2. 福建中医药大学中西医结合研究院, 福建 福州 350122;
3. 福建中医药大学修园临床医学院, 福建 福州 350122
2. Academy of Integrative Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, China;
3. Xiuyuan Clinical Medical College, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, China
帕金森病(Parkinson′s diseases, PD)是老年人中常见的一种神经退行性疾病, 其核心病理特征在于中脑黑质区多巴胺能神经细胞的死亡。多巴胺能神经细胞选择性死亡的机制目前尚不明确, 但研究者们普遍认为线粒体功能障碍导致的细胞凋亡在PD的发病过程中扮演着重要的角色[1]。因此, 改善线粒体功能，进而减少多巴胺能神经细胞凋亡是治疗PD的重要策略。
SH-SY5Y细胞来源于人神经母细胞瘤细胞系, 能表达多巴胺能神经细胞特有的多巴胺合成关键酶酪氨酸羟化酶和多巴胺转运体, 是一种研究PD等神经退行性疾病的常用细胞系。1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine, MPTP)能够导致各种哺乳动物产生类似PD的症状。它在体内代谢为1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridiniumion, MPP+), 后者能进入线粒体, 抑制氧化呼吸链复合体I酶的活性, 造成多巴胺能神经细胞氧化应激损伤, 导致细胞凋亡。因此，以MPP+处理SH-SY5Y细胞构建PD细胞模型, 已经被广泛应用于PD发病的分子机制研究和药效学评价[2]。
抗增殖蛋白(prohibitin, PHB)是一类进化高度保守的重要蛋白质, 在细菌、酵母、植物和哺乳动物等各种生物细胞中均有分布。PHB主要定位于线粒体内膜, 参与线粒体基因组和线粒体形态的维持, 并参与调节细胞氧化应激和线粒体凋亡途径[3]。
松果菊苷(echinacoside, ECH)是传统中药肉苁蓉中提取的主要活性成分, 已有多项研究表明其具有抗氧化、抗凋亡、保护神经细胞的作用[4]。课题组前期体内实验已证实，单味中药肉苁蓉以及以肉苁蓉为君药的复方苁蓉舒痉颗粒均能改善PD模型大鼠的运动协调能力, 减轻PD大鼠中脑黒质区凋亡相关蛋白的表达[5-7]。但中药保护神经细胞的有效成分及分子机制尚不清楚。本实验采用被广泛使用的MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡为PD细胞模型, 研究抗增殖蛋白是否参与松果菊苷保护神经细胞的调控及机制。
1 材料与方法 1.1 细胞株、药物与试剂SH-SY5Y细胞株, 购自中国科学院上海细胞生物学研究所; 松果菊苷(货号HY-N0020), 购自美国MCE公司; MPP+(货号D048), 购自美国Sigma公司; 高糖DMEM培养基(货号C11995500BT)、胎牛血清(货号10099-141C)、胰酶(货号25200056)均购自美国Gibco公司; 青链霉素(货号SV30010), 购自美国Hyclone公司; CCK-8(货号AMJ-KT0001), 购自武汉艾美捷科技有限公司; Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(货号KGA108), 购自江苏凯基生物技术股份有限公司; 活性氧检测试剂盒(货号CA1410)、线粒体膜电位(JC-1)检测试剂盒(货号M8650)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(货号PC0020)、RIPA裂解液(货号R0010)均购自北京索莱宝科技有限公司; Hoechst 33342染色液(货号C1026), 购自碧云天生物技术有限公司; Prohibitin抗体(货号ab75766)、Akt抗体(货号ab8805)、p-Akt抗体(货号ab38449)、Bcl-2抗体(货号ab32124)、Bax抗体(货号ab32503)、cleaved caspase-3抗体(货号ab2302)、β-actin抗体(货号ab8226)均购自美国Abcam公司; LV-siRNA-negative control(NC)、LV-siRNA-PHB慢病毒载体构建及包装由上海吉凯基因科技有限公司完成。
