2. 南京中医药大学附属南京中医院，江苏 南京 210022;
3. 福建中医药大学附属人民医院，福建 福州 350004
2. Nanjing Traditional Chinese Medicine Hospital Affiliated to Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210022, China;
3. the Affiliated People's Hospital of Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350004, China
结直肠癌(colorectal carcinoma，CRC)是一种常见的消化道肿瘤，发病率在消化道肿瘤中位居第三，也是最常见的恶性肿瘤死亡原因之一[1]。手术是治疗恶性肿瘤的主要手段之一，治疗时在术前及术后会采用辅助化疗以及放疗手段来提高治愈效果[2]，但治疗后副反应较多；并且近些年来化疗药物频频出现多重耐药现象，而大量研究表明，中药的多种活性成分能够对抗肿瘤增殖以及多重耐药，这使得研究者将目标转移至中药提取物及活性单体的开发和利用[3]，开发安全高效的抗肿瘤天然药物成为一大热点。
雷公藤红素(celastrol，CEL)是卫矛科植物雷公藤(Tripterygiam Wilfordil Hook.f.)的主要活性成分之一，具有抗炎、抗肿瘤、抗肥胖等多种药理活性[4-5]。信号转导与转录激活因子(STAT3)在多种恶性肿瘤组织和细胞中均有异常活性，肿瘤微环境中细胞因子的失调能够导致磷酸化STAT3持续表达[6]，从而促进肿瘤细胞生长增殖；IL-6通过其下游转录激活因子STAT3在炎症和癌变中发挥作用，能够刺激癌细胞增殖和迁移[7]；而且IL-6、STAT3在结肠癌组织中均有较高的表达，JAK2/STAT3信号通路的过度活化与结肠癌有着密切关系[8]。此前有研究表明，CEL能够下调磷酸化STAT3水平抑制多发性骨髓瘤细胞增殖[9]，而在最新研究中其通过靶向STAT3来抑制AngII诱导的心肌细胞重塑[10]。以上研究提示我们，CEL可能主要通过靶向抑制STAT3发挥抗结直肠癌作用。因此，本文重点探讨了CEL对人结直肠癌HCT-116细胞中STAT3以及上下游相关基因的作用，测定其与人源STAT3重组蛋白的亲和力，并在患者来源的结直肠肿瘤类器官(colorectal cancer organoid，CCO)模型中做进一步抗癌活性验证，为开发潜在的抗癌药提供依据。
1 材料 1.1 试药雷公藤红素对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111946-201501)。
1.2 细胞株人肺癌细胞(A549)，人结肠癌细胞(HCT-116)，人肝癌细胞(HepG2)均购自中国科学院上海细胞库。
1.3 人体样本4例结直肠癌患者组织标本均来自于南京中医药大学附属南京中医院肛肠中心未接受治疗的成年手术患者，所有实验均经南京市中医院伦理委员会审查和批准(KY2021134)，所有样本的病理分析均在南京市中医院病理科进行。
1.4 主要试剂磷酸盐缓冲液(PBS，HyClone，AF29496678)；0.25%胰蛋白酶(Gibco，2120734)；DMEM/高糖培养基(HyClone，AF29498408)；RPMI 1640培养基(HyClone，AF29584257)；胎牛血清(Gibco，2148200RP)；二甲基亚砜(DMSO、Sigma，WXBD2695V)；CCK-8(美伦生物技术有限公司，MA0218-1)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天，P0010)；β-actin(Mouse、SANTA)；STAT3(Rabbit、CST)；p-STAT3(Rabbit、CST)；JAK2(Rabbit、abcam)；p-JAK2(Rabbit、abcam)；Survivin(Rabbit、abcam)；MCL-1(Rabbit、abcam)；rhSTAT3蛋白(武汉华美生物工程有限公司，DA04741)；CM5芯片、HBS-EP缓冲液(10×)、醋酸钠缓冲液(10 mmol·L-1)、再生试剂盒均购自GE Healthcare；Recombinant Human