糖尿病人群易发心肌并发症，主要有冠心病、心肌病、心功能失常等，其中糖尿病心肌病(diabetic cardio myopathy，DCM)发病率较高，心肌纤维化(myocardial fibrosis，MF)是DCM的一种主要病理特征，心肌成纤维细胞(cardiac fibroblast，CFs)是心肌间质的主要细胞，对维持心肌的结构与功能具有十分重要的作用[1]。丹参中含有丰富的丹酚酸物质，丹酚酸B(salvianolic acid B，SalB)是丹酚酸中含量最丰富、生物活性最强的物质。越来越多的证据表明，它对多种器官和组织具有抗纤维化作用，包括肝脏[2]和肾脏[3]等。RhoA/ROCK途径影响着细胞增殖、黏附、迁移、凋亡等生物行为，是重要的调节枢纽之一[4]。在糖尿病心肌中，RhoA表达和活性的增加导致ROCK靶点磷酸化增加，导致肌动蛋白聚合增加，可能与糖尿病心脏功能障碍有关。ROCK蛋白有两种亚型，ROCK1和ROCK2，但二者在调控心肌功能方面有着一定的区别，目前认为，ROCK1参与血管平滑肌增生、心肌肥厚和组织纤维化过程，而ROCK2则更倾向于影响心肌细胞肥大功能。但ROCK1、ROCK2在高糖诱导CFs增殖、转分化及糖尿病心肌纤维化过程中具体作用如何，目前尚不十分明确。因此，本实验基于RhoA/ROCK1信号通路，建立糖尿病大鼠模型以及高糖诱导CFs，探讨SalB对糖尿病大鼠心肌纤维化的作用及其作用机制。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 动物、药品与试剂锦州医科大学实验动物中心选购♂Sprague-Dawley大鼠；鼠龄在1~3d之间的大鼠乳鼠，选购标准符合实验要求；链脲佐菌素STZ(sigma公司)；SalB(美仑MB6598)；ROCK抑制剂Y-27632(APEX BIO公司A3008)；DMEM培养基(Hyclone公司)；增强型CCK8试剂盒(碧云天生物科技有限公司)；α-SMA抗体(博士德公司WL02509)；CollagenⅠ抗体(博士德公司WL0088)；RhoA抗体(abcam公司ab187027)；ROCK1抗体(abcam公司ab134181)、CollagenⅢ(博士德公司WL03186)。
1.1.2 仪器CO2细胞培养箱(日本SANYO公司)；酶标仪(奥地利Anthos公司)；荧光显微镜(德国Leica公司)；电泳系统、化学发光凝胶系统成像仪(美国Bio-Rad公司)；高速冷冻离心机(Hitachi公司)。
1.2 方法 1.2.1 糖尿病大鼠模型建立及分组随机选取体质量(250±20)g，健康♂ SD大鼠50只，其中40只尾静脉一次性注射30 mg·kg-1 STZ(由枸橼酸缓冲液提前配置)制备糖尿病大鼠模型。72 h后检测血糖指标(血糖浓度大于16.7 mmol·L-1)，尿糖检测呈阳性的大鼠视为模型建立成功。另外10只设为正常对照组(Control)，尾静脉注射等量的0.1 mmol·L-1枸橼酸缓冲液。将建模成功的糖尿病大鼠随机分为4组: DM组、DM+SalB低剂量组(80 mg·kg·d-1)、DM+SalB中剂量组(120 mg·kg·d-1)、DM+SalB高剂量组(160 mg·kg·d-1)。SalB组在建模成功后每天进行灌胃给药处理。共饲养12周。
1.2.2 天狼星红染色取左室心肌组织，用新鲜配置的多聚甲醛溶液固定，不同浓度的无水乙醇脱水处理，石蜡包埋，常规石蜡切片脱蜡，天狼星红染色10 min，无水乙醇稍洗后沥干，脱水透明，中性树脂封片，于镜下观察胶原纤维呈红色，拍照保存。
1.2.3 CFs原代培养新生SD大鼠乳鼠，1~3 d，♀♂不拘，75%酒精消毒，用无菌的手术剪刀将心脏快速取出，放于预冷的PBS缓冲液烧杯中清洗干净，再使用眼科剪将心肌组织剪成大约1 mm3的组织碎块，将烧杯中剩余的PBS液体吸去，再加入0.25%的胰蛋白酶消化液，并将组织碎块转移至离心管中进行消化，5 min后将上清吸去。继续加入胰酶消化液并放入细胞培养箱中8 min，摇晃使组织碎块充分的消化，静置后，将离心管中的上清液吸出，并置于装有新鲜配置的含10%胎牛血清的DMEM培养液(完全培养基)的离心管中终止消化，重复消化数次直至组织碎块消失。消化好的上清液合并后，1 200 r·min-1离心5 min，吸除上清液，再加入完全培养基，将细胞沉淀轻轻吹散，混悬均匀后接种于培养瓶中差速贴壁1 h，更换完全培养基继续培养。待细胞培养贴至融合时，进行消化传代处理，后续实验使用2~4代细胞。
1.2.4 检测细胞活力将CFs细胞接种到96孔板，加入完全培养基贴壁培养1 d后，更换无血清培养基，使CFs处在同步生长状态。将CFs分为6组，每组设5复孔：正常组(Control组)，高糖组(HG组，25 mmol·L-1葡萄糖)，高渗透压对照组(MG组，19.5 mmol·L-1甘露醇+5.5 mmol·L-1葡萄糖)，不同浓度SalB组(12.5 μmol·L-1、25 μmol·L-1、50 μmol·L-1)预处理1 h，高糖诱导24 h，观测CFs的活力情况，确定SalB最佳给药浓度。CCK-8试剂盒检测各分组的吸光度OD值。
