2. 新疆维吾尔自治区药物研究所，;
3. 新疆维吾尔药实验室，新疆 乌鲁木齐 830002;
4. 新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所，新疆 乌鲁木齐 830049
2. Xinjiang Medicine Research Institute,;
3. Xinjiang Uygur Medicine Laboratory, Urumqi 830002, China;
4. Xinjiang Uygur Medical Research Institute, Urumqi 830049, China
随着医疗质量和诊疗能力的提升，癌症患者生存率呈现逐渐上升趋势，但其治疗过程中的心脏毒性已引起社会的广泛关注。阿霉素(doxorubicin，DOX)是一种蒽环类抗癌药物，能有效治疗各种恶性肿瘤，但因其剂量依赖性的心脏毒性限制了其临床应用[1]。研究表明，内皮细胞是心血管系统的重要组成部分，在维持血管系统稳态方面发挥重要作用[2]。DOX所致心脏毒性小鼠可见冠状动脉微血管损伤，心脏毛细血管面积明显减少，抑制内皮功能，造成心肌损伤[3]。因此，探讨内皮功能障碍在DOX心脏毒性中的作用及机制，可能为防治阿霉素心脏毒性提供新的方向。
血管内皮生长因子B(vascular endothelial growth factor B，VEGF-B)是血管内皮生长因子家族成员之一，在心脏中的表达最为丰富，VEGF-B在病理条件下对血管存活至关重要[4]。有研究报道，VEGF-B可促进冠状动脉生成、缺血抵抗，抑制DOX诱导的心肌萎缩，抑制内皮功能障碍，保护内皮细胞，是预防DOX所致心脏毒性有意义的候选指标[4-6]。
香青兰又名巴迪然吉布亚，为唇形科野芝麻亚科青兰属植物香青兰Dracocephalum moldavica L.的干燥地上部分，在新疆地区资源尤其丰富，临床上主要用于心血管疾病的治疗且疗效确切。前期研究发现，香青兰总黄酮(total flavonoids of Dracocephalum moldavica L.，TFDM)可以提高DOX损伤的大鼠心肌细胞的存活率，抑制心肌细胞线粒体功能障碍[7]，从而发挥抑制DOX心脏毒性作用，但其对内皮细胞的保护作用尚未研究。因此，本研究拟探讨TFDM对DOX诱导HUVEC细胞损伤和内皮功能障碍的保护作用及分子机制，进而寻找新的治疗靶点。
1 材料与方法 1.1 药物与试剂TFDM(质量分数：60.60%~62.35%)由新疆维吾尔自治区药物研究所自制[8](批号: 20180406)；DMEM无糖培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；0.25% 胰酶、DMEM高糖培养基购自美国HyClone公司；CCK-8试剂盒、广谱磷酸酶抑制剂购自美国博士德生物；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)试剂盒购自南京建成生物工程研究所; SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒购自中国碧云天生物技术有限公司；BCA蛋白定量试剂盒购自美国Pierce公司；RIPA强裂解液、苯甲基黄酰氟化物PMSF试剂、线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)购自北京索莱宝科技有限公司；彩色蛋白marker购自美国Thermo Fisher公司；VEGF-B抗体(ab185696)、VEGF Receptor 1抗体(ab32152)、Neuropilin 1抗体(ab81321)、p-eNOS抗体(Ab215717)、SRC抗体(ab40660)、ET-1抗体(ab2786)购自英国Abcam公司；AMPKα抗体(CST2532)、p-AMPKα抗体(CST2535)、eNOS抗体(CST32027s)、FAK抗体(3285s)购自美国Cell Signaling Technology公司；GAPDH抗体、辣根酶标记的山羊抗兔IgG、辣根酶标记的山羊抗小鼠IgG购自中国中杉金桥公司；ECL发光液购自美国Millipore。
1.2 主要仪器细胞培养箱购自美国Thermo Fisher公司；多功能微孔板检测仪购自瑞士TECAN SPARK公司；多功能成像系统购自法国VILBER公司；电泳仪和电泳槽装置购自美国BIO-RAD公司；台式高速冷冻离心机TGL-16k购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。
