抑郁症是当今世界最严重的精神疾病之一，也是初级卫生保健中最常见的精神疾病，其特点之一就是显著持久的心情压抑、情绪低落。据世界卫生组织相关数据显示，目前全球抑郁症患者高达4.8%，并且患病人数还在不断上升。已有文献证明，心血管疾病、二型糖尿病、乳腺癌、帕金森病、焦虑症等疾病的发生都伴随着抑郁症的产生[1-3]。因此，深入研究抑郁症的发病机制及治疗对策是生命科学领域的研究热点之一。
氧化应激通过自由基、非自由基分子、活性氧等多种物质参与抑郁症的发生发展[4]。抑郁症常伴有氧化应激失调，如总抗氧化能力异常、氧化损伤和自身免疫反应产物等[5]。此外，研究发现抑郁症患者皮质线粒体能量产生减少，葡萄糖类似物摄取减少，提示抑郁症的发生与能量缺陷和糖代谢异常密切相关[6]。解偶联蛋白家族新成员-解偶联蛋白2(uncoupling protein 2，UCP2)普遍存在于心脏、大脑等多种组织中，可通过抑制氧化应激发挥细胞保护作用[7]。UCP2是一种线粒体负离子载体蛋白，具有调节能量代谢的作用[8]。因此，UCP2有可能是一个有效预防和治疗抑郁症的药物作用靶点。
目前，临床上常用的抗抑郁症药物均能增加突触间单胺类神经递质作用，如丙咪嗪、氟西汀等。但是，这些药物或多或少存在一些不良反应，并且部分重性抑郁症患者在一定剂量和时间内对抗抑郁症药物没有反应。因此，寻找起效快、副作用小的抗抑郁症活性先导物是非常必需的。薯蓣皂苷(dioscin，DIO)是一种天然甾体皂苷类化合物，存在于穿龙薯蓣、山药等多种药用植物中。近年来研究表明，薯蓣皂苷通过调控炎症、氧化应激、细胞凋亡等保护器官损伤，对糖尿病、肥胖等代谢性疾病也有调节作用[9-10]。但是，目前未见薯蓣皂苷抗抑郁作用的相关报道。因此，本研究通过构建慢性不可预知温和应激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)小鼠抑郁模型来探讨薯蓣皂苷抗抑郁的药理学作用及可能的分子机制。
1 材料 1.1 实验动物♂ SPF级C57BL/6J小鼠, 体质量(20±2)g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，合格证号：SCXK(辽)2015-0001。所有动物实验程序均按照相关实验动物使用与护理条例进行，经大连医科大学动物伦理与使用委员会批准。
1.2 药物与试剂薯蓣皂苷纯度≥98%(实验室自制)；氟西汀(fluoxetine, FLU)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：D1823052)；皮质酮(corticosterone, CORT)(批号：201903)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)(批号：201904)和5-羟色胺(5-hydroxytryptamin, 5-HT)(批号：201903)ELISA试剂盒(江苏酶免实业有限公司)；丙二醛(malondialdehyde, MDA)(批号：20190616)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)(批号：20190713)和过氧化氢酶(catalase, CAT)(批号：20190612)试剂盒(南京建成生物技术公司)；组织蛋白提取试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司，批号：20180906)；一抗UCP2、GLUT1、G6Pase、Nrf2、SOD2及二抗(HRP-GOAT anti-Rabbit)(武汉三鹰生物技术有限公司)；一抗β-actin(北京博奥森生物科技有限公司)。
1.3 实验仪器旷场实验装置、强迫游泳实验装置、悬尾实验装置(上海欣软信息科技有限公司)；PMOD 3.4软件(PMOD Technology，Switzerland)；酶标仪(Thermo，USA)；U-3010紫外可见分光光度计(HITACHI，Japan)；TE2000-U显微镜(Nikon, Japan)；DYCZ-40D转印电泳仪(北京市六一仪器厂)；UVP凝胶成像系统(BioSpectrum系列，USA)。