1.2.5 细胞分组及药物处理① Control组(5.5 mmol·L-1葡萄糖)，②HG组(25 mmol·L-1葡萄糖)，③HG+SalB组(25 μmol·L-1 SalB预处理CFs 1 h，HG诱导)，④HG+Y-27632组(10 μmol·L-1 ROCK抑制剂Y-27632预处理细胞1 h，HG诱导)，⑤HG+Y-27632+SalB组(10 μmol·L-1 ROCK抑制剂Y-27632预处理细胞1 h，25 μmol·L-1 SalB预处理CFs 1 h，HG诱导)
1.2.6 免疫荧光实验将CFs接种于24孔培养板内，当细胞覆盖70%视野时，将各分组加入不同药物作用24 h，弃培养液，PBS缓冲液清洗；4%多聚甲醛固定40 min，0.5% Triton X-100处理30 min，PBS缓冲液清洗；5% BSA作用30 min；各孔加入稀释的RhoA一抗溶液(1 ∶ 100)，4 ℃孵育过夜；PBS漂洗后，加入TRITC标记的荧光二抗，室温下避光静置孵育1 h；PBS漂洗，DAPI染细胞核避光5 min，吸出DAPI染液，PBS漂洗，于荧光显微镜下拍照保存。
1.2.7 Western blot各组处理因素作用CFs 24 h后，将培养基倒掉，立即放入预冷的裂解液中，在冰上进行操作，使用微量移液器吹打，冰浴中静置裂解30 min。将裂解好的CFs置于冷冻离心机离心(10 000×g、4 ℃、25 min)，取上清液，用BCA法进行蛋白质浓度测定。SDS-PAGE凝胶电泳，用移液器逐个上样，上样量为20 μg。结束后将PVDF膜于封闭液中室温封闭1 h，分别加入稀释后的兔抗大鼠CollagenⅠ一抗、兔抗大鼠CollagenⅢ一抗、兔抗大鼠RhoA一抗、兔抗大鼠ROCK1一抗、兔抗大鼠α-SMA一抗，4 ℃过夜。次日TBST洗膜3次，每次10 min，加入山羊抗兔二抗稀释液(1:5000)，室温孵育1 h。TBST清洗后进行ECL化学发光显影检测蛋白条带灰度值。
1.3 统计学方法实验数据分析软件为SPSS 22.0，用x±s表示。进行One-way ANOVA及LSD-t检验，并作组间对比。
2 结果 2.1 SalB对糖尿病大鼠左室心肌胶原表达的影响在显微镜下胶原组织显红色。Control组大鼠左室心肌胶原纤维呈现均匀分布状态；与Control组相比，DM组织间隙变大，红色胶原面积明显增多；与DM组相比，DM+SalB(80 mg·kg·d-1)、DM+SalB(120 mg·kg·d-1)和DM+SalB(160 mg·kg·d-1)各组胶原面积表达明显减少，组织间隙明显减小(Fig 1)。
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| Fig 1 Effect of SalB on collagen expression in left ventricular myocardium of diabetic rats (×200) A: Control group; B: DM group; C: DM+SalB(80 mg·kg·d-1)group; D: DM+SalB(120 mg·kg·d-1)group; E: DM+SalB(160 mg·kg·d-1)group |
Western(Fig 2)显示：与Control组相比，DM组α-SMA、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ蛋白表达水平明显升高(P＜0.01)；与DM组相比，DM+SalB(80 mg·kg·d-1)组、DM+SalB(120 mg·kg·d-1)和DM+SalB(160 mg·kg·d-1)组α-SMA、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ蛋白水平均降低(P＜0.01)，呈现一定的剂量依赖性。
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| Fig 2 Effects of SalB on expression of α-SMA, Collagen Ⅰ and Collagen Ⅲ in left ventricular myocardium of diabetic rats (n=3) 1:Control group; 2:DM group; 3:DM+SalB(80 mg·kg·d-1)group; 4:DM+SalB(120 mg·kg·d-1)group; 5:DM+SalB(160 mg·kg·d-1)group. **P < 0.01 vs Control group; ##P < 0.01 vs DM group |
如Tab 1所示，与Control组相比，HG组(25 mmol·L-1)诱导CFs活力明显增强(P＜0.01)；与HG组相比，不同浓度SalB(12.5、25、50 μmol·L-1)干预，对CFs活力均出现抑制作用(P＜0.05)，25 μmol·L-1 SalB给药组已具有极显著性差异(P＜0.01)，后续实验选取SalB的给药浓度为25 μmol·L-1。MG组细胞无明显变化(P＞0.05)，提示渗透压对CFs活力无影响。
