2. 南京晓庄学院 食品科学学院，江苏 南京 211117;
3. 江苏南星药业有限责任公司，江苏 南京 210046
2. School of Food Technology, Nanjing Xiaozhuang University, Nanjing 211117, China;
3. Jiangsu Nanxing Pharmaceutical Co., Ltd, Nanjing 210046, China
脑卒中后抑郁(post-stroke depression，PSD)是脑卒中后常见的心理障碍，也是导致脑卒中患者长期致残的主要因素之一，影响27.5%~56%的脑卒中存活者[1-2]。PSD的发生可对脑梗死患者的康复产生不利影响，包括延缓运动功能的恢复，加重认知功能障碍，甚至增加自杀的风险[2]。目前，药物治疗仍然是缓解PSD的首选。选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(如氟西汀)、5-羟色胺及去甲肾上腺素再摄取抑制剂是广泛应用的抗抑郁药，但由于疗效不稳定，甚至伴有轻重不等的不良反应，包括视力模糊、尿潴留、性功能障碍、震颤、低血压和严重失眠等而限制了它们的应用[2-3]。而传统中药在PSD的治疗则越来越受到关注[4]。
川芎始载于《神农本草经》，为伞形科多年生草本植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎，其性温味辛，具有活血行气、祛风止痛之效，主要成分包括生物碱、挥发油和有机酸等，临床广泛应用于心脑血管、神经系统等疾病的治疗[5]。临床研究报道，川芎能明显改善PSD患者的抑郁、焦虑心理[6]。实验研究也进一步证实了该药，尤其是挥发油类成分在PSD治疗中的积极作用[7-8]，但对于其相关治疗机制却仍不清楚。
cAMP应答元件结合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)是神经细胞内信号通路的重要细胞因子，可通过促进下游脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的分泌，发挥神经细胞的修复及保护效应。越来越多的研究发现，cAMP-CREB-BDNF通路的下调可能和抑郁、缺血性脑卒中、亨廷顿病，大脑炎性损伤密切相关，尤其是缺血性脑卒中的发生和发展。因此，结合已有研究成果，本课题组提出川芎注射液临床改善PSD患者的认知能力的潜在机制可能和调节cAMP-CREB-BDNF通路有关。本实验拟利用中动脉阻断(middle cerebral artery occlusion，MCAO)复合慢性应激刺激构建大鼠PSD模型，并通过行为学、尼氏评分、neuronal nuclei(Neun)表达和cAMP-CREB-BDNF通路检测，对川芎注射液缓解PSD的作用机制进行深入探讨。
1 材料 1.1 实验动物SD大鼠，♂，体质量(300~350)g，购于上海杰思捷实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK(沪)2018-0004。动物饲养于南京中医药大学实验动物中心，使用许可证号SYXK(苏) 2018-0049。
1.2 试剂10%川芎注射液，上海长海医院，批号：170704；兔抗鼠Neun抗体(ab177487，Abcam)；兔抗鼠cAMP抗体(ab76238，Abcam)；兔抗鼠p-CREB抗体(ab32096，Abcam)；兔抗鼠BDNF抗体(ab108319，Abcam)；兔抗鼠GAPDH抗体(10494-1-AP，武汉三鹰)；羊抗兔Alexa Fluor 488二抗(ab150077，Abcam)；羊抗兔IgG二抗(BA1056，武汉博士德)；DAPI染色试剂盒(KGA215，南京凯基)。
1.3 仪器Morris水迷宫行为学系统(淮北正华有限公司)，配合Any-maze行为学分析软件(美国Stoeling公司)；R540IP型小动物麻醉系统(北京瑞沃德公司)；IX71型荧光显微镜(日本Olympus公司)；ImageQuant LAS4000 mini成像系统(美国GE公司)。
