2. 南京中医药大学第二附属医院科教处，江苏 南京 210017;
3. 同济大学医学院上海市第十人民医院药学部，上海 200072
2. Dept of Scientific Research, the Second Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210017, China;
3. Dept of Pharmacy, Shanghai Tenth People's Hospital, Tongji University School of Medicine, Shanghai 200072, China
肝癌是东亚国家发病率最高的癌症之一，占所有癌症的7%，而超过90%的原发性肝癌属于肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)[1]。在我国，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)感染，饮食摄入黄曲霉素和农村地区饮用水污染是引发肝癌的高危因素[2]。HCC特点是高死亡率、高复发率、高转移率和不良预后。常用化疗药物中包括5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)、铂类抗肿瘤药如顺铂(cisplatinum，DDP)[3]。5-FU是胸腺嘧啶合成酶抑制剂，通过错误插入DNA和RNA，使胸腺嘧啶合成酶失活，从而抑制DNA的合成，导致肿瘤细胞死亡[4]。DDP抗肿瘤的作用机制是与DNA单链或双链交叉连接，导致DNA模板缺陷和DNA合成和复制终止[5]。化疗是肝癌综合治疗的手段之一，对部分患者有效，但由于化疗药物多药耐药(multi-drug resistance，MDR)的产生，其治疗结果仍不理想[6-7]。
肿瘤细胞中多药耐药基因1(MDR1)的过度激活和其转录产物P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp/ABCB1/MDR1)表达的显著提高是肿瘤多药耐药产生的主要原因之一[6]；P-gp是一种跨膜转运蛋白，利用ATP水解产生的能量将药物转运出细胞膜；已知DDP、5-FU是P-gp转运的底物[7-8]。孕烷X受体(pregnane X receptor，PXR)是一种配体激活的转录调控因子，一个控制药物Ⅰ相和Ⅱ相代谢酶表达的核内受体。肝癌细胞中PXR激活后，诱导MDR1基因转录、增强P-gp表达，是肝癌化疗产生获得性多药耐药的重要机制[6, 9]。维拉帕米、环孢素等肿瘤耐药逆转剂由于毒副作用大，限制了其临床应用[10-11]，因此，从天然药物中选取高效、低毒的单体化合物逆转PXR/P-gp介导的肝癌耐药，对改善肝癌化疗疗效具有重要意义。
没药是橄榄科植物地丁树(Commiphora Myrrha Engl.)和哈地丁树(Commiphora Molmol Engl.)的干燥树脂，没药甾酮(guggulsterone，GS)是从没药脂中分离出的植物甾醇，是没药主要活性成分，包含Z和E两种同分异构体(含量比约3/1)，其中Z构型在抗肿瘤中发挥主要作用[12]。我们前期研究发现，没药甾酮通过调控P-gp表达和转运功能，能增强化疗药物对肿瘤细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用[13]。没药甾酮能否通过调控PXR/P-gp介导的肝癌多药耐药，改善其化疗疗效，目前尚未研究。本实验将对此进行研究。
1 材料与方法 1.1 细胞人源肝癌HepG2细胞，购于中国科学院上海细胞库。
1.2 药物与试剂Z-没药甾酮(Z-guggulsterone，Z-GS，>98%，3134716)、顺铂(cisplatin，DDP, >99%，PHR1624)、5-氟尿嘧啶(fluorouracil，5-FU, 99.0%~101.0%, WXBC9054V)、利福平(rifampicin，RFP，≥97%, R3501)、酮康唑(ketoconazole，KTZ，≥98%，SLBR1290V)、二甲亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO，SHBM4129)、PI(protease inhibitor cocktail，P8340)、BSA(fetal calf serum，12003C)、β-actin(IPSC1030)(美国sigma公司)；MEM(minimum essential medium，8119457)培养基(美国Hyclone公司)；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS，12106C)、双抗(青霉素、链霉素, A5955)、2.5%胰酶(trypsin, 1494079, 美国Gibco公司)、PBS(GC19KA8119, 上海生工公司)、CCK-8(Cell Counting Kit-8，PN534)(日本同仁化学科技有限公司)、Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡试剂盒(美国eBioscience公司, 225239-000)、BCA试剂盒(NA168202)(美国Thermo Fisher公司)、SDS-PAGE上样缓冲液(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺，上海碧云天生物技术有限公司, 030620200610)、MDR1(美国Cell Signaling Technology公司, 2)、PXR(英国Abcam公司，GR3311698-2)、HRP-R(2311797)、HRP-M(1670013)(美国Jackson公司)、ECL化学发光超敏显色试剂盒(S7017030)、qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox, H8001160, 上海翊圣生物科技有限公司)；TRIzol(美国Invitrogen公司，235002)；PrimeScript RT regent Kit(AI51090A, 日本TaKaRa公司)
