2. 广西医科大学附属民族医院全科医学科，广西 南宁 530001
2. Dept of General Practice, the Affiliated Minzu Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530001, China
支气管哮喘是呼吸道常见的慢性疾病，近年来其发病率有上升趋势。哮喘也是一种异质性疾病，具有复杂的病理生理机制和不同的表型。根据支气管哮喘气道炎症特征的不同将支气管哮喘分为嗜酸性粒细胞性哮喘和非嗜酸性粒细胞性哮喘，非嗜酸性粒细胞性哮喘中以中性粒细胞气道浸润为主的称为中性粒细胞性哮喘(neutrophilic asthma，NA)。中性粒细胞性哮喘对糖皮质激素治疗不敏感，是非嗜酸性粒细胞性哮喘中最主要的类型，需要进一步探索其机制并寻找针对性的治疗方案。
维生素D3是一种脂溶性维生素，可调节钙磷代谢。研究发现，维生素D3具有免疫调节作用。流行病学方面的调查已观察到维生素D缺乏与哮喘发作之间的相关性，我们的实验也发现血清维生素D3浓度降低和肥胖哮喘的症状表现相关，和NLRP3炎性小体的活性也有相关性[1]。炎性小体是一种细胞内多聚体蛋白复合物，可以识别应激相关的内源性信号分子并参与先天免疫系统的激活。已证明NLRP3炎性小体在中性粒细胞哮喘的发病机制中起重要作用。NLRP3炎性小体活化过程中，促进细胞因子IL-18和IL-1β分泌，同时诱导caspase-1依赖的细胞焦亡。细胞焦亡主要由casepase-1、gasdermin D (GSDMD)介导。GSDMD是casepase-1的底物，经切割形成的GSDMD-N端通过寡聚化在细胞膜上形成孔洞，导致细胞裂解死亡，并释放炎症因子，级联放大炎症反应。维生素D3具有抗炎、免疫调节作用，可用于哮喘控制，但其作用机理尚不清楚。本研究通过制作中性粒细胞性哮喘小鼠模型，使用1，25-二羟维生素D3[1，25-(OH)2D3]进行干预，观察NLRP3、caspase-1、GSDMD蛋白表达、炎性细胞因子分泌及哮喘气道炎症表现，探讨1，25-(OH)2D3治疗中性粒细胞性哮喘的效果及作用机制。
1 材料与方法 1.1 试剂鸡卵清蛋白(OVA，Grade V，美国Sigma公司，# A5503)，氢氧化铝凝胶(美国Sigma公司，# 1017502)，小鼠IL-17、IL-1β、IL-18酶联免疫吸附法(ELISA)检测试剂盒(美国R&D公司，# MHS170、#MLB00C、#DY7625-05)，苏木精-伊红染液试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司KGA224)，瑞氏染色液，小鼠抗Ly6G抗体(美国Thermo Fisher scientific公司，Thermo 14-5931-82)，Western blot检测试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司，# KGP1201)，Anti-GAPDH(江苏凯基生物技术股份有限公司，# KGAA002)，Anti-cleaved caspase-1、Anti-GSDMD、Anti-NLRP3抗体(美国Cell Signaling Technology公司，#89332S、#93709S、#15101S)
1.2 仪器多功能酶标仪(美国MD Spectramac M3)，电泳仪(美国Bio-Rad Power Supplies Basic)，Trans-Blot Turbo全能型蛋白转印系统(美国Bio-Rad 170-4150)，凝胶成像系统(英国SYNGENE G，BOXChemiXR5)，病理图像分析系统(德国Leica公司)，5810R高速低温离心机(德国Eppendorf 5810R)，超声雾化器及自制雾化吸入箱等。
