心脏缺血/再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury，IRI)，常见于心肌梗死、心肺复苏、冠脉介入治疗、体外循环下心血管大手术等，长期缺血心肌在恢复血流灌注的同时，可能导致心肌损伤进一步加重，发生再灌注心律失常、心脏功能障碍，甚至心力衰竭[1-2]。尽管目前已有大量基础与临床研究探讨缺血后心肌的保护策略与机制，但心肌IRI的分子机制仍未完全明确。溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid, LPA)是细胞膜磷脂代谢的中间产物，也可由活化的血小板释放产生，可在组织损伤或坏死过程中大量释放[3]。已有研究表明，动脉粥样硬化、急性冠脉综合征、心肌梗死等患者血浆和局部心肌组织中LPA水平显著升高[4-6]，提示LPA与心肌缺血后损伤密切相关。然而，LPA在心肌IRI中发挥何种作用，目前尚不清楚。
Langendorff装置采用主动脉逆行灌注，灌流时主动脉中逆向灌流液可关闭主动脉瓣，逆行灌流含氧的K-H液，由冠状动脉灌流心肌，灌流液经冠状静脉窦从右心房、肺动脉和腔静脉断端流出。利用主动脉逆向插管技术灌流动物离体心脏的实验，一直是对心脏功能进行生理、药理学研究的重要手段，本方法排除了神经和体液的控制，可直接观察药物或其他干预措施对心脏功能和冠脉流量的影响[7]。本研究利用Langendorff装置进行离体心脏主动脉逆行灌注，通过停止灌流和恢复灌流含氧K-H液，模拟心脏的缺血/再灌注过程[8]，探讨LPA对离体心脏缺血/再灌注损伤的影响。
1 材料 1.1 实验动物♂ C57BL/6小鼠，SPF级，10周左右，体质量(20~25)g，购买于苏州工业园区爱尔麦特科技有限公司，许可证号：SYXK(苏)2019-007。小鼠分笼饲养，可自由饮水及摄食，饲养环境温度保持在(21~25)℃。
1.2 药物与试剂溶血磷脂酸(LPA)(批号：857130，Sigma公司，美国)，HA130(批号：28770，MCE，中国)，氯化三苯基四氮唑(TTC)(批号：BCCD7384，Sigma公司，美国)，LPA ELISA检测试剂盒(批号：OKCD02274，AVIVA SYSTEMS BIOLOGY)，乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(批号：20210309，南京建成生物工程研究所，中国)。TRPV1批号：(455-8JD-08，NeuroMab，美国)，Phospho-TRPV1(批号：3119CA25，Thermo Fisher scientific，美国)，Bcl-2(批号：GR249198-85，abcam，美国), Bax(批号：11，Cell Signaling Technology，美国)。
1.3 实验设备离体心脏Langendorff灌流系统，Power Lab信号采集系统(AD公司，澳大利亚)，全自动酶标仪设备及技术(Tecan M1000，瑞士)；Western blot电泳、转膜设备(Bio-Rad，美国)及自动凝胶成像系统(上海天能)，体式显微镜(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，动物保温系统(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)。
1.4 K-H液的配制氯化钠(NaCl，120 mmol·L-1)、氯化钾(KCl，4.5 mmol·L-1)、氯化钙(CaCl2，1.25 mmol·L-1)、氯化镁(MgCl2.6H2O，1.2 mmol·L-1)、磷酸二氢钾(KH2PO4，1.2 mmol·L-1)、碳酸氢钠(NaHCO3，20 mmol·L-1)、无水葡萄糖(C6H12O6，10 mmol·L-1)。配制时氯化钙及葡萄糖分别单独用纯水溶解，其他溶质用纯水充分溶解后，将氯化钙溶液逐滴加入，葡萄糖溶液在临用前配置并加入，配置好的溶液经微孔滤膜过滤后使用，并预留100 mL放入4 ℃冰箱备用，使用前要将K-H液预充氧10 min。
1.5 离体心脏的制备及缺血/再灌注损伤模型的建立分离心脏前10 min，腹腔注射肝素10 IU·g-1，稍后腹腔注射2%戊巴比妥钠50 mg·kg-1，迅速断头处死，取出心脏，置于冰水混合K-H液中，在显微镜下进行主动脉插管，插管成功后立即悬挂于Langendorff灌注架上，逆行灌注K-H液，K-H液用95% O2和5% CO2混合气进行预充平衡10 min，维持K-H液pH值7.35~7.45，灌注压力为10.64 kPa，温度37 ℃。操作完成后，待心脏稳定后继续灌注10 min，然后停止灌注30 min，再灌注60 min，即成功建立离体心脏缺血/再灌注损伤模型。
1.6 实验分组将C57小鼠随机分为4组，每组6只。Sham组心脏持续灌注100 min；IR组心脏稳定10 min，然后停止灌注30 min，再灌注60 min；IR+LPA组在缺血前和再灌注时分别给予含10 μmol·L-1外源性LPA的K-H液进行灌注10 min；HA130组麻醉前10 min腹腔注射1 μmol·L-1·g-1，然后进行IR。