| Group | Concentration/μmol·L-1 | OD/490nm | Cell viability Rate/% |
| Control | 0.245±0.019 | 100.00 | |
| MG | 0.251±0.025 | 100.38 | |
| HG | 0.498±0.015** | 192.18 | |
| HG+SalB | 12.5 | 0.476±0.029# | 190.15 |
| 25 | 0.373±0.010## | 121.05 | |
| 50 | 0.321±0.008## | 114.66 | |
| **P＜0.01 vs Control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs HG group | |||
免疫荧光结果实验显示(Fig 3)，蓝色荧光代表细胞核，红色荧光代表RhoA，与Control组相比，HG组细胞RhoA红色荧光强度明显增强；与HG组相比，HG+SalB组以及HG+Y-27632组RhoA荧光强度减弱；HG+Y-27632+SalB组RhoA荧光强度减弱更加明显。
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| Fig 3 Effect of SalB on expression of RhoA in CFs induced by high glucose (×400) |
Western(Fig 4)显示：与Control组相比，HG组α-SMA、RhoA、ROCK1、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ蛋白表达水平明显升高(P＜0.01)；与HG组相比，HG+SalB组与HG+Y-27632组上述蛋白水平降低(P＜0.01)；HG+Y-27632+SalB组水平降低更加显著。
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| Fig 4 Effects of SalB on expression of α-SMA, RhoA, ROCK1, Collagen Ⅰ, Collagen Ⅲ in CFs induced by high glucose (n=3) 1:Control group 2:HG group 3:HG+SalB group 4:HG+Y-27632 group 5:HG+Y-27632 +SalB group. **P < 0.01 vs Control group; ##P < 0.01 vs HG group |
长期糖尿病会导致心血管并发症的发生，包括心肌纤维化[5]。心肌纤维化的主要特征是CFs活力增强和细胞外基质过度沉积[6]。CFs是心肌内的主要细胞，约占60%~70%；在心肌细胞外基质中，存在多种类型的胶原蛋白，其中分布最多的主要是胶原蛋白Ⅰ(CollagenⅠ)和胶原蛋白Ⅲ(Collagen Ⅲ)。当机体处于正常的生理状态时，心肌中的胶原蛋白始终处于动态平衡，确保维持心肌组织的正常功能，不断合成与降解保证结构和功能的完整性，任一胶原蛋白发生改变，都有可能引起心肌功能的紊乱。本研究中，糖尿病大鼠心肌和高糖诱导CFs的CollagenⅠ和Collagen Ⅲ的表达出现同步上调，进而促进心肌纤维化的形成，和已知文献[7]保持一致。实验中应用不同剂量的SalB干预后，糖尿病大鼠左室心肌胶原表达减少，α-SMA、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ蛋白表达降低，提示SalB能够抑制糖尿病大鼠心肌纤维化。
RhoA/ROCK1途径是一条参与细胞增殖等多种生物行为的信号通路，与肌动蛋白纤维形成有着关键的作用，是一个重要的分子机制[8]。研究发现，抑制肌成纤维细胞产生的靶点中，ROCK1有调节作用，阻断RhoA/ROCK1通路，可以减轻组织纤维化[9]。糖尿病心肌RhoA活性与肌动蛋白聚合有着密切关联，其活性的增强会引发ROCK靶点磷酸化增加，从而致使纤维化因子表达水平增高，引起器官纤维化的发生与发展。
我们前期实验中，25 mmol·L-1葡萄糖诱导CFs 24 h已出现明显增殖效果[10]，故本实验使用此方法模拟高糖状态。在本实验中，高糖诱导CFs 24 h后，CollagenⅠ和Collagen Ⅲ蛋白表达水平显著上升；RhoA、ROCK1以及α-SMA蛋白表达水平也均出现上升趋势；给予ROCK1抑制剂Y-27632及SalB单独进行预处理后，上述各蛋白表达降低；给予Y-27632及SalB双重因素处理后，二者产生了累加效应，各蛋白显著降低，提示在糖尿病心肌纤维化的进程中，高糖可以通过激活RhoA/ROCK1信号通路，胶原蛋白表达增加，进而促进心肌纤维化的形成，而SalB对糖尿病心肌纤维化具有一定的保护作用，但其具体机制还需进一步研究。
综上所述，在细胞水平及在体水平，SalB对改善糖尿病心肌纤维化具有一定的作用；其机制可能与抑制RhoA/ROCK1信号通路有关。
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