1.3 方法 1.3.1 实验动物和分组BALB/c♀小鼠，无特定病原体(SPF)级，4~6周龄，体质量(20~25)g。由广西医科大学实验动物中心提供并饲养于SPF级屏障系统内。动物饲养及实验方案均严格按照广西医科大学动物伦理委员会动物实验规范执行。许可证号：SCXK(桂)2020-0003。动物分组与模型制备：将24只BALB/c雌鼠随机(随机数字表法)分为3组：正常对照组(A)、模型组(B)、VD3治疗组(C)，每组8只。B组和C组采取卵清蛋白结合脂多糖的方法制作小鼠中性粒细胞性哮喘模型。适应性喂养后，每只小鼠分别于d 0、d 7和d 14给予鸡卵清蛋白(OVA)混悬液(25 μg OVA和1 mg氢氧化铝混合于0.2 mL的PBS液中)腹腔注射致敏。正常对照组以等量PBS代替致敏原腹腔注射。OVA致敏后，d 21开始行激发。将小鼠置于密闭容器中，给予2%OVA磷酸盐缓冲液20 mL雾化刺激，每天1次，连续7 d，每次20 min。正常对照组以PBS代替行雾化刺激。用LPS诱导中性粒细胞性炎症，每只小鼠于d 21、22、23、25、27在OVA激发之前30 min予以LPS 10 μg鼻腔滴入给药。C组另予以0.1%的1，25-(OH)2D3，按4 μg·kg-1在每次气道给予LPS激发前1 h腹腔注射。
1.3.2 气道反应性测定使用美国BUXCO公司TBL3999双腔体积描记系统进行无创气道反应性测定，于末次激发24 h后测定小鼠气道阻力，以乙酰甲胆碱相应浓度激发下的特殊气道阻力(sRaw)平均值与PBS激发下的特殊气道阻力平均值来反映，公式为：sRaw值=Mch sRaw值-PBS sRaw值，单位为：cmH2O。将小鼠放入密闭舱内适应时间为5 min，以PBS4和12.5、25、50 g·L-1 3个乙酰甲胆碱的浓度进行激发雾化，记录数据，分析小鼠气道反应性。
1.3.3 标本收集小鼠于最后1次气道激发后24 h，处死收集标本，使用500 μL冰PBS灌洗肺3次，收集支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)。将BALF的上清液保存在-20 ℃供检测细胞因子。收取肺组织，右肺组织福尔马林固定，以进行病理检查；左肺叶保存在-80 ℃低温冰箱，用于Western blot分析。
1.3.4 炎症细胞计数将BALF悬浮液的上清液用于检测细胞因子。剩余的细胞沉淀重悬于200 μL PBS中。用血细胞计数器测定50 μL细胞悬液，计数细胞总数。另一部分悬液进行离心重悬，行瑞氏染色，每张玻片至少计数200个炎症细胞，根据形态学标准和染色特性，按嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞进行细胞分类；由3位病理科医师进行盲法阅片，取平均值。
1.3.5 肺组织病理肺组织用4%多聚甲醛固定并进行石蜡包埋，4 μm连续切片，脱蜡后分别进行用苏木精伊红(HE)和阿辛蓝-过碘酸雪夫(AB-PAS)染色，观察小鼠肺部炎症细胞浸润、气道黏膜上皮中杯状细胞增生和黏液分泌情况，用于评估肺组织的病理变化。
1.3.6 细胞因子IL-1β、IL-18、IL-17水平ELISA法检测BALF中IL-1β、IL-18、IL-17细胞因子浓度，根据说明书提供的方法严格操作。终止反应后，用酶标仪检测450 nm波长吸光度值(OD值)，绘制标准曲线，根据标准曲线计算出细胞因子IL-1β、IL-18、IL-17浓度。
1.3.7 肺组织切片免疫组化染色测定中性粒细胞浸润情况免疫组化法检测中性粒细胞表面抗原Ly6G表达。常规脱蜡至水, pH 9.0的抗原修复缓冲液覆盖切片，微波加热10 min修复抗原。用配制好的3%过氧化氢(H2O2)溶液浸泡10 min以阻断内源性过氧化物酶。5%牛血清蛋白(BSA)室温封闭切片1 h进行血清封闭。小鼠Ly6G抗体(1 ∶50)4 ℃下孵育过夜(15 h)。加HRP标记的山羊抗兔二抗，室温孵育1 h。DAB显色试剂盒显色，然后苏木素复染2 min，水洗返蓝。常规脱水、二甲苯透明、中性树胶进行封固。在显微镜下镜检观察染色结果并采集图像。
1.3.8 Western blot检测NLRP3、caspase-1和GSDMD蛋白Western blot检测肺组织NLRP3、caspase-1和GSDMD蛋白水平的表达变化。肺组织加入含蛋白酶抑制剂的cocktails裂解细胞。胞质蛋白的提取按照试剂盒的操作步骤进行。采用Bradford法测定蛋白浓度。并获取20 μL蛋白用于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后采用半干转印方法将其转印至硝酸纤维素膜上。纤维素膜用5%牛血清白蛋白室温封闭2 h，随后分别用相应的一抗和二抗孵育，ECL显影、拍照。用图像分析系统分析蛋白条带灰度值，以目的蛋白条带灰度值与内参蛋白GAPDH条带灰度值的比值反映蛋白表达水平。