1.2 仪器CO2培养箱(型号3111, 美国Thermo Fisher Scientific); 荧光倒置相差显微镜(型号DFC425, 德国LEICA); 流式细胞仪(型号FACS Calibur, 美国BD公司); 化学发光成像仪(型号Universal Hood II, 美国BD公司); 荧光细胞分析仪(型号Countstar Rigel S2, 上海睿钰生物技术有限公司); Countstar自动细胞计数仪(型号IC1000, 上海睿钰生物技术有限公司); 低速台式离心机(型号TDZ4A-WS, 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司); 酶标仪(型号Multiskan FC, 赛默飞世尔科技(中国)有限公司); 超净工作台(型号SW-CJ-1FD, 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司)
1.3 细胞培养与分组SH-SY5Y细胞置于含15%胎牛血清、1%青链霉素的高糖DMEM培养液中, 在37 ℃、5% CO2的培养箱培养, 细胞汇合到80%时进行传代, 选取对数生长期的细胞进行实验。将细胞分为control组(正常培养, 不给予任何试剂干预)、MPP+组(500 μmol·L-1 MPP+处理细胞24 h)、MPP++ECH组(1、3、10、30 μmol·L-1 ECH预处理细胞24 h后加500 μmol·L-1 MPP+处理细胞24 h)。
1.4 慢病毒感染SH-SY5Y细胞用完全培养基制备密度5×107·L-1细胞悬液接种于6孔板, 37 ℃ 5% CO2培养箱培养24 h至细胞融合度达20%~30%, 按吉凯公司提供的感染条件加入LV-siRNA-negative control (NC)和LV-siRNA-PHB, 12 h后换液并继续培养48 h, 随后NC+MPP+组换液继续培养24 h, 再加入500 μmol·L-1 MPP+共同孵育24 h, NC+MPP++ECH组和PHB-RNAi+MPP++ECH组用3 μmol·L-1 ECH预处理细胞24 h, 再加入500 μmol·L-1 MPP+共同孵育24 h, 收集细胞进行后续检测。
1.5 CCK-8检测细胞存活率调整细胞密度为1×108·L-1接种于96孔板, 每孔100 μL细胞悬液, 在37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h后, 各组给予相应药物处理。每孔加入10 μL CCK-8溶液, 在培养箱孵育2 h, 用酶标仪测定在450 nm处的吸光度值(OD值), 按公式细胞存活率/%=[OD(实验组)-OD(调零)]/[OD(对照组)-OD(调零)]×100%计算细胞存活率。
1.6 Hoechst 33342染色观察细胞凋亡将SH-SY5Y细胞接种于6孔板, 分组处理后每孔加入少许4%多聚甲醛固定10 min。弃4%多聚甲醛, PBS清洗两遍, 随后每孔加入少许Hoechst 33342染色液覆盖住细胞, 37 ℃避光孵育15 min。弃染色液, PBS清洗两遍, 荧光显微镜下观察。
1.7 流式细胞仪检测细胞凋亡率、活性氧含量及线粒体膜电位SH-SY5Y细胞接种于6孔板, 分组药物处理后, 按Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒、活性氧检测试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)说明处理细胞, 使用流式细胞仪进行检测。
1.8 Western blot检测PHB、Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3相对蛋白表达收集各组细胞, 预冷PBS洗涤, 加入100 μL细胞裂解液, 冰浴30 min, 提取各组细胞总蛋白, BCA法测定各组蛋白含量。蛋白变性, SDS-PAGE电泳, 湿转转膜, 5%脱脂牛奶封闭1 h。加一抗(PHB 1 ∶ 1 000、Akt 1 ∶ 1 000、p-Akt 1 ∶ 1 000、Bcl-2 1 ∶ 1 000、Bax 1 ∶ 1 000、cleaved caspase-3 1 ∶ 1 000、β-actin 1 ∶ 2 000)4 ℃摇床过夜。TBST洗涤, 加入二抗稀释液(1 ∶ 5 000), 室温孵育2 h, TBST洗涤, ECL显影并成像, Image Lab 4.0软件分析蛋白条带灰度值, 以目的蛋白条带灰度值与β-actin条带灰度值的比值为目的蛋白相对表达量。