1.3 细胞株及细胞培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)购自深圳市豪地华拓生物科技有限公司，培养于含10% FBS的DMEM高糖培养基中。当内皮细胞生长至融合度达85%~90%时，用胰酶-EDTA(0.25%)溶液消化细胞，并将其置于细胞培养箱中(37 ℃、5% CO2)进行传代培养，在细胞对数生长期进行实验。
1.4 DOX损伤细胞模型建立及分组给药HUVEC细胞随机分为对照组、模型组和TFDM各浓度组(25、50、100 mg·L-1)。TFDM预处理12 h后用1 μmol·L-1的DOX诱导24 h[9-10]，模拟DOX损伤内皮细胞的病理变化。
1.5 细胞活力检测将HUVEC细胞(5×107个·L-1)接种于96孔板中，每组设6个复孔，按照“1.4”项下分组及处理，按照CCK-8试剂盒说明书方法检测细胞活力，多功能微孔板检测仪在450 nm波长处测定各组吸光度值(optical density，OD)。
细胞存活率/% =(OD实验组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)×100%
1.6 HUVEC细胞形态学观察取对数生长期HUVEC细胞，制备成细胞悬液，计数，调整细胞密度为2.5×108个·L-1, 每孔2 mL，将细胞接种于6孔培养板。按照“1.4”项下方法分组及处理，倒置显微镜下观察HUVEC形态改变。
1.7 细胞内LDH和SOD检测将HUVEC细胞(5×107个·L-1)接种于96孔板，按照“1.4”项下方法分组和给药造模，每组设置6个复孔，按照检测试剂盒说明书测定细胞损伤后释放的乳酸脱氢酶(LDH)和超氧化物歧化酶(SOD)的水平。本实验进行3次独立实验。
1.8 MMP检测取对数生长期HUVEC细胞，将细胞接种于6孔培养板，细胞按1.4项下方法分组和给药造模，每个实验组设置3个复孔。去除培养基，PBS清洗2次，加入1 mL培养基和1 mL配制好的JC-1染色工作液，混匀，置于细胞培养箱(37 ℃，5% CO2)中于孵育20 min。孵育结束后，JC-1染色缓冲液清洗2次，加入细胞培养液，在同一放大倍数荧光显微镜下观察，每孔随机选取3个视野进行拍照，采用ImageJ软件对拍照结果红绿荧光的荧光强度进行分析，取各孔3个视野的均值进行统计。本实验进行3次独立实验。
1.9 HUVEC细胞迁移能力检测消化、重悬各组待测细胞，以无糖培养基调整细胞密度为1×109个·L-1，取200 μL接种至Transwell小室上室，下室中则加入500 μL含10% FBS的高糖培养基。孵育适当时间后将小室取出，轻轻擦拭掉上室未迁移的细胞，PBS清洗，4%中性甲醛固定20 min，苏木精染色30 min。最后在光学显微镜200倍视野下观察，每组每孔随机选取5个视野进行计数，取平均值进行统计分析。本实验进行3次独立实验。
1.10 免疫印迹法(Western blot)检测相关蛋白表达取对数生长期HUVEC细胞，接种于6孔板，按照“1.4”项下分组和给药造模。弃去细胞上清，用预冷的PBS洗涤3遍，加入RIPA(强)裂解液(含1% 蛋白磷酸酶抑制剂和1% PMSF)，冰上裂解30 min。低温离心(12 000 r·min-1、10 min)，使用BCA试剂盒测定蛋白样品浓度，按比例加入蛋白上样缓冲液，金属浴煮蛋白(95 ℃、5 min)使其变性，-20 ℃冷冻保存。配制SDS-多聚丙烯酰胺凝胶，上样、电泳、转膜至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭。分别加入稀释好的VEGF-B(ab185696，1 ∶ 1 000)、VEGF Receptor 1(ab32152，1 ∶ 1 000)、Neuropilin 1(ab81321，1 ∶ 1 000)、p-eNOS(Ab215717, 1 ∶ 1 000)、SRC(ab40660，1 ∶ 1 000)、ET-1(ab2786，1 ∶ 1 000)、AMPKα(CST2532, 1 ∶ 1 000)、p-AMPKα(CST2535, 1 ∶ 1 000)、eNOS(CST32027s，1 ∶ 1 000)、FAK(3285s，1 ∶ 1 000)、GAPDH(1 ∶ 2 000)一抗孵育过夜(4 ℃)、TBST(1×)充分漂洗3次，10 min/次，然后加入辣根酶标记的山羊抗兔IgG(1 ∶ 2 000)、山羊抗小鼠IgG(1 ∶ 2000)二抗室温孵育2 h，TBST(1×)充分漂洗3次，10 min/次，用ECL显色液进行显影。多功能成像系统采集显影后的图像，使用ImageJ软件分析条带灰度(以GAPDH为内参)。