1.3 仪器细胞培养箱、Nanodrop 2000微量分光光度计(美国Thermo Fisher公司)；DMI 6000B倒置显微镜(德国Leica公司)；Synergy2多功能酶标仪(美国BioTek公司)；ABI Q-DX荧光定量PCR仪(美国ABI公司)；7900HT FAST Real-time PCR仪(德国Eppendorf公司); FACSCanto Ⅱ流式细胞仪(美国BD Bioscience公司)；AI600化学发光成像仪(美国通用公司)。
1.4 细胞培养与试剂配制人肝癌细胞株HepG2用含10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素的MEM完全培养基培养，培养箱温度为37 ℃、5% CO2。细胞生长至密度为70%~80%时，用1×PBS清洗细胞，用0.25%胰酶(不含EDTA)于37 ℃培养箱内消化至镜下观察胞质回缩，以1/4~1/3的比例传代。各药物用DMSO溶解成母液，使用时在MEM完全培养基中稀释成所需浓度(最终DMSO < 1‰)。
1.5 CCK-8法检测细胞增殖将处于对数生长期的细胞按6 000个/孔接种于96孔板中，每孔100 μL细胞悬液，放入37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，分为对照组和实验组。实验组分别用Z-GS(1、3、10、30、100、200、400 μmol·L-1)单药处理细胞24、48、72 h；DDP(1.562 5、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 μmol·L-1)单药、5-FU(0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10、20 mmol·L-1)单药及联合Z-GS(30 μmol·L-1)处理细胞24 h，每个浓度设6个复孔，每组实验独立重复4次。处理后每孔加入培养液体积10%的CCK-8试剂，在37 ℃、5% CO2培养箱内反应1.5 h，用酶标仪检测每孔450 nm处吸光度(A)，将每组吸光度求平均值，使用均值计算细胞存活率。存活率/%=(A对照组-A实验组)/(A对照组-A实验组) ×100%。
1.6 AnnexinⅤ-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡取对数生长期细胞，按2×104个/孔种于24孔培养板中，每孔1 mL完全培养基，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，分为对照组和实验组。实验组分别用DDP(6.25、12.5、25、50、100 μmol·L-1)单药、5-FU(0.312 5、0.625、1.25、2.5、5 mmol·L-1)单药及联合Z-GS(30 μmol·L-1)处理24 h。收集各孔培养液中的悬浮细胞，用0.25%胰酶消化每孔贴壁细胞并用完全培养基终止消化后合并。用PBS清洗2次，加入100 μL Binding buffer和FITC标记的Annexin-Ⅴ(20 mg·L-1)5 μL，室温避光15 min，再加入PI(50 mg·L-1)5 μL，避光反应5 min，加入400 μL Binding buffer，同时以不加Annexin-Ⅴ FITC/PI的一管作阴性对照。用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率，各组实验独立重复3次。使用FACSDIVA软件分析结果。
1.7 RT-qPCR法检测mRNA表达取对数生长期细胞，按1.5×105个/孔接种于12孔板，每孔1 mL完全培养基，37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，分为对照组和实验组。实验组分别用不同浓度Z-GS(10、30、100、200 μmol·L-1)，DDP(50 μmol·L-1)、5-FU(2.5 mmol·L-1)单药及联用Z-GS(30 μmol·L-1)处理24 h。根据TRIzol Reagent说明书抽提总RNA，使用微量分光光度计测定RNA浓度和纯度，A260/A280值均在1.8~2.0之间。根据PrimeScript RT reagent Kit说明书逆转录RNA，反应条件为：37 ℃ 15min，85 ℃ 5s，cDNA储存于-20 ℃。根据SYBR Green Master Mix (High Rox)说明书进行实时荧光定量反应，qPCR反应体系为10 μL，反应条件为：95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40个循环。引物序列如下：MDR1上游引物：5′-GGGAGCTTAACACCCGACTTA-3′, 下游引物：5′-GCCAAAATCACAAGGGTTAGCTT-3′; GAPDH上游引物：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′, 下游引物: 5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。所有实验独立重复3次，结果以Ct值表示，目的基因MDR1相对于内参基因GAPDH的表达量用2-ΔΔCt表示。