IL-6、R-spondin-1重组蛋白、Noggin重组蛋白和EGF重组蛋白均购自近岸蛋白质科技有限公司；ECL超敏化学发光检测试剂盒(UE、HS1023)；细胞周期与细胞凋亡试剂盒(碧云天，C1052)；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒(美伦生物，货号：MA0220-2，批号：Jan-8G)；DMEM/F12培养基(Gibco，C113300500BT)；4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液(1 mmol·L-1，Gibco，15630080)；谷氨酰胺(200 mmol·L-1，Gibco，A2916801)；细胞培养添加剂N2(1×，Gibco，17502-048)；细胞培养添加剂B27(50×，Gibco，12587-010)；N-乙酰半胱氨酸(1 mmol·L-1, MCE，HY-B0215)；烟酰胺(10 mmol·L-1，MCE，HY-B0150)；转化生长因子β(transforming growth factor β，TGF-β)抑制剂A83-01(MCE，909910-43-6)；p38抑制剂SB-202190(MCE，HY-10295)；rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(rho-associated coiled-coil forming kinase，ROCK)抑制剂Y-27632(MCE，HY-10071)；TrypLETM Express酶(Gibco，12604013)；基质胶(Corning，356231)；青霉素-链霉素(10 000 kU·L-1，Gibco，15140163)。
1.5 仪器Biacore T200(GE Healthcare，28975001)；凝胶成像分析系统(Bio-Rad，ChemiDocXRS+)；多功能酶标仪(TECAN，Infinite M200 Pro)；倒置生物显微镜(motic as2000)；数码相机(moticam 2506)；流式细胞仪(Agilent Technologies，NovoCyte 3000)。
2 方法 2.1 雷公藤红素溶液的配制精密称取雷公藤红素1.0 mg溶解于DMSO中配制成10 mmol·L-1的储存液，4 ℃保存备用。
2.2 细胞培养人肝癌细胞HepG2培养于含10%灭菌胎牛血清的DMEM高糖培养基，人结肠癌细胞HCT-116和人肺癌细胞A549培养于含10%灭菌胎牛血清的RMPI 1640培养基中，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，隔天更换培养液，当细胞生长至对数期时，进行细胞传代。
2.3 体外抗增殖活性检测采用CCK-8法检测不同浓度下的(0.02、0.1、0.5、2.5、12.5 μmol·L-1)CEL对3种肿瘤细胞(HepG2、HCT-116、A549)的毒性，取对数生长期细胞，消化离心收集细胞，将细胞浓度调至5×107 L-1，以100 μL/孔接种于96孔板，于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育24 h，加入不同浓度的CEL继续培养48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，在37 ℃、5% CO2孵育1.5 h，450 nm处测吸光度(OD)值。细胞抑制率/%=(A对照-A给药)/(A对照-A空白)×100%。
2.4 Western blot检测p-JAK2、p-STAT3、Survivin、MCL-1蛋白表达取对数生长期的HCT-116细胞，将细胞密度调至1×109 L-1后接种于6孔板，当细胞生长汇合达90%时，分别加入不同浓度的CEL，给药6 h后IL-6(25 μg·L-1)刺激30 min；提取细胞总蛋白，利用12% SDS-PAGE凝胶系统分离蛋白，将凝胶上的蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂牛奶溶液室温封闭2 h，一抗稀释液中4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次，每次10 min；然后转移至二抗稀释液中室温孵育2 h，均匀滴加ECL化学发光显影液，在凝胶成像系统上进行检测。
2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡与细胞周期 2.5.1 细胞凋亡将对数生长期的HCT-116细胞接种于6孔板，在37 ℃，5% CO2培养箱中培养24 h，吸去上清，更换为含不同浓度的CEL培养48 h后，离心收集细胞沉淀, 用预冷的PBS洗涤细胞2次，弃上清，加入1× Binding Buffer工作液重悬细胞，使细胞浓度达到1×109 L-1，吸取100 μL细胞悬液分装至新管中，分别加入碘化丙啶染色液(PI)和Annexin V-FITC进行染色，室温避光孵育15 min，加入1×Binding Buffer工作液，混匀后利用流式细胞仪在488 nm下进行检测，利用NovoExpress软件分析，绘制双色散点图。
