。同时，与ACV组进行对比，在药物浓度为10 μmol·L-1时，AAs处理可使病毒滴度下降约2.7个Lg(PFU·mL-1)，而ACV处理使病毒滴度下降约2.2个Lg(PFU·mL-1)，可见AAs抑制HSV-1增殖效果略优于ACV，这进一步说明AAs主要通过影响病毒吸附后的感染事件来抑制HSV的增殖。
2.5 AAs对HSV诱导的膜融合的抑制作用HSV进入Vero细胞，需要病毒-细胞膜融合，这种融合需要HSV包膜糖蛋白gB、gD、gH/L异源二聚体的参与[10-11]。Vero细胞感染HSV-1或HSV-2后，用不同浓度的AAs(5、10、20 μmol·L-1)处理，30 h后对细胞进行HE染色，结果如Fig 5A-D所示，无药物处理的病毒对照组出现明显的膜融合现象(红色箭头指示合胞体形成)，而不同浓度AAs处理后，膜融合现象受到明显抑制。其中20 μmol·L-1时抑制现象最明显，这种抑制作用同样具有剂量依赖性(Fig 5B和5D)。
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| Fig 5 Inhibition of aristolochic acids on membrane fusion induced by HSV(x±s, n=3) A and B: Aristolochic acid inhibits syncytium formation mediated by HSV-1; C and D: Aristolochic acid inhibits syncytium formation mediated by HSV-2; E and F: Virus-free fusion inhibition assay of myricetin (E) or aristolochic acids (F) treated HSV infected Vero cells.*P < 0.05, **P < 0.01 vs virus control. |
HSV的gB、gD、gH、gL蛋白对于膜融合现象的产生起着关键作用，于是我们进一步利用无病毒细胞-细胞膜融合实验(分子膜融合实验)检测AAs是否与gB、gD、gH、gL 4种蛋白直接作用而抑制膜融合现象。由于4种HSV包膜蛋白(gB、gD、gH/L异源二聚体)对于细胞-细胞融合现象的产生必要且充分[11]。于是，我们将Vero细胞共转染pcDNA3.1(+)-gB、pcDNA3.1(+)-gD、pcDNA3.1(+)-gH、pcDNA3.1(+)-gL及pCAGGS-T7 luc这5种质粒，BSRT7/5细胞共转染pcDNA3.1(+)-gB、pcDNA3.1(+)-gD、pcDNA3.1(+)-gH、pcDNA3.1(+)-gL 4种质粒后24 h，将两种转染细胞混合，同时加入不同浓度的药物，培养42 h后利用荧光素酶检测试剂盒进行定量检测。前期的研究中我们发现，杨梅素可与病毒gD蛋白质直接作用从而对膜融合现象产生抑制[12]。因此，本研究中以杨梅素作为膜融合抑制的阳性对照药。结果如Fig 5E和5F所示，杨梅素浓度为5 μmol·L-1时即可减少约70%由gB、gD、gH/L引起的膜融合现象，当其10 μmol·L-1时几乎可以完全抑制膜融合，与之前的报道是一致的。但是，用不同浓度AAs处理后，膜融合现象并未被抑制。因此，AAs并非通过与gB、gD、gH/L 4种蛋白直接相互作用对膜融合现象产生抑制，而是通过抑制HSV的其它吸附后的感染事件来间接抑制HSV诱导的膜融合。
2.6 AAs在吸附后不同作用时间段对HSV的抑制作用通过上述实验可以看出，AAs主要在吸附后阶段对HSV感染产生抑制作用，于是，我们进一步利用Western blot及空斑实验对AAs在HSV感染后不同时间阶段给药的抑制活性进行了评价。如Fig 6所示，Western blot及空斑实验结果基本一致，AAs在吸附后2~4 h及4~6 h给药可明显降低病毒滴度，在6~8、8~10、10~12 h几乎没有抑制作用。另外，在0~6 h或0~12 h用AAs处理对病毒增殖的抑制作用更为明显。因此，AAs在HSV感染后的早期阶段即2~6 h作用效果较好。
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| Fig 6 Inhibition of aristolochic acids on HSV in different time periods after adsorption(x±s, n=3) A and B: Western blot analysis of HSV-1 ICP27 expression after treated with aristolochic acids at different time intervals. Quantification of immunoblot for the ratio of ICP27 to β-actin was also shown (B); C: Plaque assay of HSV-1 titers in Vero cells treated with aristolochic acids at different time intervals.*P < 0.05, **P < 0.01 vs virus control. |