1.8 Western blot法检测蛋白表达取对数生长期的细胞，3×105个/孔接种于6孔板，每孔2 mL完全培养基，37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，分为对照组和实验组。实验组分别用不同浓度Z-GS(3、10、30 μmol·L-1)、DDP(25、50、100 μmol·L-1)单药、5-FU(1.25、2.5、5 mmol·L-1)单药、KTZ(40 μmol·L-1)和RFP(30 μmol·L-1)以及联用Z-GS(30 μmol·L-1)处理24 h。使用含1%PI的2×loading冰上提取总蛋白，BCA法测定各组蛋白样品浓度，加入SDS-PAGE并加热10 min使蛋白变性。按每个样品40 μg蛋白总量进行SDS-PAGE凝胶电泳，待目的蛋白分离后于冰水浴条件下将蛋白转移至NC膜，以5%BSA为封闭液室温摇床封闭1 h，将一抗用封闭液稀释后(β-actin：1 ∶1 000、P-gp：1 ∶1 000、PXR：1 ∶200)，于4 ℃避光孵育过夜。次日用含0.1% Tween 20的PBST洗膜3次，每次10 min，二抗用封闭液稀释后(HRP-R：1 ∶1 000、HRP-M: 1 ∶1 000)，室温避光孵育1 h，PBST洗膜3次，每次10 min。通过ECL化学发光法得到目的蛋白条带，β-actin为内参，图像使用Image Studio分析。每组实验独立重复5次。
1.9 统计学方法各组数据以x±s表示，各组实验独立重复至少3次。使用SPSS 19.0软件作独立样本t检验，用GraphPad Prism 8.0作单因素方差分析验证。
2 结果 2.1 Z-GS显著增强DDP和5-FU对HepG2增殖抑制作用与对照组相比，100、200、400 μmol·L-1Z-GS处理细胞24 h后，细胞存活率分别为88.37%、79.46%、60.24%，明显抑制HepG2细胞增殖(P < 0.05，Fig 1A)；24 h Z-GS(≤30 μmol·L-1)对HepG2细胞增殖几乎无影响(P>0.05)，所以选择Z-GS(30 μmol·L-1)与化疗药物联用进行后续实验。3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 μmol·L-1DDP单独处理细胞24 h细胞存活率分别为97.18%、94.59%、81.11%、70.79%、56.91%、40.95%、29.42%，与Z-GS(30 μmol·L-1)联用后细胞存活率分别为83.93%、83.29%、74.65%、52.93%、36.52%、30.39%、26.77%；0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10、20 mmol·L-1 5-FU单独处理细胞24 h细胞存活率分别为95.26%、92.54%、84.64%、79.16%、65.77%、43.31%、23.58%，与Z-GS(30 μmol·L-1)联用后为88.90%、85.50%、77.78%、70.21%、54.49%、36.72%、17.67%。结果表明，与DDP、5-FU单药组相比，联用Z-GS(30 μmol·L-1) 明显增强化疗药物对HepG2细胞的增殖抑制作用(P < 0.05, Fig 1C, D)。
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| Fig 1 Proliferation of HepG2 cells treated by chemotherapeutic agents alone for 24, 48, 72 h or combined with Z-GS (30 μmol·L-1) for 24 h, detected by CCK-8(x±s, n=4) A: Treated by Z-GS (1, 3, 10, 30, 100, 200, 400 μmol·L-1) alone for 24, 48 or 72 h.*P < 0.05, **P < 0.01 vs control; ##P < 0.01 vs 24 h; ▽P < 0.05, ▽▽P < 0.01 vs 48 h. Z-GS, Z-guggulsterone. B: Treated by Z-GS (1, 3, 10, 30, 100, 200, 400 μmol·L-1) alone for 24, 48 or 72 h.*P < 0.05, **P < 0.01 vs lower concentration level. C: Treated by DDP alone or combined with Z-GS for 24 h. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs DDP alone; D: Treated by 5-FU alone or combined with Z-GS for 24 h. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs 5-FU alone. |