2.5.2 细胞周期培养及给药方式同“2.5.1”，离心收集细胞沉淀后用预冷的PBS洗涤细胞，弃上清，加入预冷的70%乙醇吹打混匀，于4 ℃固定12 h后，1 000 r·min-1离心3 min，加入PI，37 ℃避光孵育30 min，利用流式细胞仪在488 nm处测量荧光强度，利用NovoExpress软件分析结果。
2.6 Biacore试验 2.6.1 预富集试验将500 mg·L-1的rhSTAT3蛋白与不同pH的醋酸钠缓冲液(10 mmol·L-1，4.5、5.0、5.5)混匀配置成rhSTAT3蛋白终浓度为10 mg·L-1，分别放置于无盖的EP管中，取无盖的EP管加入50 mmol·L-1的NaOH，用于芯片再生；将不同pH(4.5、5.0、5.5)醋酸钠缓冲液配置的蛋白溶液进样到CM5传感芯片上，观察其与芯片的结合曲线，根据响应值RU，选择最适的偶联条件。
理论偶联量计算公式：RMAX=(MW analyte/MW ligand)×RL×Sm，式中MW ligand指蛋白将STAT3的分子量为90.1 ku，MW analyte为分析物的分子量为450，Sm为化学计量比为1。
2.6.2 配体偶联实验根据预富集试验选择最佳pH条件为5.5，取4 μL STAT3蛋白与196 μL醋酸钠缓冲液混合于无盖EP管中，另取100 μL NHS(N-羟基丁二酰亚)、140 μL乙醇胺于无盖EP管中，对CM5传感芯片表面未被蛋白结合的区域进行封闭，平衡至室温25 ℃左右，将无盖EP管放在样品架上，设定流速为10 μL·min-1，时间为420 s，计算得到STAT3蛋白与芯片的结合值为14 937 RU。
2.6.3 解离平衡常数的测定将配制好的雷公藤红素母液分别用含有5% DMSO的PBS稀释成250、125、62.5、31.2、15.63、7.81、3.91、0 μmol·L-1，依次进样，结合时间为80 s，流速为30 μL·min-1，解离时间为180 s；结果通过计算机拟合并进行稳态分析得到其亲和力常数KD值。
2.7 分子对接从蛋白质数据库(PDB)获取STAT3同源二聚体的晶体结构(PDB entry: 1BG1)，从Pubchem数据库获取小分子化合物CEL的SDF格式文件，利用OpenBabel软件进行转换成PDB格式文件，使用Discovery Studio 2019分子对接软件进行对接，STAT3蛋白采用除去水和原始配体等处理，根据文献[11]选择活性口袋pTyr705(LYS-591、ARG-609、SER-611、GLU-612、SER-613)，设置球体半径为12.0，选择残基LYS-591、ARG-609、SER-611、GLU-612、SER-613进行对接处理，对于分子对接其他参数，保持原始的默认设置。
2.8 结直肠癌类器官 2.8.1 类器官培养从冷冻保存的类器官库中获得CCOs，并将CCOs重悬于基质胶与完全培养基(约2 ∶ 1)中，接种于48孔板中，在完全培养基中培养。完全培养基为DMEM/F12添加R-spondin-1重组蛋白(500 μg·L-1)、Noggin重组蛋白(100 μg·L-1)、EGF(50 μg·L-1)、HEPES缓冲液、谷氨酰胺添加剂、N2添加剂(1×)、N-乙酰半胱氨酸(1 mmol·L-1)、烟酰胺(10 mmol·L-1)、A83-01(500 nmol·L-1)、Y-27632(10 μmol·L-1)、SB202190(3 μmol·L-1)、B27添加剂(1×)；48 h更换1次培养基，10~14 d传代1次。
2.8.2 类器官活力测定将CCOs接种于96孔板，当类器官生长汇合度达50%时，分别给予不同浓度的L-OHP(0.64、3.2、16、80、400 μmol·L-1)和CEL(0.0562、0.2808、1.404、7.02、35.1 μmol·L-1)，DMSO作为空白对照组，给药6 d后，CCK-8法检测细胞活力，并拍照记录给药后类器官形态特征变化。
2.9 数据处理及统计学分析用Graphpad Prism8软件计算IC50值，用SPSS 26.0统计软件进行统计学处理，使用SigmaPlot 12.0绘图软件绘制图表。数据用x±s表示，各组间差异使用单因素方差分析。