1.3.9 统计学分析利用SPSS 23.0统计软件进行统计学分析，各组数据以x±s表示，多组间比较采用多组间单因素方差分析，两两比较采用SNK检验。使用GraphPad Prism 6软件制图。
2 结果 2.1 小鼠气道反应性测定结果3组小鼠经无创肺功能检测，中性粒细胞性哮喘模型组在不同浓度Mch激发时(12.5、25、50 g·L-1)，气道反应性均高于对照组小鼠，其sRaw增长值与对照组小鼠差异均具有统计学意义(P < 0.05)；1，25-(OH)2D3治疗组小鼠在25 g·L-1和50 g·L-1 Mch的浓度激发下，其气道反应性较模型组小鼠有明显下降，sRaw增长值差异有统计学意义(P < 0.05)，见Fig 1。
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| Fig 1 Airway hyper-responsiveness test results (x±s, n=8) #P < 0.05, ##P < 0.01 vs Control; *P < 0.05 vs Neutrophilic asthma |
中性粒细胞性模型组BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞细胞比例明显增高，与正常对照组比较，差异有统计学意义(P < 0.01)；1，25-(OH)2D3治疗组细胞总数、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞比例较模型组降低，差异有统计学意义(P < 0.05)，见Fig 2。
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| Fig 2 Bronchoalveolar lavage fluid cell counts (x±s, n=8) A: Total inflammatory cell count. B: Mean percentage of neutrophils, eosinophils. ##P < 0.01 vs Control; *P < 0.05 vs Neutrophilic asthma |
小鼠肺组织经HE染色以及阿辛蓝-过碘酸雪夫(AB-PAS)染色：对照组可见肺泡壁及支气管结构完整，上皮黏膜完整，杯状细胞少见，管腔内无粘性分泌物，肺泡壁无明显增厚，肺小血管壁无增厚，肺泡间、气道周围无炎症细胞浸润。中性粒细胞性哮喘模型组可见肺脏结构破坏，肺泡壁明显增厚和肺泡大小不一致，支气管管腔内充满分泌物，可见支气管上皮出现脱落；血管和支气管周围有较多炎性细胞浸润，肺泡及间质充血明显，有出血和分泌物。PAS着色细胞明显增加，气道上皮杯状细胞增生，气道管腔内黏液渗出明显。治疗组炎症浸润减轻，支气管管腔通畅，黏膜层完整，肺泡及间质有轻度充血，对比模型组肺泡壁增厚减轻，PAS染色见杯状细胞增生及管腔内黏液分泌减轻，见Fig 3。
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| Fig 3 Histologic changes in lung tissues by HE and AB-PAS staining (×200) |
ELISA检测BALF中细胞因子，结果提示，中性粒细胞性哮喘模型组BALF中IL-17、IL-18、IL-1β水平较正常对照组增高，差异有统计学意义(P < 0.05)，治疗组BALF中IL-17、IL-18、IL-1β浓度水平较模型组下降，差异有统计学意义(P < 0.05)，见Fig 4。
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| Fig 4 Cytokine levels in bronchoalveolar lavage fluid (x±s, n=8) #P < 0.05 vs Control; *P < 0.05 vs Neutrophilic asthma |