与对照组相比，24 h Z-GS(30 μmol·L-1)对HepG2细胞凋亡几乎无影响；DDP(12.5、25、50、100 μmol·L-1)处理HepG2细胞24 h后显著促进HepG2细胞凋亡，与Z-GS(30 μmol·L-1) 联用后，进一步增加DDP对HepG2细胞凋亡诱导作用，凋亡率分别由2.53%、3.27%、4.83%、8.93%、14.27%增加至4.6%、5.47%、10.17%、16.97%、29.1%；与对照组相比，5-FU(2.5、5 mmol·L-1)明显促进HepG2细胞凋亡，与Z-GS(30 μmol·L-1) 联用后，进一步增加5-FU对HepG2细胞凋亡诱导作用，凋亡率分别由0.73%、0.93%、1.07%、1.90%、3.33%增加至2.6%、3.8%、5.17%、9.63%、29.5%(P < 0.05, Fig 2)。
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| Fig 2 Z-GS significantly increased DDP or 5-FU-induced apoptosis of HepG2 cells (x±s, n=3) A, B: Double staining of Annexin Ⅴ-FITC/PI analyzed by flow cytometric; C, D: Quantitated data of apoptosis rates from flow cytometry. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs DDP alone, 5-FU alone. |
与对照组相比，3、10、30 μmol·L-1Z-GS处理HepG2细胞24 h后明显降低HepG2细胞中PXR和P-gp蛋白表达，分别下调了17.81%、28.31%、47.18%和14.24%、31.44%、35.67%(P < 0.05, Fig 3)；与对照组相比，DDP(25、50、100 μmol·L-1)明显下调PXR和P-gp蛋白表达，且具有浓度依赖性，分别下调了14.90%、34.99%、38.02%和21.06%、36.81%、49.09%，Z-GS(30 μmol·L-1) 联用增强DDP对PXR和P-gp蛋白表达的下调作用，进一步下调了35.28%、28.87%、24.41%和19.13%、4.3%、19.18%(P < 0.05, Fig 4)。与对照组相比，5-FU(1.25、2.5、5 mmol·L-1)明显下调PXR蛋白表达，5-FU(2.5、5 mmol·L-1)明显下调P-gp蛋白表达, 且具有浓度依赖性，分别下调了37.34%、43.80%、64.97%和39.30%、53.62%;Z-GS(30 μmol·L-1)联用增强5-FU对PXR和P-gp蛋白表达的下调作用，进一步下调了40.18%、31.47%、19.53%和46.30%、20.67%、14.68%(P < 0.05, Fig 5)。
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| Fig 3 PXR and P-gp were down-regulated by Z-GS for 24 h in HepG2 cells (x±s, n=3) A: Representative Western blot of proteins; B, C: Quantitated data from immunoblots for PXR(B) and P-gp(C) are shown. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group. |
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| Fig 4 PXR and P-gp were down-regulated by DDP alone or combined with Z-GS for 24 h in HepG2 cells (x±s, n=5) A: Representative Western blot of proteins; B, C: Quantitated data from immunoblots for PXR(B) and P-gp(C) are shown. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05 vs DDP alone. |
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| Fig 5 PXR and P-gp were down-regulated by 5-FU alone or combined with Z-GS in HepG2 cells (x±s, n=5) A: Representative Western blot of proteins; B, C: Quantitated data from immunoblots for PXR(B) and P-gp(C) are shown. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs 5-FU alone. |
与对照组相比，30 μmol·L-1Z-GS明显下调HepG2细胞中MDR1 mRNA的转录水平，下调了30.22%；与对照组相比，50 μmol·L-1DDP明显下调HepG2细胞中MDR1 mRNA的转录水平，下调了52.81%，与30 μmol·L-1Z-GS联用后，MDR1 mRNA转录水平进一步下调了10.02%；与对照组相比，2.5 mmol·L-1 5-FU明显下调HepG2细胞中MDR1 mRNA的转录水平，下调了16.91%，与30 μmol·L-1 Z-GS联用后MDR1 mRNA转录水平进一步下调了20.04%(P < 0.05，Fig 6)。