3 结果 3.1 CEL对3种肿瘤细胞表现出抑制作用CEL给药48 h后，CCK-8法检测，利用Graphpad Prism8软件计算CEL对3种肿瘤细胞半数抑制浓度为(A549:IC50=2.37±0.02 μmol L-1、HCT-116:IC50=1.40±0.21 μmol L-1、HepG2:IC50=2.52±0.02 μmol L-1)，见Fig 1。结果表明，CEL对3种肿瘤细胞系(A549、HCT-116、HepG2)均具有抑制作用，并呈现浓度依赖性，其中对HCT-116的抑制活性相对最好。
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| Fig 1 Growth inhibition curve of CEL on A549, HCT-116, HepG2 cells (x±s, n=3) |
Western blot的结果显示，与DMSO组相比，IL-6诱导后p-STAT3(A)、p-JAK2(B)、MCL-1(C)、Survivin(C)的表达明显增加，经过CEL处理后p-JAK2无明显影响(P>0.05)，其余蛋白表达水平均出现下降趋势，且随着给药浓度的增加而降低，差异均具有显著性(P < 0.05), 见Fig 2。以上结果表明，CEL可能是靶向抑制STAT3的磷酸化，而不影响其上游蛋白的活性。
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| Fig 2 CEL inhibited p-STAT3 and its downstream genes (Survivin and MCL-1) but not upstream gene JAk2 in HCT-116 (x±s, n=3) *P < 0.05, **P < 0.01 vs DMSO; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs model |
我们使用Annexin-V-FITC/PI双重染色法进行细胞分析，从Fig A1-A4看出与对照组相比随着CEL浓度的增加，早期凋亡百分比率增加(1.78%~30.84%)，从Fig A5可知，早期凋亡的比率随着CEL浓度的增加而增加，在CEL高浓度时晚期凋亡的比率明显增大(P < 0.01)，结果均具有统计学意义；说明各组与DMSO组间均有差异。以上结果表明，CEL能够诱导结肠癌细胞凋亡，见Fig 3。
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| Fig 3 Apoptosis and cell cycle analysis of CEL on HCT-116 (x±s, n=3) Cells were treated with CEL at different concentrations (1.0, 2.5, 5.0 μmol·L-1) for 48 h. (Fig A1-A5: Cell apoptosis and its trend graph, Fig B1-B5: Cell cycle and its trend graph). *P < 0.05, **P < 0.01 vs DMSO |
稀释不同浓度的CEL干扰HCT-116细胞48 h，从Fig B1-B4可以看出于对照组相比，CEL组S期的细胞数目增加，G0/G1期细胞数目减少，表明CEL能阻滞细胞周期，见Fig 3。
3.4 CEL与人源STAT3重组蛋白具有明显的亲和力利用表面等离子共振技术(SPR)测定小分子与蛋白间的亲和力，CEL以不同浓度梯度依次进样。从Fig 4看出, 响应值(RU)与浓度成正比关系，通过计算机拟合结果，平衡解离常数KD值为6.038×10-5 mol·L-1，这表明CEL与STAT3蛋白的结合能力良好，为CEL可能是通过直接靶向抑制STAT3活性提供了更为直接的证据，以及本课题组同期发表文章[12]
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| Fig 4 The binding kinetic curve of CEL and STAT3 protein |
CEL可以与rhSTAT3蛋白结合并抑制pTyr705位点的STAT3磷酸化，为了进一步推测CEL的结合位点，采用了分子对接，如Fig 5所示，在CEL与STAT3蛋白的残基LYS-591、ARG-609、GLU-612、SER-613、ILE-634、ARG-595之间形成了多个强氢键。同时，CEL可以与残基TRP-564、ILE-589、PRO-639、VAL-637、SER-636、GLN-635、GLN-633、LYS-591产生疏水相互作用，表明CEL能够紧密地与SH2结构域结合，从而抑制STAT3的磷酸化，分子对接进一步佐证了SPR结果，见Fig 5，以及本课题组同期发表文章[12]。