各组小鼠肺组织免疫组化染色显示，对照组小鼠肺组织未见明显中性粒细胞浸润；与对照组相比，中性粒细胞性哮喘模型组肺组织可见中性粒细胞浸润数量明显增加；而1，25-(OH)2D3治疗组小鼠肺组织Ly6G阳性染色降低，提示中性粒细胞浸润减少，见Fig 5。
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| Fig 5 Immunohistochemical staining for Ly6G+ neutrophils in lung tissues (×400) |
通过Western blot方法检测各组小鼠肺组织NLRP3、caspase-1、GSDMD蛋白的表达水平，中性粒细胞性哮喘模型组小鼠肺组织NLRP3、caspase-1、GSDMD蛋白水平与对照组相比均明显增高，差异有统计学意义(P < 0.05)；1，25-(OH)2D3治疗组NLRP3、caspase-1、GSDMD的蛋白表达明显降低，较模型组差异有统计学意义(P < 0.05)，见Fig 6。
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| Fig 6 Detection of NLRP3, caspase-1, GSDMD protein in lung tissues by Western blot and relative expression of protein (x±s, n=8) 1.Control; 2. Neutrophilic asthma; 3.VD3 treatment. #P < 0.05, ##P < 0.01 vs Control; *P < 0.05 vs Neutrophilic asthma |
NA是一种重要的支气管哮喘炎症表型，与疾病严重程度、糖皮质激素耐药相关，其机制尚不明确。因其具有自身特殊的免疫病理学机理和表征特点，且占非嗜酸性粒细胞性哮喘的半数以上，已成为当前哮喘研究中关注的焦点。NA对糖皮质激素治疗抵抗，而且临床症状相比于其它类型的哮喘严重，因此需要对NA的发病机制加深探讨，以期获得新的治疗靶点或干预药物[2]。Th17细胞通过分泌IL-17A、IL-17F等细胞因子促进中性粒细胞气道炎症，与对糖皮质激素治疗的不敏感有关。目前研究表明，炎性小体活化是机体各种炎性反应的中心环节。Simpson等[3]证明，在中性粒细胞性哮喘中NLRP3炎性小体相关基因表达增加，并且在患者诱导痰巨噬细胞和中性粒细胞中检测到NLRP3、caspase-1蛋白。中性粒细胞性哮喘的气道炎症程度及糖皮质激素抵抗都和NLRP3炎性小体、IL-1β水平明显相关。Kim等[4]研究提示，阻断NLRP3炎性小体能有效改善合并衣原体和嗜血杆菌呼吸道感染的卵清蛋白诱导的小鼠动物模型的中性粒细胞性气道炎症。牛蒡子苷元可以通过SIRT1/NLRP3通路有效减轻哮喘模型小鼠气道炎症细胞浸润情况、降低组织炎症细胞因子，改善哮喘的气道炎症[5]。在本实验研究中，经OVA及LPS诱导的中性粒细胞性哮喘模型小鼠出现气道反应性增高，支气管肺组织炎症反应增强，BALF中中性粒细胞增多和肺组织中性粒细胞浸润增加，IL-17增高；并检测到NLRP3相关的细胞因子IL-18、IL-1β水平增加，肺组织NLRP3蛋白表达的增强，提示NLRP3炎性小体可能在哮喘的气道中性粒细胞性炎症形成中发挥重要作用。
维生素D3是一种脂溶性维生素，在体内调节钙磷的代谢，促进骨骼发育。摄入体内的维生素D分别经肝脏25-羟化酶、肾脏1-α羟化酶的作用转化为生物活性最强的1，25-(OH)2D3。实验证明维生素D3对固有免疫和特异性免疫功能都具有明显的调节效应。张路等[6]报道1，25-(OH)2D3可以减轻慢性哮喘小鼠的气道重塑及气道上皮细胞凋亡。Agrawal等[7]观察到使用1，25-(OH)2D3减轻了哮喘小鼠气道炎症和气道高反应性。这些研究显示了维生素D3用于控制哮喘的作用。