表1(Table 1)
2. 安徽医科大学临床药理研究所，安徽 合肥 230032;
3. 浙江大学医学院附属妇产科医院，浙江 杭州 310006;
4. 安徽医科大学第一临床医学院，安徽 合肥 230032
2. Institute of Clinical Pharmacology, Anhui Medical University, Hefei 230032, China;
3. The Obstetrics and Gynecology Hospital Affiliated to Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310006, China;
4. The First Clinical Medical College, Anhui Medical University, Hefei 230032, China
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)在恶性肿瘤中的发病率和致死率排全球前五[1]。在中国，因肿瘤死亡的患者大多数由肝癌导致的[2]。目前，初期诊疗、手术和介入诊疗、靶向药物治疗已经成熟应用于临床上肝癌的治疗，但是每年仍有几十万人因肝癌死亡[3]；表明肝癌的初期诊断和治疗迫在眉睫[4]，因此进一步了解其发生机制可能有助于肝癌的治疗。MicroRNA (miRNA)是一种小的内源性非编码RNA。研究发现，miRNA通过结合目标信使RNA (mRNA)的3 '非翻译区域(UTR)负调控蛋白质翻译的RNA。哺乳动物miRNA参与了多种生物学过程，如分化、增殖、抗氧化应激和肿瘤抑制[5]。更重要的是，最近研究发现，miR-124在多种肿瘤中表达降低，例如肝癌、乳腺癌等，并且其参与了许多生物学过程，例如迁移、增殖、周期、凋亡和自噬等过程，表明miR-124与肿瘤的发病机制密切相关[6-7]。E盒结合锌指蛋白2(ZEB2)属于E盒结合锌指蛋白基因家族。有研究发现，ZEB2可以调节E-钙黏蛋白(E-cadherin)，间接调节肿瘤的进程，包括非小型细胞癌，肺癌和肝癌[8]。本研究旨在明确miR-124与ZEB2的靶向关系，探讨miR-124对肝癌细胞增殖，迁移和侵袭的影响，为治疗HCC提出新的诊断标志物和发现新的治疗靶点。
1 材料与方法 1.1 主要仪器，试剂和细胞系肝癌细胞株HepG2和正常肝细胞株L-02(安徽医科大学)；双荧光素酶试剂盒(美国Promega公司)；Annexin V-FITC/PI双染凋亡检测试剂盒和细胞周期检测试剂盒(上海BestBio生物公司)、ZEB2，MMP2，MMP9和PCNA抗体(中国武汉proteinech公司)、显影液(美国Millipo公司)、细胞培养瓶、细胞培养板(中国Nest生物公司)、Transwell小室(美国Thermo Fisher公司)、LippfectamineTM200(美国英杰公司)、TRIzol Reagent RNA提取试剂(美国Sigma公司)、PVDF膜(德国MERCK公司)、脱脂牛奶(上海光明公司)、DMEM培养基、胎牛血清(中国BI公司)、miR-124 mimics，miR-124 inhibitor，ZEB2 siRNA，ZEB2质粒(上海GenePharma公司)。
1.2 细胞培养在高糖培养基(10% FBS)中复苏冻存细胞，培养在37 ℃、5% CO2的细胞孵育箱中；当密度高于90%时，消化细胞并传代，后续根据实验需求进行处理。
1.3 临床样本获取收集6例HCC患者的肝癌组织和癌旁组织，癌旁组织为正常对照肝组织。所有样本采集自安徽医科大学第一附属医院，所有患者均知情同意，得到安徽医科大学伦理委员会批准。
1.4 细胞分组与转染HepG2细胞被分为空白组，阴性对照组(miR-124 NC、ZEB2-NC和Vector)，miR-124 inhibitor组，miR-124 mimics组，ZEB2-siRNA组，ZEB2质粒组(ZEB2-OE)。采用LipfeetamineTM2000进行转染，6 h后，进行换液，24 h或者48 h后，根据实验需求处理已转染的细胞。
1.5 qRT-PCR首先对用TRIzol法提取的RNA浓度进行测定，然后根据TaKaRa逆转录试剂盒说明进行操作，将RNA反转录为cDNA，并按照SYBR Premix Ex TaqⅡ加样体系，再对所得的DNA进行实时定量PCR扩增。在CFX96实时热循环仪进行检测。采用U6/GAPDH反应后采用2-ΔΔCt法计算RNA的量，各基因引物序列见Tab 1。
| Gene | Primers |
| ZEB2 | Forward: 5′-CCCTTCTGCGACATAAATACGA-3′; |