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| Fig 5 Molecular docking and binding analysis of CEL on STAT3 SH2 domain |
为了进一步验证CEL对结直肠癌的抑制作用，建立了4例患者来源的CCOs(CCO-1、CCO-2、CCO-3、CCO-4)及1例CNO，利用CCK-8法检测CEL对CCOs的抑制作用，绘制IC50曲线，结果显示CEL的抑制作用强于阳性药奥沙利铂(L-OHP)，见Fig 6。
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| Fig 6 The inhibitory effect of CEL and L-OHP on CCOs and CNO (x±s, n=3) Organoid were treated with the CEL and oxaliplatin (L-OHP, positive drug) at different concentrations for 6 days. A1: Representative microscopy images of organoids incubated with CEL at the indicated concentrations for 6 days; A2: Dose-dependent effect of CEL on organoid viability; B1: Representative microscopy images of organoids incubated with L-OHP at the indicated concentrations for 6 days; B2: Dose-dependent effect of L-OHP on organoid viability. |
肿瘤的发生与发展是极其复杂的过程，IL-6受体介导的JAK2/STAT3信号通路主要是调节细胞的生长、增殖及分化，STAT3作为致癌基因能够在肿瘤细胞中持续表达[6]，寻找STAT3小分子抑制剂成为开发抗肿瘤候选药物的潜在途径[13]。本文通过体外实验发现CEL对3种肿瘤细胞均具有抑制作用，其中对HCT-116细胞活性最好。在最新文献中，CEL通过靶向STAT3抑制AngII诱导的心肌细胞重塑[10]，为了验证其作为STAT3抑制剂发挥抗肿瘤作用的推测，我们进一步探讨了CEL抗结直肠癌细胞的作用机制。首先，蛋白免疫印迹的结果说明，CEL不仅能够呈浓度依赖性下调STAT3的磷酸化，并且使其下游效应蛋白(Survivin，MCL-1)的表达量显著降低；但是不影响其上游蛋白JAK2的表达与磷酸化；其次，通过Annexin-V-FITC/PI双重染色法结合流式细胞仪检测凋亡与周期，发现CEL能够增加细胞凋亡率，阻滞细胞合成期的发生。Survivin属于细胞凋亡抑制剂(IAP)的蛋白质家族成员，MCL-1是BCL-2蛋白家族的重要成员之一[14-15]，因此，以上结果说明，CEL有可能是通过靶向抑制STAT3，下调Survivin、MCL-1等下游通路来诱导HCT-116细胞的凋亡从而抑制肿瘤细胞的生长与增殖。然后，我们通过SPR技术进一步证实了CEL对STAT3蛋白的结合能力，分子对接推测CEL是通过与SH2结构域紧密结合来抑制STAT3的磷酸化。最后，我们利用结直肠肿瘤类器官模型验证了CEL的抗肿瘤作用。类器官模型是从病人体内获取癌细胞后进行培养成的三维“微器官”，比二维细胞系更接近人类肿瘤，能够复制一些癌症特征，是细胞模型和动物模型所不能够表现的，具有更好的真实性，类器官还具有构建周期短，能够保存供体异质性等优点[16-17]。
综上，CEL具有明显的抗结直肠癌活性，其机制可能是通过靶向抑制STAT3发挥作用。然而，CEL因其水溶性差，治疗窗窄、生物利用度低限制了其在治疗癌症的应用，而且在本研究中CEL对正常结肠癌类器官也表现出一定的毒性，临床转化有一定的难度，因此本课题组针对CEL开展了一系列结构修饰研究[12]，并筛选得到活性更强的酰胺化衍生物。另外Wagh等[18]总结到基于纳米技术制剂传递药物可能提高CEL整体药理功效和安全性。在未来，各种策略的结合和利用，有望基于雷公藤红素开发出新的候选抗癌药物。
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