1.11 数据处理采用GraphPad Prism 8.0软件进行数据处理和作图，以x±s表示，3次独立实验，采用单因素方差ANOVA进行多组数据间比较分析。
2 结果 2.1 TFDM对DOX损伤的HUVEC细胞活力的影响如Fig 1A所示，不同浓度的TFDM(1.25、2.5、5、10、25、50和100 mg·L-1)作用于HUVEC细胞36 h，对细胞存活率均无明显影响，均为无毒浓度。为确定TFDM对DOX损伤是否具有改善作用，本研究采用相应浓度TFDM干预，对HUVEC细胞活力进行测定。与对照组相比较，模型组细胞活力明显下降；与模型组比较，TFDM的质量浓度分别为5、10、25、50和100 mg·L-1时，细胞存活率明显升高(P < 0.05，Fig 1B)。上述结果提示，TFDM可改善DOX损伤，使HUVEC细胞活力增强。因此，后续实验选用的TFDM质量浓度分别为25、50和100 mg·L-1。
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| Fig 1 The protective effects of TFDM on HUVECs (x±s, n=3) A: HUVECs were treated with TFDM (0, 1.25, 2.5, 5, 10, 25, 50 and 100 mg·L-1) for 36 h, respectively, and cell viability was determined by CCK-8 assay; B: The effect of TFDM on the survival rate of HUVEC cells injured by DOX. *P < 0.05 vs model group |
结果如Fig 2所示，对照组HUVEC细胞生长状态良好，细胞呈长梭形、扁平型、多角形，排列紧密；模型组HUVEC生长停滞，细胞数量减少，体积缩小，胞质中有暗色颗粒，部分变圆，脱落；TFDM低、中、高剂量组细胞多呈长梭形、扁平型、多角形，收缩变圆细胞明显减少。提示TFDM能够明显改善DOX引起的内皮细胞形态学变化。
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| Fig 2 Effect of TFDM on morphology of HUVECs induced by DOX (×100) A: Control group; B: DOX group; C: Low dose TFDM group; D: Medium dose TFDM group; E: High dose TFDM group |
采用LDH和SOD试剂盒检测细胞损伤程度。结果如Fig 3A所示，与对照组比较，模型组细胞LDH释放明显升高(P < 0.05)；与模型组比较，TFDM低、中、高剂量给药组则明显降低LDH水平(P < 0.05)，提示TFDM能够减轻或恢复DOX引起的HUVEC细胞损伤; 结果如Fig 3B所示，与对照组比较，模型组细胞SOD活性明显降低(P < 0.05)；与模型组比较，TFDM干预后呈剂量依赖性地升高DOX损伤细胞内SOD活性(P < 0.05)，提示TFDM能够上调HUVEC细胞中的SOD活性。
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| Fig 3 The protective effects of TFDM on HUVECs injured by DOX (x±s, n=3) A: Lactate dehydrogenase (LDH) level; B: Superoxide dismutase (SOD) level; #P < 0.05 vs control group; *P < 0.05 vs model group |
JC-1是一种广泛用于检测MMP的理想荧光探针，采用JC-1标记线粒体膜电位的方法评价线粒体功能。当线粒体膜电位较高时，JC-1大量聚集在线粒体基质中，发射光以红色荧光为主；当线粒体膜电位较低时，JC-1以单体形式存在，不能聚集在线粒体基质中，发射光则以绿色荧光为主。采用红绿荧光相对比例来衡量线粒体膜电位变化。结果如Fig 4所示，与对照组相比较，模型组细胞红色荧光向绿色荧光转移，线粒体膜电位明显降低(P < 0.05)，TFDM组与模型组相比，可减少红色荧光向绿色荧光转移，TFDM组细胞膜电位升高(P < 0.05)，稳定线粒体功能，发挥细胞保护作用。