1.9 统计学分析采用SPSS 24.0软件进行统计学处理, 计量资料采用x±s表示, 多组间比较采用单因素方差分析, 组间两两比较采用LSD法或Game′s Howell法。
2 结果 2.1 松果菊苷预处理可以增加MPP+诱导的SH-SY5Y细胞的存活率如Fig 1A所示, 与Control组相比, 1、3、10、30 μmol·L-1的ECH处理细胞, 细胞活力无明显变化; 而当ECH浓度增加到100 μmol·L-1时, 细胞存活率显著下降, 提示ECH在100 μmol·L-1时对SH-SY5Y细胞有一定毒性, 后续实验应选择100 μmol·L-1以下的浓度。Fig 1B提示, SH-SY5Y细胞经MPP+处理后, 细胞活力明显下降。1 μmol·L-1ECH预处理后, 细胞活力无明显性变化; 而当给药浓度上升到3、10、30 μmol·L-1时, SH-SY5Y细胞活力明显上升, 且具有一定的浓度依赖性。故选择3 μmol·L-1的ECH进入后续试验。
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| Fig 1 Effect of ECH pretreatment on viability of MPP+-treated SH-SY5Y cells (x±s, n=6) A: Effect of different concentrations of ECH on the viability of SH-SY5Y cells after 24 h. B: Effect of ECH pretreatment on the viability of cells treated with MPP+.**P < 0.01 vs control; △P < 0.05, △△P < 0.01 vs MPP+. |
如Fig 2A所示, Hoechst 33342染色后可见control组细胞核呈弥漫均匀的低强度蓝色荧光, 表明细胞没有发生显著的凋亡现象; MPP+组细胞染色不均匀, 可见许多浓染致密的颗粒及块状高强度蓝色荧光, 提示出现明显的细胞核固缩、碎裂的凋亡特征性改变; 松果菊苷预处理后, 浓染致密的颗粒荧光及块状荧光减少, 提示凋亡现象有所缓解。进一步流式细胞仪及Western blot分析发现, 与control组比较, MPP+组细胞凋亡率明显升高(P < 0.05), Bax、cleaved caspase-3蛋白相对表达量明显升高, Bcl-2蛋白相对表达量明显降低; 与MPP+组比较, 松果菊苷组细胞凋亡率明显下降(P < 0.05), Bax、cleaved caspase-3蛋白相对表达量明显降低(P < 0.05), Bcl-2蛋白相对表达量明显升高，见Fig 2B、C。
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| Fig 2 Effect of echinacoside pretreatment on MPP+-induced SH-SY5Y cell apoptosis (x±s, n=6) A: Apoptosis in each group was observed by Hoechst33342 fluorescence staining (×200); B: The rate of apoptosis in each group was detected by flow cytometry. **P < 0.01 vs control; △△P < 0.01 vs MPP+; C: Relative expression of apoptotic proteins in each group was analyzed by Western blot. |
为了探讨松果菊苷减轻细胞凋亡的机制, 本实验采用流式细胞仪检测了细胞的活性氧水平和线粒体膜电位的变化。研究发现, 与control组比较, MPP+处理24 h, 可使SH-SY5Y细胞产生大量的活性氧, 线粒体膜电位也明显下降; 而当给予松果菊苷预处理后, 细胞内活性氧水平明显降低, 线粒体膜电位也明显上升，见图Fig 3A、B。