| Reverse: 5′-TGTGATTCATGTGCTGCGAGT-3′ | |
| GAPDH | Forward:5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′ |
| Reverse:5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′ | |
| miR-124 | Forward: 5′-TCTTTAAGGCACGCGGTG-3′ |
| Reverse: 5′-TATGGTTTTGACGACTGTGTGAT-3′ | |
| U6 | Forward: 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′ |
| Reverse: 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′ |
转染48 h后，用冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤收集的样本细胞(1×106~5×106)两次，并在预冷的70%~75%冰冻乙醇固定。随后，用冷PBS洗涤细胞1次。用200~500 μL冷PBS重悬细胞。加入RNase A溶液20 μL 37 ℃水浴30 min。加入400 μL PI染液溶液，缓慢混合后在4 ℃避光孵育30~60 min。流式细胞术检测细胞周期变化。激发波长为488 nm。使用合适的分析软件进行分析。
1.7 细胞侵袭能力检测将1×104个细胞接种到无血清的高糖培养基的Transwell小室上层。在侵袭实验中，上层聚碳酸酯膜上接种上Matrigel基底胶。将600 μL含10%血清的DMEM细胞培养液加入下层。培养24 ~48 h后，用0.1%结晶紫染色20 min，并且显微镜下计数跨膜细胞。
1.8 细胞划痕实验将细胞铺至6孔板中，转染结束后，用无菌的黄色枪头在6孔板的中央轻轻划痕，划痕后，用PBS清洗，然后加入无血清的高糖培养基进行培养，48 h后，在显微镜下观察并拍照，划痕愈合率越高表明细胞迁移能力越高。
1.9 CCK-8将转染后细胞接种到96孔板中，培养基体积为100 μL。在培养箱分别培养0、24、48、72、96 h后，向每孔内加入10 μL CCK-8反应溶液。4 h后，采用酶标仪检测每孔吸光度(450 nm)。
1.10 双荧光素酶报告实验利用生物信息学的预测软件对miR-124的靶基因进行预测，结果显示，ZEB2可能是miR-124的靶基因。根据预测结合位点，ZEB2野生型(ZEB2-WT)和突变型(ZEB2-MUT)荧光素酶质粒购买于湖南长沙赢润生物；采用LipfeetamineTM2000将ZEB2-WT、ZEB2-MUT和miR-124 mimics转染到HepG2细胞中，24 h后，使用Dual Luciferase试剂盒检测各组荧光强度。
1.11 Western blot转染24 h后，将收集的细胞进行充分裂解(RIPA裂解液)，提总蛋白；用Pierce BCA Protein检测蛋白浓度；然后通过SDS-PAGE分离，然后转移到PVDF膜上(GE Healthcare Life Science)。用5%脱脂牛奶阻断膜1 h，用各自的一抗过夜，用二抗(小鼠或兔)孵育1 h，然后进行化学发光检测。用ImageJ软件定量分析曝光结果，以β-actin为内参。计算ZEB2、PCNA、MMP2和MMP9蛋白表达量。
1.12 统计学处理采用SPSS 19.0软件进行统计学处理，数据以x±s表示，采用单因素方差分析、SNK-q检验或t检验。
2 结果 2.1 miR-124和ZEB2在肝癌细胞系HepG2中的表达水平采用qRT-PCR检测miR-124在人肝癌细胞系HepG2和人正常肝细胞系L-02中的表达，结果表明，HepG2细胞中miR-124水平相比于L-02细胞明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。IHC和Western blot检测ZEB2的表达变化，结果显示，ZEB2在肝癌组织和HepG2细胞中的表达明显增加，差异具有统计学意义(P<0.05)，这些数据表明miR-124在肝癌细胞中地表达，ZEB2在肝癌细胞中高表达，且miR-124与ZEB2呈负相关，见Fig 1。