2 方法 2.1 造模CUMS法造模参照文献方法[11]并根据实验条件进行改良：禁食24 h、禁水24 h、昼夜颠倒24 h、潮湿垫料24 h(100 g垫料加200 mL水)、抽离垫料24 h、鼠笼45°倾斜24 h、水平振荡5 min、冰水浴4 ℃游泳5 min、温水浴45 ℃游泳5 min、夹尾1 min、束缚(50 mL塑料离心管中)2 h。每周随机选择7种刺激方式，同一种刺激不得连续出现，连续造模4周。正常组(Control)和DIO对照组(DIO Control)常规饲养，不给予任何刺激。
2.2 分组与给药将造模成功的小鼠随机均分为模型(Model)组、薯蓣皂苷低、中、高剂量组(20、40、80 mg·kg-1 DIO)以及阳性药组(20 mg·kg-1 FLU)，灌胃给药4周，同时进行CUMS操作。正常组和模型组给予等量的羧甲基纤维素钠(sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na)溶液，DIO对照组给予高剂量薯蓣皂苷(80 mg·kg-1 DIO)。
2.3 行为学测试实验开始前小鼠先进行48 h糖水适应过程，计算糖水偏好/%=蔗糖用量/(蔗糖用量+普通水用量)×100%。将小鼠置于装有25 ℃普通水的透明圆柱体内(高20 cm、直径12 cm)6 min，记录最后4 min小鼠静止时间。将小鼠尾巴用胶带固定，头部朝下6 min，记录最后4 min小鼠静止时间。将小鼠随机置于底部分为5×5方格的黑笔白底敞箱内，记录小鼠5 min的行动轨迹，并进行数据分析。
2.4 ELISA检测小鼠眼球取血，血液放置30 min后离心(3 500 r·min-1) 10 min后取其上清，-80 ℃储存，备用。小鼠断头取脑置于冰盒上，快速分离出完整的脑组织，并将位于脑组织皮层下方的八字形白色组织即海马组织分离，海马组织和剩余脑组织分别储存在-80 ℃(每组随机保留两颗完整脑组织用于组织病理学检测)备用。血清CORT、海马组织BDNF和5-HT含量经ELISA法检测。
2.5 氧化应激指标检测取“2.4”所得血清和剩余脑组织，按照试剂盒说明书检测血清MDA、SOD和剩余脑组织CAT含量。
2.6 组织病理学检查将完整的脑组织置于10%甲醛溶液中浸泡固定，制成蜡块并切成5 μm的薄片，按照HE和Nissl方法染色，最后置光学显微镜下观察。
2.7 正电子发射计算机断层显像(PET)实验小鼠禁食12 h，通过鼻锥吸入含1.5%异氟醚和98.5%氧气的混合气体(流速1 L·min-1)麻醉。尾静脉1次性注射14.8~18.5 MBq 18F-fluorodeoxyglucose(18F-FDG)示踪剂200 μL，室温45 min后进行扫描[12]，并对其结果进行数据分析。
2.8 Western blot分析取适量剩余脑组织，按照组织蛋白提取试剂盒说明书提取总蛋白；总蛋白浓度经BCA蛋白浓度测定试剂盒测定后，PBS溶液拉平浓度，2×loading buffer(100 μL+4 μL β-巯基乙醇)进行变性；配制适当比例的SDS-PAGE凝胶进行电泳后，采用湿转转膜法进行转膜，5%的脱脂牛奶封闭, 室温2 h，然后放入一抗中孵育, 4 ℃过夜；次日，PVDF膜用TTBS洗涤后放入对应的二抗中孵育, 室温2 h，然后按照ECL发光试剂盒的操作说明，观察并拍照。图像分析采用Gel-Pro Analyzer专业图像分析软件。
2.9 统计学分析本实验数据均采用平均数±标准差(x±s)表示，两组之间的数据均采用t检验，多组间的数据均使用One-Way ANOVA方差分析。
3 结果 3.1 薯蓣皂苷对抑郁小鼠行为的影响如Fig 1A所示，与模型组相比，薯蓣皂苷或氟西汀给药后明显提高抑郁小鼠的糖水偏好(P＜0.05)，改善抑郁小鼠的快感缺失状态，其中80 mg·kg-1薯蓣皂苷效果最为明显(P＜0.01)。如Fig 1B-C所示，与模型组相比，薯蓣皂苷给药后抑郁小鼠在强迫游泳实验和悬尾实验中的不动时间分别由(173.2±8.326) s、(162.6±6.575) s降低至(101.9±11.25) s、(97.38±11.13) s，显著改善抑郁小鼠的绝望行为(P＜0.01)。在旷场试验中，薯蓣皂苷给药后明显增加抑郁小鼠在中心区域的活动距离(P＜0.05)，改善抑郁小鼠的焦虑行为(Fig 1D-E)。