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| Fig 3 ECH inhibited production of ROS in MPP+-treated SH-SY5Y cells and increased MMP (x±s, n=6) A: ROS levels in cells in each group. **P < 0.01 vs control; △△P < 0.01 vs MPP+; B: Changes in MMP in cells of each group. **P < 0.01 vs control; △△P < 0.01 vs MPP+. |
为了探讨松果菊苷保护神经细胞的分子机制, 本实验检测了线粒体功能相关蛋白PHB以及蛋白Akt的磷酸化水平, 发现MPP+作用后PHB和磷酸化Akt的蛋白表达量与对照组相比, 差异无统计学意义; 与MPP+组对比, 松果菊苷处理后, PHB和磷酸化Akt的表达量明显上升，见Fig 4。
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| Fig 4 ECH increased expression of PHB and phosphorylation of Akt in MPP+-treated SH-SY5Y cells (x±s, n=6) A: Western blot results for PHB, Akt, and p-Akt in each group; B, C: Quantification of PHB, Akt, and p-Akt levels. **P < 0.01 vs MPP+. |
为了进一步明确PHB是否调控了松果菊苷对MPP+诱导的细胞凋亡的保护, 我们将LV-siRNA-PHB转染入SH-SY5Y细胞。PCR和Western blot结果显示, 在mRNA和蛋白水平细胞内PHB都出现了下降, 提示转染成功。随后检测各组细胞磷酸化Akt水平和细胞凋亡率, 发现敲减PHB组的SH-SY5Y细胞p-Akt水平降低, 细胞凋亡率上升。以上结果提示松果菊苷通过上调PHB水平, 促进Akt磷酸化, 进而减轻MPP+诱导的SH-SY5Y细胞的凋亡, 见Fig 5。
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| Fig 5 The protective effect of ECH reduced by PHB knockdown (x±s, n=6) A: mRNA and protein levels of PHB in cells after PHB knockdown. **P < 0.01 vs NC; B: Akt and p-Akt levels in cells of each group, as determined by Western blot after PHB-RNAi. C: Ratio of apoptosis in each group after PHB knockdown. 1:NC+MPP+; 2:NC+MPP++ECH; PHB-RNAi+MPP++ECH. **P < 0.01 vs NC+MPP+; △△P < 0.01 vs NC+MPP++ECH. |
帕金森病的病理特征是中脑黒质区多巴胺能神经细胞的丢失导致的多巴胺分泌减少, 目前通用的帕金森病的治疗办法是左旋多巴替代疗法, 但这只能改善症状而不能延缓病程的进展, 因为补充缺乏的多巴胺, 并不能保护受损的神经细胞, 并且长期应用西药会出现多种并发症[8]。在此背景下, 多成分、多途径、多靶点, 讲究“辨证论治”和“整体观念”的中药逐渐走入人们的视野。
帕金森病在中医上属于“颤证”, 病位在脑, 而脑为髓海, 肾藏精生髓, 因此补肾填精、益髓养脑是中医治疗帕金森病的重要思路[9]。肉苁蓉生长于热荒漠, 被誉为“沙漠人参”, 味甘、性温, 具有补肾壮阳、填精补髓、养血润燥等功效[10]。在课题组长期的临床经验摸索下, 已经作为君药加入治疗帕金森病的专利苁蓉舒痉颗粒的配方。课题组的前期实验已经发现苁蓉舒痉颗粒和肉苁蓉能改善病人UPRDS评分, 减轻PD模型大鼠的行为障碍, 缓解PD模型大鼠的凋亡等[5-7]。
松果菊苷是肉苁蓉中提取的主要活性成分, 已经被证实在肝脏、心脏、神经组织中有抗氧化、抗衰老、抗炎、改善学习记忆以及免疫调节等作用, 并且Liang等[11]研究已发现, 松果菊苷可以缓解MPTP诱导的PD小鼠的运动功能障碍, 抑制PD小鼠纹状体内多巴胺能神经元的凋亡。