1.7 心肌梗死体积测定每组各6只小鼠再灌注结束后取下心脏，放入-80 ℃冰箱冻20 min，将心脏取出置于小鼠心脏模具中，迅速切片，厚度为1 mm，每个心脏切5~6片，置于1%TTC溶液中，37 ℃(pH值7.4)孵育15 min后，放入4%多聚甲醛中浸泡固定12 h，然后进行扫描。ImageJ软件计算全心体积与梗死区体积之比。
1.8 冠脉流出液中LDH浓度测定每个心脏分别留取基线(T0)、停止灌注即刻(T1)、再灌注即刻(T2)、再灌注10 min(T3)、再灌注30 min (T4)、再灌注60 min(T5)6个时间点的冠脉流出液0.5 mL，使用乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒测量冠脉流出液中LDH水平。
1.9 血清及冠脉流出液中LPA浓度测定于再灌注即刻留取冠脉流出液0.5 mL置于-80 ℃保存，ELISA法测定冠脉流出液中LPA浓度；腹腔注射HA130后眼球取血0.5 mL，置离心机中12 000 r·min-1转速离心10 min，取上清液置于-80 ℃保存，ELISA法测定血清LPA浓度。
1.10 Western blot每组3只小鼠在再灌注结束后，取下心脏，预冷PBS冲洗。将心脏剪碎，使用匀浆机将心脏打成匀浆，加入裂解液后冰上裂解。充分裂解1 h后将匀浆液12 000 r·min-1的速度离心30 min，取上清液置于-80 ℃保存备用。BCA蛋白定量试剂盒测定570 nm处OD值进行蛋白定量。取适量上清液按1 ∶4加入上样缓冲液，100 ℃加热15 min。待冷却后对蛋白质进行12%SDS-PAGE凝胶电泳浓缩胶80 V, 30 min，分离胶120 V, 80 min。随后转移至PVDF膜上200 mA恒流, 120 min。用5%脱脂牛奶在室温下封闭2 h。加入TRPV1(1 ∶1 000)、pTRPV1(1 ∶1 000)、Bcl-2(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶1 000)一抗4 ℃摇床孵育过夜。TBST洗涤3次，每次10 min，二抗采用山羊抗兔IgG(1 ∶10 000)或山羊抗小鼠IgG(1 ∶10 000)室温孵育60 min，TBST洗涤4次，每次10 min，采用化学发光法ECL显影，凝胶成像系统拍照，ImageJ软件计算蛋白条带灰度值。
1.11 统计学分析采用Prism 8.0软件进行统计学分析，正态分布的计量资料用x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Tukey检验，重复测量设计资料采用重复测量设计的方差分析。变量之间的相关性采用Pearson分布进行分析。
2 结果 2.1 心肌梗死体积与Sham组相比，IR组心肌组织梗死体积增加(P < 0.05, Fig 1)；与IR组相比，加入外源性LPA后心肌组织梗死体积增大(P < 0.05, Fig 1)；与IR组相比，给与LPA合成抑制剂HA130后，心肌组织心肌梗死体积减小(P < 0.05, Fig 1)，表明LPA可能参与心肌缺血再灌注损伤。
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| Fig 1 Infarct Volume in each group (x±s, n=6) A: Representative photographs of TTC staining. The area infarct size (IS) was in white. B : Statistical analysis of infarct volume. *P < 0.05 vs Sham, #P < 0.05 vs IR. |
与Sham组相比，IR组冠脉流出液中的LPA含量增加(P < 0.05, Fig 2)，且与梗死体积呈线性相关，提示心脏缺血/再灌注损伤可诱导LPA释放增加；给与LPA合成抑制剂HA130后测量血清和冠脉流出液中LPA，均未测得结果，低于试剂盒检测范围(数据未显示)，说明HA130可以有效的抑制LPA的合成。
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| Fig 2 Level of LPA in coronary effluent after ischemia-reperfusion injury (x±s, n=6) A: LPA level in coronary effluent. B: The linear correlation between infarct volume and the level of LPA. *P < 0.05 vs Sham. |