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| Fig 1 Expression of miR-124 and ZEB2 A:The expression of miR-124 in HCC tissues and HepG2 cells (x±s, n=6). B:Representative IHC images of ZEB2, C and D: The protein level of ZEB2 was detected using Western blot in HCC tissues and HepG2 cells (x±s, n=3). **P<0.01,*P<0.05 vs normal group and L-02 cells group |
CCK-8的结果显示，与miR-124 NC组相比，HepG2细胞的增殖活性因miR-124 mimics明显被抑制；而miR-124 inhibitor明显促进了HepG2细胞的增殖活性，差异具有统计学意义(P<0.05)。此外，通过流式细胞术的结果可以看到，S+G2/M期的细胞比例因miR-124 mimics明显降低(P<0.05)。Western blot检测PCNA蛋白表达，结果显示，与miR-124 NC组相比，HepG2细胞中PCNA蛋白的表达因miR-124 mimics明显被抑制；而HepG2细胞中PCNA蛋白的表达因miR-124 inhibitor明显被促进，差异具有统计学意义(P<0.05)。因此，过表达miR-124明显抑制HepG2细胞的增殖活性，沉默miR-124明显促进HepG2细胞的增殖活性，见Fig 2。
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| Fig 2 Effect of miR-124 on HepG2 proliferation and apoptosis (x±s, n=3) A: The results of CCK-8 assay of HepG2 cells after miR-124 mimics transfection; B: Representative Edu images of HepG2 cells after miR-124 mimics transfection; C and D: Effect of miR-124 mimics on cell cycle and apoptosis of HepG2 cells; E and F: Effect of miR-124 inhibitor and miR-124 mimics on proliferation and apoptosis related proteins in HepG2 cells; **P<0.01, *P<0.05 vs miR-124 NC. |
Transwell检测转染miR-124 mimics和miR-124 inhibitor的HepG2细胞侵袭能力，结果显示，与miR-124 NC组比较，miR-124 mimics组的细胞个数明显降低；而miR-124 inhibitor组细胞个数明显增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。划痕实验检测细胞迁移能力；结果显示，与miR-124 NC组相比，在miR-124 mimics组划痕的愈合率明显降低，而miR-124 inhibitor组的划痕愈合明显提高，差异具有统计学意义(P<0.05)。Western blot检测MMP2和MMP9蛋白表达，结果显示，与miR-124 NC组相比，miR-124 mimics明显抑制MMP2和MMP9蛋白表达；而miR-124 inhibitor明显增加MMP2和MMP蛋白表达，差异具有统计学意义(P<0.05)。因此，过表达miR-124明显抑制HepG2细胞侵袭和迁移能力，沉默miR-124明显提高HepG2细胞侵袭和迁移能力，见Fig 3。
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| Fig 3 Effect of miR-124 on HepG2 invasion and migration (x±s, n=3) A: The migration and invasion of HepG2 cells transfected with miR-124 mimics were detected using Transwell and Wound healing; B: Effect of miR-124 inhibitor and miR-124 mimics on migration and invasion related proteins in HepG2 cells; **P<0.01 vs miR-124 NC. |