既然AAs主要作用于病毒吸附后的2~6 h的感染阶段，我们进一步利用Western blot和RT-PCR评价了AAs对病毒蛋白表达和mRNA表达的抑制作用。首先，在Vero细胞感染HSV-1或HSV-2后，按照吸附后给药的方式，用AAs(2.5、5、10、20 μmol·L-1)处理细胞，16 h后收取蛋白样品并进行SDS-PAGE电泳。我们选择HSV-1蛋白ICP27及HSV-2蛋白gB进行检测。结果如Fig 7A-D所示，AAs在2.5~20 μmol·L-1的浓度范围内对HSV-1的ICP27蛋白和HSV-2的gB蛋白的表达都具有明显的抑制作用。总之，AAs对HSV感染后蛋白的表达具有明显抑制作用，且具有剂量依赖性。
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| Fig 7 Inhibition of aristolochic acids on HSV protein and mRNA expression(x±s, n=3) A and B: Western blot analysis of HSV-1 ICP27 expression after treated with aristolochic acids; C and D: Western blot analysis of HSV-2 gB expression after treated with aristolochic acids; E and F: Influence of aristolochic acids on mRNA expression of HSV-1 (E) or HSV-2 (F) gD protein, respectively. *P < 0.05, **P < 0.01 vs virus control. |
此外，我们还利用实时荧光定量PCR法评价了AAs对病毒gD蛋白mRNA的表达的影响。结果如Fig 7E和7F所示，在AAs浓度为5 μmol·L-1以上时，对HSV-1和HSV-2的gD蛋白的mRNA表达具有明显的抑制作用，与Western blot实验结果基本一致，这说明AAs可以在病毒吸附后的复制过程中产生抑制作用，且这种抑制作用具有明显的剂量依赖性。
2.8 AAs对p38 MAPK/NF-κB信号通路蛋白表达的影响前期实验发现，AAs可以抑制HSV吸附后的某些步骤，降低HSV的mRNA和蛋白表达，因此我们进一步探讨AAs是否可以影响HSV感染细胞的相关信号通路。
丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是丝氨酸-苏氨酸激酶，介导与一系列细胞活动相关的细胞内信号，包括细胞增殖、分化、存活、死亡等[13]。p38 MAPK与细胞炎症、凋亡、生长有关，据报道，HSV-1感染细胞p38 MAPK的激活可促进病毒的复制[14]。NF-κB可以调控炎性细胞因子和趋化因子的表达，在抑制细胞凋亡，以及免疫和炎症反应的调节中发挥重要作用[15-16]。据报道，HSV感染可以激活NF-κB，从而提高病毒复制的效率[16]。在此基础上，我们检测了在HSV-1感染后，AAs对细胞p38 MAPK及NF-κB信号蛋白的影响。
如Fig 8A、B所示，在细胞感染HSV-1 24 h后，病毒组中的p38 MAPK蛋白磷酸化水平约为正常对照组2.1倍。然而，AAs(20、40、80 μmol·L-1)处理后，p-p38 MAPK水平从正常对照组的2.1倍明显下降到1.2、0.8和0.7倍，证明AAs能够明显降低由HSV感染导致的p38 MAPK的活化。
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| Fig 8 Effect of aristolochic acids on p38 MAPK and NF- κB activation after HSV infection(x±s, n=3) A~C: Western blot analysis of the effects of aristolochic acids on p38 MAPK/NF-κB activation in HSV-1 infected Vero cells. Quantification of immunoblot for the ratio of p-p38 MAPK (B) or p-NF-κB (C) to β-actin was also shown.*P < 0.05, **P < 0.01 vs virus control; ##P < 0.01 vs mock. |
NF-κB是p38 MAPK通路的下游信号之一。如Fig 8A、8C所示，在细胞感染HSV-1 24 h后，病毒组中的NF-κB蛋白磷酸化水平约为正常对照组1.5倍。然而，AAs(40、80 μmol·L-1)处理后，NF-κB水平从正常对照组的1.5倍明显下降到1和0.7倍，证明AAs能够明显降低由HSV感染导致的NF-κB的活化，抑制HSV的复制。因此，细胞p38 MAPK/NF-κB信号通路可能参与AAs体外抗HSV作用。