与Sham组相比，IR组再灌注各个时间点冠脉流出液中LDH水平升高(P < 0.05, Fig 3)；与IR组相比，加入外源性LPA后再灌注各个时间点冠脉流出液中LPA水平继续上升(P < 0.05, Fig 3)；与IR组相比，给与LPA合成抑制剂HA130后再灌注后各个时间点冠脉流出液中LDH水平降低，表明LPA能够加重心肌缺血/再灌注损伤，抑制缺血和再灌注过程中的LPA释放能够减轻心肌缺血/再灌注损伤。
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| Fig 3 Level of LDH in coronary effluent at different time points (x±s, n=6) T0: Baseline, T1: The onset of ischemia, T2: The onset of reperfusion, T3: 10 min after reperfusion, T4: 30 min after reperfusion, T5: The end of reperfusion. *P < 0.05 vs Sham, #P < 0.05 vs IR. |
与Sham组相比，IR组心肌组织pTRPV1及TRPV1蛋白表达量增加，凋亡蛋白Bcl-2/Bax比值降低(P < 0.05, Fig 4)；与IR组相比，LPA组心肌组织pTRPV1及TRPV1蛋白表达均明显增加，Bcl-2/Bax比值进一步降低(P < 0.05, Fig 4)；与IR组相比，HA130组心肌组织pTRPV1及TRPV1蛋白水平降低，Bcl-2/Bax比值增加(P < 0.05, Fig 4)，表明LPA可影响缺血/再灌注过程中心脏TRPV1蛋白表达和凋亡信号。
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| Fig 4 The protein levels of pTRPV1, TRPV1 and Bcl-2/Bax in heart tissues (x±s, n=3) *P < 0.05 vs Sham, #P < 0.05 vs IR. |
心肌缺血/再灌注损伤严重影响患者的预后和生活质量，目前已有大量研究以IRI发生机制的不同环节为靶点，研究开发防治缺血后心肌损伤的方法，但目前临床上仍缺乏公认有效的心肌保护策略[10]。因此，深入研究和寻找新的特异性分子靶点，保护缺血心肌免受再灌注损伤，对于促进心肌组织修复、改善心肌缺血患者预后具有重要意义。
本研究中我们发现，缺血/再灌注损伤过程中LPA释放显著增加，且与心肌梗死体积呈线性相关，说明LPA可能参与心脏IRI。已有研究报道，不同类型的缺血性心脏病患者血浆中LPA水平均显著升高[4-6]，但升高的LPA对缺血后心肌发挥何种作用，目前仍不明确。我们发现当加入外源性LPA 10 μmol·L-1后，心肌梗死体积增大，说明LPA可直接作用于心脏，加重缺血后心肌损伤。LPA的生成依赖于自体趋化蛋白(autotaxin, ATX)，而HA130是一种选择性ATX抑制剂，静脉注射HA130可以迅速降低血浆中LPA水平[11]，本研究中提前腹腔注射HA130导致血清和冠脉流出液中的LPA水平均低于试剂盒检测下限(数据未显示)，同时小鼠心肌梗死体积和LDH水平均明显下降，说明抑制LPA的合成可以减轻缺血/再灌注损伤，发挥心肌保护作用。
研究发现心肌梗死后LPA水平升高可作用于心肌钙通道或钾通道，增加钙离子或钾离子内流，从而引发心律失常[6]，在氧化应激下LPA对心室肌细胞动作电位和钙内流的作用发生改变，进一步增加室性心律失常发生的风险[12]。Nieto-Posadas等[13]发现LPA可结合TRPV1受体C-末端特异性位点，激活TRPV1受体引起通道开放和神经元电流增强。TRPV1作为一种细胞应激感受器[14]，可感受缺氧、炎症、酸性环境、有害代谢产物等各种细胞外有害刺激，通道开放后大量钙、钠离子内流，继而激活下游信号通路。近年研究发现TRPV1在心血管系统中表达，如血管平滑肌细胞、血管内皮细胞、心肌细胞等，在动脉粥样硬化、高血压、心力衰竭、血管重塑等疾病中发挥重要作用，已成为心血管疾病防治和药物研发的重要靶点[15-17]。本研究发现心肌IRI可增加磷酸化和非磷酸化TRPV1蛋白表达，说明TRPV1的表达量和活性均增强，而加入外源性的LPA进一步增强TRPV1信号，相反HA130则可抑制TRPV1表达与活性，表明缺血/再灌注损伤过程中释放的LPA可能作用于TRPV1受体。凋亡蛋白Bcl-2/Bax比值可以反映心肌细胞凋亡情况，本研究中外源性LPA可降低Bcl-2/Bax比值，而HA130可逆转该比值的下降，进一步表明LPA可通过影响细胞凋亡参与心肌缺血再灌注损伤。
综上所述，小鼠离体心脏缺血再灌注诱导LPA释放增加，LPA水平升高可引起心肌梗死体积增加，心肌损伤加重，而抑制LPA的生成可明显减轻心肌缺血再灌注损伤，其机制可能与调控TRPV1受体表达及凋亡信号有关。
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