根据靶基因预测软件预测miR-124的靶基因，结果显示ZEB2可能是miR-124的靶基因，ZEB2 3′-UTR结合位点或突变位点序列，见Fig 4A。为了从功能上证明这一点，我们用ZEB2 3′-UTR荧光素酶报告基因转染HepG2细胞，结果表明，共转染miR-124 NC和ZEB2-3′-UTR组细胞中荧光素酶活性为(10.30±0.61)，共转染miR-124 mimics和ZEB2-3′-UTR组细胞荧光活性为(2.459±0.38)，低于共转染miR-124 NC和ZEB2-3′-UTR组(P<0.05)；共转染miR-124 NC和ZEB2-MUT组细胞中荧光素酶活性为(11.13±0.48)，共转染miR-124 mimics和ZEB2-MUT组细胞荧光活性为(10.85±0.93)，与共转染miR-124 NC和ZEB2-WT组比较无差异，见Fig 4B；转染miR-124 mimics和miR-124 inhibitor后用qRT-PCR和Western blot检测ZEB2蛋白表达变化，结果显示，与miR-124 NC组相比，miR-124 mimics组ZEB2表达水平明显降低；相反miR-124 inhibitor组表达水平明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，见Fig 4C和4D。因此，ZEB2是miR-124的有一个潜在靶点，证实了mi-124与ZEB2的靶向关系。
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| Fig 4 ZEB2 is a functional target of miR-124 (x±s, n=3) A: Predicted binding sites for miR-124 and ZEB2; B: The targeting relationship between miR-124 and ZEB2 was detected using dual luciferase reporter assays in HepG2 cells; C and D: Effect of miR-124 overexpression and silencing on mRNA and protein of ZEB2 in HepG2 cells; **P<0.01, *P<0.05 vs miR-124 NC. |
CCK-8和流式细胞术检测将ZEB2-siRNA和ZEB2质粒转染进入HepG2细胞后细胞的增殖活性。CCK-8结果显示，与对照组相比，ZEB2-siRNA明显抑制HepG2细胞的增殖活性，而ZEB2质粒明显促进HepG2细胞的增殖活性，差异具有统计学意义(P<0.05)。此外，流式细胞术结果显示，ZEB2-siRNA明显降低S+G2/M期细胞比例，差异具有统计学意义(P<0.05)。Western blot检测PCNA蛋白表达，结果显示，与对照组相比，ZEB2-siRNA明显抑制PCNA蛋白表达；而ZEB2质粒明显促进PCNA蛋白表达，差异具有统计学意义(P<0.05)。因此，沉默ZEB2明显抑制HepG2细胞的增殖活性，过表达ZEB2明显促进HepG2细胞的增殖活性，见Fig 5。
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| Fig 5 Effect of ZEB2 on HepG2 proliferation and apoptosis (x±s, n=3) A: The results of CCK-8 assay of HepG2 cells after ZEB2 siRNA transfection; B: Representative Edu images of HepG2 cells after ZEB2 siRNA transfection; C and D: Effect of ZEB2 siRNA on cell cycle and apoptosis of HepG2 cells; E and F: Effect of ZEB2 siRNA and ZEB2 OE on proliferation and apoptosis related proteins in HepG2 cells; **P<0.01, *P<0.05 vs ZEB2 NC and Vector |