2 方法 2.1 分组、造模和给药方法大鼠分为5组，即假手术组、模型组、川芎注射液低剂量组(0.1 g·kg-1)、高剂量组(0.2 g·kg-1)，每组8只。按照前述方法略加改良进行PSD造模[9]。3%异氟烷诱导麻醉后再用1.5%异氟烷维持麻醉。分离颈外动脉、颈内动脉。结扎颈外动脉远心端、颈总动脉近心端和翼腭动脉。距颈总动脉分叉处插入尼龙线并向前推至18±0.5 cm，多余的线栓缝合固定于皮肤。假手术组大鼠手术过程相同，但不插入尼龙线。每日给予青霉素(ip，10万U/只)，连续3 d。随后每只用大鼠笼单独饲养并接受28 d的慢性应激刺激，具体包括昼夜颠倒、夹尾3 min、4 ℃水游泳5 min、160 Hz水平振荡5 min、禁食1 d、禁水1 d、电击2 min(30 V，电击5 s，间隔5 s)。以上刺激重复4次以组成28次随机刺激，1次·d-1。假手术组大鼠常规饲养。动物在接受刺激的最后5 d同时腹腔注射给药，1次·d-1。正常组和模型组给予等体积NS。
2.2 行为学检测 2.2.1 糖水消耗实验[10]实验前训练动物饮用糖水。禁水24 h后每只大鼠给予20 mL的1%蔗糖水，1 h后取走水瓶并量取剩余体积，获取糖水消耗体积(mL)。
2.2.2 Open-field test(OFT)开场实验[10]自制无盖敞箱，底面为黑白相间的64个等格(10 cm×10 cm)。将大鼠放入中心方格，计时3 min，以大鼠爬过时四肢均进入的格子数作为水平运动次数，以大鼠前肢离地腾空或攀附箱壁、后肢直立次数为垂直运动次数。
2.2.3 Morris水迷宫实验按照前期研究方法进行Morris水迷宫实验[10]。该实验由一不锈钢圆形水池和一平台组成，水池直径为100 cm，水深50 cm。先在水池内注入清水，然后加入少许墨汁使水变黑，水温控制在(22±2) ℃。水池被分为2个区域。与站台距离小于50 cm为近站台区，与站台距离大于50 cm为远站台区。平时训练时间设定70 s作为逃避到平台上的最大潜伏期，超过70 s则直接将大鼠牵引至平台。实验时将大鼠随机放入任一象限，以寻找平台的时间作为潜伏期，以寻找平台游过的轨迹作为总路程，记录大鼠总路程、潜伏期、近站台区轨迹路程、远站台区轨迹路程、近/远站台区路程比。
2.3 尼氏染色和Neun免疫荧光检测取材前12 h禁食不禁水，3%异氟烷麻醉后脱颈椎处死大鼠，迅速以4%多聚甲醛心脏灌注固定，取左侧大脑半球，经脱水、透明、浸蜡与包埋，将蜡块常规切片。一部分进行尼氏染色后，对海马CA1区尼氏体进行计数和评分。另一部分滴加兔抗鼠Neun一抗(1 ∶400)，37 ℃孵育2 h，漂洗后加入羊抗兔二抗(Alexa Fluor 488，1 ∶200)孵育1 h，漂洗后每张片子滴加DAPI染液50~100 μL，复染后封片观察CA1区Neun+细胞，并利用ImageJ软件进行荧光积分定量。
2.4 Western blot检测cAMP, p-CREB和BDNF蛋白的表达取脑组织，分离出左侧海马组织。提取总蛋白后利用BCA法定量。以每孔20 μg上样，并分别进行SDS-PAGE电泳、转膜和封闭，4 ℃孵育下列一抗过夜：cAMP(1 ∶5 000)、p-CREB(1 ∶500)、BDNF(1 ∶500)、GAPDH(1 ∶10 000)。TBST洗膜3次后室温孵育二抗，再次洗膜3次，显色成像，利用ImageJ进行灰度和面积计算。cAMP、p-CREB和BDNF的表达分别和GAPDH进行比值，获取各自的相对表达量。
2.5 统计学分析所有数据均采用SPSS 19.0进行统计分析，各组实验数据以x±s表示，多组间数据比较采用单因素方差分析。
3 结果 3.1 糖水消耗实验结果与假手术组比较，模型组大鼠糖水消耗量明显减少(P < 0.01)。与模型组相比，川芎注射液低、高剂量组均明显升高PSD大鼠糖水饮用量(P < 0.05)，见Fig 1A。