为了探讨苁蓉舒痉颗粒、中药肉苁蓉保护神经细胞的分子机制, 本研究首先观察了单体松果菊苷对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞存活率的影响。实验发现, 当加入不同浓度的ECH后, MPP+诱导的SH-SY5Y细胞存活率明显增加, 并呈一定的剂量依赖关系。进一步实验发现, ECH增加细胞存活率的机制与减轻MPP+诱导的细胞凋亡有关: 经松果菊苷处理后, 细胞凋亡率比MPP+组明显降低, 且抗凋亡蛋白Bcl-2表达增加, 促凋亡蛋白Bax表达减少, cleaved caspase-3水平下降。我们知道, 促凋亡蛋白Bax和抑凋亡蛋白Bcl-2共同调节细胞凋亡。当促凋亡蛋白Bax活性高于抑凋亡蛋白Bcl-2时, Bax构象发生改变, 并易位于线粒体膜, 导致线粒体膜转换孔开放, 线粒体膜通透性改变, 膜电位降低, 进而引起线粒体相关凋亡因子细胞色素c释放到细胞质中, 与凋亡蛋白酶激活因子结合形成凋亡体, 促进caspase-3活化, 引发线粒体途径的细胞凋亡[12]。本实验结果提示松果菊苷可能通过抑制线粒体凋亡途径而抑制MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡。
为了探讨松果菊苷对MPP+诱导的细胞凋亡的抑制是否与改善线粒体功能有关, 我们对细胞内的活性氧水平和线粒体膜电位做了检测, 发现ECH可以明显降低MPP+导致的细胞活性氧的增多和线粒体膜电位的升高。我们知道, 线粒体内膜分布着大量质子泵, 其功能是将基质内质子H+泵入外室, 从而形成横跨内膜的线粒体膜电位。一定水平的膜电位可以调控线粒体内膜对各种物质的选择性和通透性, 维持线粒体的正常功能。而细胞内大部分活性氧都是在线粒体内代谢产生, 并通过线粒体氧化呼吸链复合物进行调节。细胞内ROS的稳态对维持细胞正常功能至关重要, 过量ROS的生成和聚集可直接或间接损伤线粒体膜而使膜电位降低, 导致线粒体膜通透性增加, 进而影响到细胞的正常结构与功能, 最终导致细胞凋亡的发生[13]。因此，检测活性氧的水平和线粒体膜电位的高低可以评价线粒体的功能。该部分的实验结果提示，松果菊苷对细胞凋亡的减轻作用可能是通过清除活性氧、稳定线粒体膜电位, 保护线粒体功能实现的。
抗增殖蛋白(prohibitin, PHB)主要定位于线粒体内膜, 是一种多功能蛋白质, 对维持线粒体形态和功能的稳定具有重要作用。PHB参与多种细胞进程, 如调节细胞的分化与凋亡、增强细胞氧化应激耐受性、调节神经细胞的修复再生以及轴突的发育形成等[14]。Akt, 也称作蛋白激酶B, 是一种丝氨酸/苏氨酸激酶, 是调控细胞周期的经典蛋白, 研究发现Akt参与了神经细胞细胞存活/凋亡、自噬、神经发生及神经细胞增殖以及突触可塑性的调控[15]。Nakano等[16]发现, Akt的持续激活对PD模型小鼠的黑质纹状体神经元有保护作用。课题组前期体内实验也与Nakano等有类似结论, 发现Akt信号通路参与了苁蓉舒痉颗粒和肉苁蓉对帕金森模型大鼠的保护作用[5-6]。Chowdhury等[17]和Li等[18]的研究显示PHB和Akt之间存在相互作用, 且PHB可调节Akt的磷酸化, 从而引起下游的生物学效应。我们的实验结果与Chowdhury和Li一致, 我们发现松果菊苷可以明显提高MPP+诱导的SH-SY5Y细胞中PHB的表达, 增强Akt的磷酸化水平, 减少MPP+诱导的SH-SY5Y细胞的凋亡率; 敲减PHB减弱了松果菊苷的保护作用, 表现为磷酸化Akt水平下降, 细胞凋亡率上升。以上结果明确了抗增殖蛋白在松果菊苷保护MPP+诱导的SH-SY5Y细胞中的关键地位, 松果菊苷能通过上调PHB水平, 促进下游Akt磷酸化, 进而减轻MPP+诱导的SH-SY5Y细胞的凋亡。
综上所述, 我们的研究揭示了中药肉苁蓉中提取的有效单体ECH保护MPP+诱导的细胞凋亡的一个新的分子机制, 即通过上调PHB, 促进Akt磷酸化, 进而改善线粒体功能, 来实现松果菊苷对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的保护。本研究为研究中药苁蓉舒痉颗粒预防和治疗帕金森病的主要有效成分及分子机制提供了实验依据。
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