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| Fig 1 Effects of DIO on behavior of depressed mice A: SPT; B: FST; C: TST; D-E: OPT. ##P < 0.01 vs Control; *P < 0.05, **P < 0.01 vs Model. |
如Fig 2A所示，与对照组相比，模型组小鼠血清CORT含量由(110.9±4.959) μg·L-1增加至(152.2±12.28) μg·L-1，薯蓣皂苷给药后降至(123.3±5.543) μg·L-1。与对照组相比，模型组小鼠海马组织内BDNF和5-HT含量分别由(5.777±0.176) ng·鲜重(g)-1、(1.591±0.053) μg·鲜重(g)-1降至(4.963±0.092) ng·鲜重(g)-1、(1.215±0.043) μg·鲜重(g)-1；与模型组相比，薯蓣皂苷给药后小鼠海马组织内BDNF和5-HT含量分别增加至(5.404±0.184) ng·鲜重(g)-1、(1.429±0.062) μg·鲜重(g)-1(Fig 2B-C)。
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| Fig 2 DIO improved levels of CORT, BDNF and 5-HT of depressed mice A: CORT in serum; B: BDNF in hippocampus; C: 5-HT in hippocampus. ##P < 0.01 vs Control; *P < 0.05, **P < 0.01 vs Model. |
Fig 3A表明，与对照组相比，模型组小鼠血清中MDA含量由(4.810±0.519 5) μmol·L-1升高至(17.49±1.569) μmol·L-1；与模型组相比，薯蓣皂苷或氟西汀给药后明显降低MDA含量。如Fig 3B-C所示，模型组小鼠血清中SOD和脑组织中CAT的含量相对于对照组明显降低(P＜0.01)，薯蓣皂苷给药后SOD和CAT的含量分别增加至对照组水平。
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| Fig 3 Effects of DIO on levels of MDA, SOD and CAT of depressed mice A: MDA in serum; B: SOD in serum; C: CAT in brain tissue. ##P < 0.01 vs Control; *P < 0.05, **P < 0.01 vs Model. |
由HE染色结果可知，模型组小鼠脑组织海马CA1区出现部分脂肪变性，而薯蓣皂苷或氟西汀给药能改善此症状(Fig 4A)。Nissl染色结果如Fig 4B所示，模型组小鼠大脑皮层(Cortex)神经元胞质染色浅，海马CA1区神经元排列紊乱、松散；不同剂量薯蓣皂苷或氟西汀给药后，小鼠大脑皮层神经元胞质染色变深，海马CA1神经元排列相对有序。
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| Fig 4 Effects of DIO on histopathology of brain tissues of depressed mice A: HE of CA1; B: Nissl of cortex and CA1. |
对小鼠大脑各区域18F-FDG的标准摄取值(SUV)进行统计，与对照组相比，抑郁小鼠海马、杏仁体、纹状体、下丘脑和中脑区域SUV值明显降低(P＜0.05)，薯蓣皂苷给药后这些区域的SUV值明显上升(P＜0.05) (Fig 5)。