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| Fig 1 Results of sugar consumption test and OFT(x±s, n=8) A: The results of sugar consumption test; B: The results of horizontal movement in OFT; C: The results of vertical movement in OFT. CZ-L and CZ-H denoted low dose group and high dose group of Chuanxiong injection respectively, the same hereinafter. ##P < 0.01 vs control; *P < 0.05 vs model. |
与假手术组比较，模型组大鼠的水平运动和垂直运动计数均明显减少(P < 0.01)。与模型组比较，川芎注射液低、高剂量组均明显增加PSD大鼠以上两种运动的计数(P < 0.05)，见Fig 1B、C。
3.3 Morris水迷宫实验结果与假手术组比较，模型组大鼠可见总路程、潜伏期、近站台区轨迹路程、远站台区轨迹路程、近/远站台区路程比均明显增加(P < 0.01)。与模型组比较，川芎注射液低、高剂量组可明显减少游泳总路程和近站台区轨迹路程(P < 0.05，0.01)。此外，高剂量组还可进一步减少登台潜伏期和近/远站台区路程比(P < 0.05)，见Fig 2A、2B。
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| Fig 2 Results of Morris water maze test(x±s, n=8) A: Representative pictures of swimming route of rats; B: The results of Morris water maze test. ##P < 0.01 vs control; *P < 0.05 vs model; **P < 0.01 vs model |
与假手术组比较，模型组大鼠不仅可见海马CA1区尼氏体数量的明显减少(P < 0.01)，还导致尼氏体形态的固缩。与模型组比较，川芎注射液低、高剂量组在明显增加尼氏体数量(P < 0.05，0.01)的同时，还可恢复尼氏体形态，提示药物对神经细胞功能的保护作用，见Fig 3A、B。
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| Fig 3 Results of Nissl staining(x±s, n=4) A: Representative images of Nissl staining; B: The results of Nissl staining. ##P < 0.01 vs control; *P < 0.05, **P < 0.01 vs model |
与假手术组比较，模型组大鼠不仅可见海马CA1区Neun荧光积分的明显减少(P < 0.01)，DAPI染色还可见核的固缩。与模型组比较，川芎注射液低、高剂量组可明显减少细胞核的固缩。此外高剂量组还增加Neun荧光积分(P < 0.05)，显示了药物对神经细胞的保护作用，见Fig 4A、4B。
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| Fig 4 Results of Neun immunofluorescence measurement(x±s, n=4) A: Representative images of Neun immunofluorescence; B: The results of Neun immunofluorescence. ##P < 0.01 vs control; *P < 0.05 vs model |
与假手术组比较，模型组大鼠可见海马组织cAMP、p-CREB和BDNF表达的明显减少(P < 0.01)。与模型组比较，川芎注射液低、高剂量组可明显增加cAMP和p-CREB的表达(P < 0.05，0.01)，高剂量组还可见BDNF表达的明显增加(P < 0.01)，提示药物对cAMP-p-CREB-BDNF通路的上调作用，见Fig 5。