结果显示，与对照组相比，ZEB2-siRNA组细胞数量明显降低；而ZEB2质粒组细胞数量明显增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。划痕实验检测细胞迁移能力，结果显示，与对照组相比，ZEB2-siRNA组的划痕愈合率明显降低，相反ZEB2质粒组中明显提高，差异具有统计学意义(P<0.05)。Western blot检测细胞中MMP2和MMP9蛋白表达，结果显示，与对照组相比，ZEB2-siRNA明显抑制MMP2和MMP蛋白表达；而ZEB2质粒明显促进MMP2和MMP蛋白表达，差异具有统计学意义(P<0.05)。因此，沉默ZEB2明显抑制HepG2细胞侵袭和迁移能力，过表达ZEB2明显提高HepG2细胞侵袭和迁移能力，见Fig 6。
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| Fig 6 Effect of ZEB2 on HepG2 invasion and migration (x±s, n=3) A: The migration and invasion of HepG2 cells transfected with ZEB2 siRNA were detected using Transwell and Wound healing; B: Effect of ZEB2 siRNA and ZEB2 OE on migration and invasion related proteins in HepG2 cells; **P<0.01, *P<0.05 vs ZEB2 NC and Vector |
肝癌是一种高死亡率的原发性肝癌，属于恶性肿瘤。目前一线的治疗方法是手术切除和肝脏移植，但由于肝癌具有较高的转移性和耐药性导致预后较差，降低肝癌患者的发病率和死亡率已经迫在眉睫。因此，需要进一步阐明肝癌的发病机制，从而找到更多有效的诊断和治疗方法[9]。miRNAs是一类高度保守的组织特异性非蛋白编码小RNA，通过负性基因调控维持细胞稳态。适当控制miRNA的表达是一个平衡的生理环境所必需的。越来越多的研究表明，miRNA在人类疾病中起着关键作用[10-11]。此外，多项研究表明，miRNA表达的反常通过充当肿瘤抑制因子和致癌基因与各种癌症密切相关，间接调控癌症的进程，例如生长、凋亡、迁移和侵袭等[12]。本研究发现，miR-124表达水平在肝癌中明显降低，并且HepG2的迁移和侵袭能力，增殖能力明显被miR-124 mimics抑制，其恶性程度也会随之降低。Chen等[13]发现，miR-124表达在肝癌组织中减少，并且水通道蛋白3的表达可明显被miR-124 mimics抑制，进而诱导肝癌细胞增殖及迁移能力的降低。有趣的是，本实验的结果与Chen发现的一致。此外，之前的研究也发现，SMMC-7721细胞和BEL-7404细胞的迁移和侵袭能力可以被miR-124抑制[14]。这些结果表明，miR-124是了解和治疗肝癌发病机制的一个新的诊断和治疗靶点。
EMT是上皮细胞失去顶基极性和细胞间黏附，向侵袭性间充质细胞过渡的过程。EMT涉及许多生物学和病理过程，包括胚胎发育、伤口愈合、癌细胞转移和耐药性。MiRNA主要通过和下游靶基因的3′-UTR结合，进而抑制靶基因的表达，从而影响恶性肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭和EMT。ZEB2作为EMT激活分子，促进肿瘤进展的主要驱动因素。研究表明，ZEB2和乳腺癌、肺腺癌、大肠癌等恶性肿瘤的发展和转移密切相关[15]。本实验在HepG2细胞中ZEB2对HepG2细胞凋亡、增殖、迁移，侵袭和EMT的作用及miR-124对ZEB1的调控作用。本实验发现，抑制ZEB2表达会促进细胞凋亡和增殖，ZEB2通过调控E-cadherin和Vimentin蛋白表达抑制细胞克隆的形成、迁移和侵袭。为更进一步探究上游调控的miRNA，我们通过生物信息学预测发现ZEB2是miR-124的潜在靶点。因此，我们选择miR-124作为我们的研究对象。Zhang等[16]发现，miR-124通过靶向于ZEB2进而抑制EMT和诱导肺癌细胞凋亡来抑制肺癌细胞的迁移和侵袭。本实验中，双荧光素酶实验和Western blot结果证实了miR-124可靶向作用于ZEB2进而抑制ZEB1表达。首次阐明了miR-124通过与ZEB2的3′-UTR相互作用，调控肝癌的增殖、凋亡、迁移，侵袭和EMT。
综上，本研究通过体外实验证明，miR-124促进HCC细胞的凋亡和抑制HCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力，推测其通过下调ZEB2表达诱导肿瘤细胞EMT发生而抑制HCC的侵袭和转移，为HCC转移机制的深入研究及临床治疗提供新的潜在靶点。
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