我们近期发表的研究观察了维生素D3及NLRP3炎性小体表达和肥胖性哮喘的关系，发现血清维生素D3浓度水平和哮喘小鼠的气道反应性、IL-1β mRNA表达水平成负相关，提示血清维生素D3浓度降低和肥胖哮喘的症状表现相关，和NLRP3炎性小体的活性也有相关性[1]。活性维生素D3在人体内表现的抗炎作用与NLRP3炎性小体有关，有研究报道，1，25-(OH)2D3可以通过激活Nrf2从而抑制ROS-NLRP3-IL-1β信号轴，减轻高渗诱导的人角膜上皮细胞炎症[8]。维生素D3运用于预防和治疗糖尿病性视网膜病等炎症，研究发现维生素D3可降低糖尿病诱导的活性氧上升并抑制ROS/TXNIP/NLRP3炎性小体途径，减轻视网膜血管损伤和细胞凋亡[9]。本实验中，我们研究发现，予以中性粒细胞性哮喘小鼠1，25-(OH)2D3治疗降低了气道AHR和BALF中性粒细胞量，抑制了肺组织中性粒细胞浸润和杯状细胞的增生，提示1，25-(OH)2D3对中性粒细胞性炎症的抑制作用。IL-17是促进中性粒细胞浸润的主要因子，IL-18和IL-1β是NLRP3炎性小体的下游因子。研究观察到1，25-(OH)2D3治疗降低了细胞因子IL-17、IL-18和IL-1β水平，结果表明1，25-(OH)2D3治疗抑制哮喘气道炎症的作用和其调节IL-17和NLRP3炎性小体有关。
NLRP3炎性小体是由NOD样受体NLRP3骨架蛋白、接头蛋白ASC和caspase-1组成的寡聚复合物。NLRP3炎性小体活化caspase-1，促进IL-1β和IL-18的成熟和分泌，增强炎症并介导细胞焦亡。炎性小体-焦亡途径激活过程中，IL-1β前体裂解成具有活性的IL-1β，以及GSDMD切割形成GSDMD-N端和GSDMD-C端，GSDMD-N端与胞膜磷脂酰肌醇磷酸酯结合形成孔洞，导致细胞裂解死亡，释放成熟的IL-1β和IL-18，募集、激活其他免疫细胞，诱导其它炎症因子、趋化因子、粘附分子等，引发级联反应，起到放大炎症的作用。NLRP3/caspase-1/GSDMD信号轴介导的细胞焦亡与相关疾病的密切关系受到了较大的关注。Jia等[10]在肠缺血/再灌注损伤研究中发现，二甲双胍通过抑制TXNIP-NLRP3-GSDMD途径减轻了氧化应激和炎症反应，防止肠道缺血/再灌注损伤。高糖诱导NLRP3-caspase-1-GSDMD活化和膜孔形成，导致视网膜周细胞焦亡和炎性细胞因子IL-1β、IL-18释放，即高糖通过NLRP3-caspase-1-GSDMD介导的细胞焦亡诱导糖尿病视网膜病变[11]。Jiang等[12]的研究揭示，维生素D/维生素D受体可以通过抑制NF-κB介导的NLRP3/caspase-1/GSDMD细胞焦亡来减轻顺铂诱导的急性肾损伤。GSDMD对促炎细胞因子IL-1β和IL-18的释放以及细胞焦亡起到控制作用[13]。我们实验中使用1，25-(OH)2D3治疗使肺组织NLRP3、caspase-1、GSDMD表达水平降低，提示其可能通过抑制NLRP3/caspase-1/GSDMD信号轴而干预中性粒细胞哮喘炎症反应。
维生素D通过其对先天性免疫和适应性免疫反应的作用而发挥免疫调节和抗炎效力。已有较多的研究探讨了1，25-(OH)2D3在支气管哮喘中的治疗作用，显示1，25-(OH)2D3可以调节多种免疫细胞途径，抑制过度的炎症反应，如淋巴细胞、肥大细胞、抗原呈递细胞和结构细胞等，干预哮喘发病机制的众多方面。重症哮喘具有糖皮质激素治疗抵抗和气道中性粒细胞浸润的特点，与细胞因子IL-17的作用有关，而1，25-(OH)2D3也能调节气道中性粒细胞性炎症，增强中性粒细胞性哮喘对类固醇的反应[14]。我们的实验结果显示，1，25-(OH)2D3能减轻中性粒细胞性哮喘小鼠气道炎症和炎性细胞因子分泌，抑制NLRP3、caspase-1、GSDMD蛋白表达。1，25-(OH)2D3可能通过调节NLRP3/caspase-1/GSDMD信号轴改善中性粒细胞性哮喘。因此，本研究揭示了1，25-(OH)2D3干预中性粒细胞性哮喘的积极作用，为其临床应用于治疗中性粒细胞性哮喘或难治性哮喘提供了研究基础，但仍需更多的研究去探明1，25-(OH)2D3的作用机制及其临床使用的效果。
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