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| Fig 5 Expressions of cAMP-p-CREB-BDNF pathway(x±s, n=4) ##P < 0.01 vs control; *P < 0.05, **P < 0.01 vs model |
证据表明，川芎改善PSD的机制和改善脑血流、调控凋亡基因的表达、抗自由基损伤、降低免疫炎症反应、降低兴奋性氨基酸毒、调控核录因子кB表达，以及促进神经细胞修复有关[6]。
目前，研究认为抑郁的发病机制与海马区域神经细胞的萎缩和坏死密切相关。长期应激刺激可使该区域神经网络的功能和结构缺陷，突触传递障碍，从而导致抑郁症时情绪和认知异常的发生。越来越多的研究证实海马CA1区与应激反应密切相关，被认为是抑郁症防治的重要脑区[11]。慢性应激刺激是将动物暴露于轻度而不可预知的外界刺激中，使其诱发类似于临床抑郁症的行为改变，如运动能力下降、蔗糖摄入减少、学习记忆能力降低以及对刺激的反应性迟缓，故被广泛用于动物抑郁症模型的建立[10]。
PSD往往伴随着机体大脑神经元受损，导致快乐体验能力的降低甚至丧失。而大鼠模型则可见其嗜甜本性的抑制，故糖水消耗量常常用作衡量快感缺失程度的重要指标[12]。开场实验则能反映动物对新环境的探索及情绪改变，其水平活动主要体现情绪变化，而垂直活动则反应其探索欲[12]。Morris水迷宫实验作为经典的行为学评价手段，能较为全面的评价动物学习、记忆和观察能力，故被广泛用于各类神经系统疾病中神经功能的评估。本次实验发现川芎注射液低、高剂量组均明显升高PSD大鼠糖水饮用量，增加大鼠水平和垂直运动计数，减少游泳总路程和近站台区轨迹路程。高剂量组还缩短了登台潜伏期，降低近/远站台区路程比。以上结果提示川芎注射液不仅能改善PSD大鼠对外界环境刺激的情绪反馈，提升动物的空间探索兴趣，还能增加抑郁大鼠的学习记忆能力。而在Morris水迷宫实验中对远台区轨迹路程并没有缩短，只缩短近台区路程，提示药物在恢复记忆能力方面更加突出。
尼氏体是神经细胞胞体内的嗜碱性颗粒，其在代谢功能旺盛的神经细胞中含量丰富。当神经细胞受到损伤时，尼氏体可减少、解体甚至消失。而在损伤恢复过程中，又重新出现、增多，甚至恢复至正常水平，故尼氏体形态和数量可作为神经细胞功能状态的标志[13]。Neun由Mullen等于1992在小鼠脑细胞核中发现，并广泛用作脊椎动物成熟神经元的标志物[14]。本实验发现，川芎注射液可明显增加PSD大鼠尼氏体数量，恢复尼氏体形态，提示药物对神经细胞功能的保护。
cAMP-CREB-BDNF通路在神经细胞修复和神经功能的恢复中具有重要作用。在正常生理条件下，单胺类神经递质(如5-HT、DA、NE)与细胞膜上的特定G蛋白偶联受体相互作用，激活G蛋白。后者与GTP结合后通过C2结构域激活腺苷酸环化酶，并促进cAMP的合成。cAMP与PKA的调节亚单位结合，导致PKA的催化亚单位解离并进入细胞核。在细胞核中，PKA的催化亚单位与CREB的Ser-133位点结合并磷酸化CREB。随后p-CREB与BDNF启动子区域的cAMP反应元件结合，调节BDNF的转录[15]。但在病理状态下，持续的精神应激和刺激会导致患者体内单胺类神经递质含量降低，cAMP信号转导通路减弱，从而导致其下游信号分子p-CREB和BDNF表达降低。BDNF的低表达难以抵抗应激下神经元的损伤，这可导致记忆功能的缺陷、抑郁，甚至海马体积的缩小[16-18]。本实验发现，川芎注射液可明显增加cAMP、p-CREB和BDNF的表达，提示药物对cAMP-p-CREB-BDNF通路具有上调作用，而这可能是抗PSD作用的潜在机制。
综上所述，川芎注射液可通过上调cAMP-CREB-BDNF通路，增加BDNF的表达，进而改善PSD大鼠行为学和神经功能，保护海马CA1区神经细胞，最终改善PSD大鼠认知功能。
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