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| Fig 4 Effects of TFDM on MMP in HUVECs injured by DOX (x±s, n=3) A: Cell images stained by the lipophilic cationic probe JC-1. Red signal indicated JC-1 in mitochondria, and green signal indicated cytosolic JC-1; B: Quantitative analysis of MMP based on the cell images stained by JC-1; #P < 0.05 vs control group; *P < 0.05 vs model group |
内皮细胞迁移，对于维持血管功能和结构的稳定具有重要作用。Transwell小室实验检测结果如Fig 5所示，与对照组相比，模型组穿膜细胞数量减少(P < 0.05)，模型组细胞迁移能力减弱；与模型组相比，TFDM中、高剂量处理组穿模细胞数量增多(P < 0.05)，细胞迁移能力增强；TFDM低剂量处理组与模型组穿膜细胞数量相比差异没有统计学意义(P>0.05)。提示DOX抑制HUVEC细胞迁移，TFDM可以改善DOX诱导的HUVEC细胞迁移能力，维持血管功能。
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| Fig 5 Effects of TFDM on migration of HUVECs treated with DOX detected by Transwell assay (x±s, n=3) A: Control group(a), DOX group(b), Low dose TFDM group(c), Medium dose TFDM group(d), High dose TFDM group(e) (×200); B: Number of cell migration; #P < 0.05 vs control group; *P < 0.05 vs model group |
Src和FAK是血管内皮屏障功能的主要调控因素，内皮素-1(endothelin 1，ET-1)在维持血管张力和血管稳态中发挥重要作用[11]。由内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)催化生成的NO是内皮细胞产生的最重要的舒血管因子，可以维持血管平衡稳态[12]。本研究通过Western blot方法对ET-1、FAK、Src和p-eNOS的蛋白表达进行检测。结果如Fig 6所示，与对照组比较，DOX处理后的HUVEC细胞ET-1蛋白水平明显升高，FAK、Src、p-eNOS蛋白水平降低；但与模型组比，TFDM可明显下调ET-1蛋白水平，升高FAK、Src和p-eNOS的蛋白表达。提示TFDM可能通过调控ET-1、FAK、Src和p-eNOS的蛋白表达水平，维持血管张力和血管稳态，从而发挥抑制DOX诱导HUVEC细胞内皮功能障碍的作用。
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| Fig 6 Effects of TFDM on expression of proteins of DOX-induced HUVECs (x±s, n=3) #P < 0.05 vs control group; *P < 0.05 vs model group |
VEGF-B与内皮细胞上的VEGFR1和NRP1受体结合，激活AMPKα，增加了内皮型一氧化氮合酶含量，从而发挥促进微血管内皮细胞增殖，维持血管屏障完整性，促进微血管稳态的作用。结果如Fig 7所示，与对照组比较，DOX损伤后HUVEC细胞VEGF-B、NRP1、VEGFR1蛋白表达水平降低，AMPKα蛋白磷酸化水平降低。而TFDM干预后使VEGF-B、NRP1、VEGFR1、和p-AMPKα蛋白表达水平升高，TFDM抑制阿霉素诱导的内皮细胞损伤的机制可能与激活VEGF-B/AMPKα通路有关。