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| Fig 6 Expression of MDR1 mRNA was suppressed by chemotherapeutic agents alone or combined with Z-GS in HepG2 cells (x±s, n=3) A: Quantitated data from RT-qPCR for MDR1 mRNA treated with Z-GS; B, C: Quantitated data from RT-qPCR for MDR1 mRNA treated with Z-GS or combined with DDP (B) and 5-FU(C). **P < 0.01 vs control group; ##P < 0.01 vs DDP alone, 5-FU alone. |
与对照组相比，30 μmol·L-1RFP明显上调HepG2细胞中PXR、P-gp蛋白表达，分别增加36.86%、132.33%;与Z-GS(30 μmol·L-1)联用后明显下调了RFP诱导的PXR和P-gp蛋白表达，分别降低57.47%、53.04%；40 μmol·L-1KTZ明显下调PXR、P-gp蛋白表达，分别减少51.77%、30.90%，与Z-GS(30 μmol·L-1)联用后，进一步下调KTZ抑制的PXR、P-gp蛋白表达，分别减少33.70%、41.00%(P < 0.05, Fig 7)。
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| Fig 7 PXR and P-gp were regulated by RFP or KTZ alone or combined with Z-GS in HepG2 cells (x±s, n=5) A, B: Representative Western blot of proteins and quantitated data from immunoblots treated by RFP(A) and KTZ(B) are shown.*P < 0.05, **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs RFP/30 μmol·L-1 (A) or KTZ/40 μmol·L-1 (B). |
目前，原发性肝癌居我国常见恶性肿瘤第4位，肿瘤致死病因第2位[2]。临床资料表明，肝切除术后5年复发率为60%~70%；全身治疗和经肝动脉介入治疗中使用的化疗药物耐药问题也亟需解决[14]。近几十年来，大量临床和实验研究表明，中药辅助治疗肿瘤是一种安全、有效的途径[8]。Z-GS是来源于中药没药的主要活性成分，其可通过调控PI3K/AKT、JAK/STAT和NF-κB等信号通路促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖[15]。本课题组前期研究发现，没药甾酮可通过抑制环氧酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)下调P-gp在人慢性髓源白血病细胞K562中表达，逆转K562对伊马替尼耐药[16]；还可下调耐阿霉素乳腺癌细胞MCF-7中P-gp表达，增强阿霉素对耐药细胞的增殖抑制作用[17]。
肿瘤多药耐药引起的化疗失败通常与肿瘤细胞中化疗药物浓度降低有关，而肿瘤细胞细胞膜上ABC家族转运子如P-gp/ABCB1/MDR1过表达是导致肿瘤多药耐药的重要因素[17]。P-gp表达受PXR调控，PXR由N端DNA结合域(DNA binding domain，DBD)和C端配体结合域(ligand binging domain，LBD)组成，DBD有两个锌指结构和核定位序列(A/G)G(T/G)TCA，与靶基因的启动子区域结合。PXR被激活前，和它的辅阻遏物结合并存在于细胞质，和配体结合后，PXR构象发生变化并且从与辅阻遏物的结合中游离出来，通过DBD的锌指与视黄醇X受体(retinoid X receptor，RXR)结合形成异二聚体，使异二聚体穿过核孔进入细胞核，这个过程中PXR还招募共激活物以和靶基因的启动子结合。PXR结合位点被MDR1基因上游增强子识别，然后开始MDR1基因转录[9]。本研究使用PXR诱导剂RFP和抑制剂KTZ初步证实了这一机制。
本研究结果表明，30μmol·L-1 Z-GS对肝癌细胞HepG2无细胞毒作用，与化疗药物5-FU、DDP联用，增强5-FU、DDP对HepG2细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用；进一步研究表明，Z-GS下调PXR/MDR1 mRNA-P-gp通路活性，增强化疗药物抗肝癌作用。Z-GS有望改善DDP、5-FU临床疗效，具有与化疗药物联合用于治疗HCC的前景，本文将为体内及临床研究提供理论基础。但没药甾酮是否对其他肝癌细胞系也有相似作用需进一步研究；没药甾酮是如何调控肝癌细胞中PXR/P-gp通路活性，尚需深入研究；同时，没药甾酮是否通过其他调控机制下调肝癌细胞中MDR1基因转录和P-gp表达也需进一步探索。
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