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| Fig 5 Changes of SUV values (B) in various brain regions of depressed mice A: Hippocampus; B: Striatm; C: Amygdala; D: Midbrain; E: Inferior_Colliculi. #P < 0.05, ##P < 0.01 vs Control; *P < 0.05, **P < 0.01 vs Model. |
如Fig 6A所示，与对照组相比，模型组小鼠脑组织内UCP2蛋白表达水平降低了6.2倍；薯蓣皂苷给药后UCP2蛋白表达水平增加至模型组的3.8倍。Fig 6B结果显示，与模型组相比，薯蓣皂苷给药后Nrf2和SOD2蛋白表达水平分别增加9.0倍和1.3倍。Fig 6C结果显示，与对照组相比，模型组小鼠脑组织内GLUT1和G6Pase蛋白表达水平分别增加1.5倍和2.7倍；薯蓣皂苷给药后GLUT1和G6Pase蛋白表达水平分别降低下调至模型组的0.17倍和0.14倍。
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| Fig 6 Effects of DIO on UCP2 signaling pathway in brain tissues of depressed mice A: The expression level of UCP2; B: The expression levels of Nrf2 and SOD; C: The expression levels of GLUT1 and G6Pase. ##P < 0.01 vs Control; *P < 0.05, **P < 0.01 vs Model. |
抑郁症的患病率和死亡率伴随着人们的心理压力和精神压力的增加而增加。CUMS模型模拟了人们在日常生活所遭遇的不良环境，具有重复性、有效性、连续性等特点[13]。临床上对于抑郁症的治疗方法多样，但药物治疗一直是最主要手段。因此，寻找新的抗抑郁活性先导物是必不可缺的。
薯蓣皂苷通过提高海马区5-HT水平，增强血清素能系统产生抗抑郁作用[14]。研究证明百合地黄汤有抗抑郁作用，其有效成分之一就是薯蓣皂苷[15]。本研究发现，薯蓣皂苷可以显著改善抑郁小鼠的抑郁样行为，也能提高抑郁小鼠海马组织内BDNF和5-HT含量，降低血清CORT含量，对抑郁小鼠大脑的病理状态也有改善作用。
细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS) 的主要来源是线粒体，而在线粒体内膜发现的解偶联蛋白(UCP)中，UCP2表达最为广泛，并在控制细胞ROS的产生中发挥关键作用[16]。研究发现UCP2的缺失可能促进ROS的积累，从而诱导氧化损伤[17]。除此之外，UCP2及其控制产生的ROS与下丘脑神经元群的活动有关，这些神经元群参与能量和葡萄糖稳态的控制[8]。研究发现，氧化应激和能量代谢在抑郁症的发生发展中占据着举足轻重的作用[17-18]。本课题组前期已有研究证明, 薯蓣皂苷能通过氧化应激和能量代谢过程调整多种疾病，如心血管疾病、非酒精性脂肪肝、二型糖尿病等。本研究发现，薯蓣皂苷明显降低抑郁小鼠血清中MDA含量，显著升高抑郁小鼠血清中SOD含量和脑组织中CAT含量。同时，薯蓣皂苷能改善抑郁小鼠大脑能量代谢，明显增加抑郁小鼠脑组织UCP2、Nrf2、SOD2和G6Pase蛋白的表达，降低GLUT1蛋白的表达。因此，薯蓣皂苷发挥抗抑郁作用可能与其参与氧化应激和能量代谢的过程有关。
综上，薯蓣皂苷能改善由CUMS诱导的小鼠抑郁样行为，发挥抗抑郁作用，此过程可能是通过UCP2介导的氧化应激和能量代谢过程进行的。
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