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| Fig 7 Effects of TFDM on expression of proteins of DOX-induced HUVECs (x±s, n=3) #P < 0.05 vs control group; *P < 0.05 vs model group |
内皮功能障碍是心血管并发症的一系列关键病理生理事件，可能导致出血、梗塞、动脉粥样硬化和再狭窄等。Yin等[13]发现, DOX可以减少心脏内皮细胞迁移，抑制血管网形成，降低心脏血管密度。儿童白血病患者经DOX治疗生存时间超过10年者，其血管内皮功能明显受损，而心脏未见明显影响[14]，因此，DOX对心脏的毒性作用可能是其对血管内皮细胞的影响所继发的，说明DOX对血管的损伤可能是其心脏毒性的始动因素。本次实验通过建立DOX诱导HUVEC内皮细胞损伤模型，进行细胞形态学和功能学检测，证实DOX可以抑制内皮细胞增殖，改变内皮细胞形态，增加LDH漏出量，降低SOD活力，降低线粒体膜电位，造成内皮细胞损伤。给予TFDM预保护后，不仅可以促进内皮细胞生存和增殖，改善细胞形态，还可以抑制线粒体功能障碍，从而发挥抑制DOX损伤的HUVEC细胞的作用。
NO是血管内皮细胞分泌的一种重要血管舒张活性物质，与维持心血管稳态密切相关，具有抑制平滑肌增生，避免血管病理重构和管腔狭窄的作用，且主要由eNOS催化生成[12]。内皮素(endothelin，ET)是迄今所知最强的缩血管物质，广泛存在于血管内皮和各种组织、细胞中，分为3种类型，其中以内皮素-1(endothelin 1，ET-1)活性最强，对微循环的调节起着重要作用[15]。一方面eNOS磷酸化水平表达紊乱，可能导致血管内皮细胞的损伤；另一方面，ET-1的异常表达常被认为与各种心血管疾病的发生和发展有关[16]。在结构上，Src和FAK被认为是通过促进VE-钙黏蛋白磷酸化来控制内皮屏障功能的关键因素[14]。本实验对eNOS磷酸化水平、ET-1、FAK、Src蛋白表达水平进行检测，与模型组比较，TFDM可明显下调ET-1蛋白水平，升高FAK、Src和p-eNOS的蛋白表达。提示我们TFDM可能通过调控ET-1、FAK、Src和p-eNOS的蛋白表达水平，维持血管张力和血管稳态，来发挥抑制DOX对内皮屏障功能和微血管稳态的损伤作用。细胞迁移试验中，我们发现，模型组穿过小室的细胞数量明显减少，提示DOX诱导HUVEC细胞迁移能力减弱，内皮细胞功能受到损伤。而TFDM作用后，穿过的细胞数目增多，进一步提示我们TFDM可能通过增强HUVEC细胞迁移能力，保护内皮细胞功能，维持微血管稳态。
血管内皮生长因子B(vascular endothelial growth factor B，VEGF-B)是在1996年作为VEGF同源物被发现，在高代谢活性的组织如心肌、骨骼肌中表达最为丰富。据文献报道，VEGF-B可以改善DOX诱导的小鼠内皮细胞功能障碍，防止心脏毛细血管稀疏，改善线粒体呼吸，保护内皮细胞免于凋亡，并恢复其成管功能[4]。VEGF-B通过与内皮细胞上的血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)和神经纤毛蛋白1(NRP1)受体结合[17-18]，进一步激活AMPKα，增加了内皮型一氧化氮合酶含量，从而发挥促进微血管内皮细胞增殖，维持血管屏障完整性，促进微血管稳态的作用。此研究中通过Western blot法检测VEGF-B/AMPKα通路相关蛋白表达情况证实，DOX损伤HUVEC细胞后，明显抑制VEGF-B蛋白表达，其受体NRP1、VEGFR1表达也受到抑制，p-AMPKα/AMPKα蛋白表达降低，VEGF-B/AMPKα通路在DOX损伤HUVEC细胞中发挥重要作用。给予TFDM预保护后，TFDM可以激活阿霉素诱导的HUVEC细胞VEGF-B/AMPKα信号通路。
综上所述，TFDM可明显抑制DOX引起的内皮细胞损伤。同时增强了VEGF-B/AMPKα信号通路活性，但TFDM是否通过激活VEGF-B/AMPKα信号通路发挥抑制DOX引起的内皮细胞损伤作用是我们需要进一步探讨的问题。后续试验将主要通过小分子RNA干扰抑制VEGF-B和AMPKα表达，对TFDM如何调控DOX引起的内皮细胞损伤进行蛋白和基因水平上深层次的研究。
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