2.9 AAs的体内抗HSV作用我们进一步利用HSV-1感染BALB/c小鼠建立HSV感染的小鼠肺炎和脑炎模型评价AAs的体内抗HSV作用，并与阳性药ACV进行对比分析。据报道，感染HSV的小鼠以ACV(10 mg·kg-1)处理7 d即可明显降低死亡率[17]，本研究设置阳性药ACV组剂量为10 mg·kg-1。基于AAs肾毒性剂量约为20 mg·kg-1，同时为了控制实验变量，在相同剂量下比较受试药物AAs的疗效，选择1/4和1/2肾毒性剂量(5、10 mg·kg-1)的AAs进行体内研究。结果如Fig 9A所示，与空白组相比，病毒组小鼠体质量在接毒后持续下降，并始终轻于原始体质量。阳性药ACV组(10 mg·kg-1)体质量前3 d缓慢下降，d 3后开始持续回升；AAs高剂量组(10 mg·kg-1)前9 d体质量一直缓慢下降，d 9后开始缓慢回升，但仍低于空白组；AAs低剂量组(5 mg·kg-1)前7 d体质量一直缓慢下降，d 7后开始缓慢回升，但仍低于空白组。
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| Fig 9 Inhibition effect of aristolochic acids on HSV infection in vivo A: The body weights of mice were monitored daily for 14 days and are expressed as a percentage of the initial value(x±s, n=12); B: The survival rates of mice are expressed as percentage of survival, evaluated daily for 14 days(x±s, n=12). **P < 0.01 vs virus control group (placebo); The viral titres in lungs (C) or spinal cords (D) were evaluated by plaque assay and quantitative RT-PCR assay on day 3 p.i., respectively(x±s, n=3)*P < 0.05, **P < 0.01 vs virus control. |
而Fig 9B的小鼠生存率结果表明，病毒组小鼠在接毒后d 2开始出现死亡，并且在d 6时生存率降至30%；而阳性对照药ACV组(10 mg·kg-1)在接毒后d 1开始出现死亡，d 9时生存率降至70%；AAs高剂量组(10 mg·kg-1)在接毒后未出现死亡现象；AAs低剂量组(5 mg·kg-1)在接毒后d 5开始出现死亡现象，在d 8时生存率降低至60%。AAs处理后，与病毒组相比小鼠体质量上升趋势不明显，且AAs高剂量组体质量下降程度大于低剂量组，推测AAs可能在10 mg·kg-1时就具有肾毒性。但是，AAs处理组的生存率明显提高(P < 0.01)，这说明AAs处理能够明显改善小鼠感染HSV-1后的生存状况，提高小鼠生存率。
此外，我们利用空斑实验检测肺部组织的病毒载量，并利用实时荧光定量PCR检测脊髓组织中的病毒载量，以此来评价AAs对于HSV体内增殖的影响。结果如Fig 9C所示，与病毒组相比，阳性药ACV组肺病毒载量下降了0.3个lg(PFU·mL-1)，AAs高剂量组肺病毒载量下降了0.9个lg(PFU·mL-1)，而AAs低剂量组下降了1.3个lg(PFU·mL-1)。AAs低剂量组优于高剂量组，且都略优于阳性药组。另外，Fig 9D的结果表明，与病毒组相比，阳性药ACV降低了小鼠脊髓组织中的约80%的病毒载量，AAs高剂量组降低了约70%的病毒载量，AAs低剂量组则降低了约90%。AAs低剂量组优于高剂量组，且效果都优于阳性药ACV组。上述结果表明，AAs在体内动物水平上能够明显降低小鼠组织中的病毒载量，且效果优于阳性药ACV。
3 讨论AAs具有广泛的生物活性和药理作用，主要有抗病毒、抗肿瘤、抗菌、抗炎、镇痛以及对心血管的药理作用[7-8]。目前为止，尚无关于AAs抗HSV作用的报道。本研究前期利用Vero细胞模型发现AAs具有抗HSV-1及HSV-2的活性，且对Vero细胞毒性较低。本研究从体外和体内两个方向入手，对AAs抗HSV的活性进行了探究。
我们体外研究发现，吸附后给药能够明显抑制HSV感染导致的细胞病变效应，同时无病毒膜融合现象不能被AAs抑制，提示其可能作用于病毒进入或后续感染步骤，且作用靶点并非HSV gB、gD、gH/gL蛋白。病毒吸附后不同时间范围给药实验表明AAs在病毒吸附后的早期阶段即2~6 h作用效果较好。吸附后加入AAs能够抑制HSV感染诱导的膜融合且能够抑制ICP27、gB、gD蛋白的表达，再次证明AAs能够抑制病毒吸附后的感染过程。同时，AAs能明显减少病毒感染后p38 MAPK和NF-κB蛋白的磷酸化程度，这可能与病毒感染后AAs抑制HSV复制的过程有关。
此外，利用HSV-1感染BALB/c小鼠建立HSV感染的小鼠肺炎和脑炎模型评价AAs的体内抗HSV作用。研究发现腹腔注射AAs治疗HSV-1感染的小鼠可明显提高小鼠的存活率；但经AAs处理后，小鼠体质量无明显上升，可能与其毒性有关。肺匀浆空斑实验及脊髓匀浆实时荧光定量PCR实验看出，AAs可明显抑制HSV在肺和脊髓中的增殖，效果略优于阳性药ACV。
综上所述，AAs具有很好的体内外抗HSV感染作用，其主要作用于病毒吸附后的感染阶段，但其具体作用靶点仍有待进一步探究。AAs对HSV在小鼠肺和脊髓中的增殖有明显抑制作用，但其体内毒性问题仍待解决。本研究首次揭示了AAs的抗HSV作用，并对其抗HSV作用机制进行了初步探究。研究结果表明，AAs具有开发成抗HSV药物的潜力，但需要严格控制使用剂量，值得后续进一步研究。
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