2. 安徽医科大学基础医学院药理学教研室，安徽 合肥 230032
2. Dept of Pharmacology, School of Basic Medical Sciences, Anhui Medical University, Hefei 230032, China
血管性痴呆(vascular dementia，VD)是指由多种脑血管疾病引起的脑部功能障碍, 进而产生获得性智能损伤的综合征[1]。研究证实, VD作为老年痴呆的第二大形式，大约占痴呆性疾病总发生例数的20%~30%[2-3]。伴随人口老龄化的加剧，我国VD痴呆已经逐渐成为老年性痴呆的最主要类型[4]。研究表明, 导致VD的主要因素为脑血管病变，如小血管病变、大动脉病变等。脑血管病变会进一步引起控制学习、记忆功能的海马神经元缺血，进而导致神经元损伤和细胞凋亡，并最终引起痴呆[5-6]。但是, 目前临床上有关VD的治疗十分有限，而中医药以独特的诊疗理论与方法可以通过多途径、多靶点的方式在防治VD中发挥巨大潜力。丹参酮B(tanshinone B，TSB)是我国传统中药丹参的脂溶性成分代表物质之一，其具有广泛的药理学活性，包括改善微血管循环、清除氧自由基、抗癌以及保护血管内皮细胞等，已经成为研究热点[7]。既往研究表明TSB在中风性大鼠、VD性小鼠中能够改善认知功能障碍，发挥神经功能保护作用[8-9]。在VD小鼠中丹参酮ⅡA能够通过抑制大脑皮质氧化应激，调控兴奋性氨基酸和抑制性氨基酸含量，从而改善认知功能障碍。但是目前有关TSB对VD小鼠认知功能障碍的分子机制尚不完全清楚。因此，本研究将通过双侧颈总动脉缩窄法构建VD小鼠模型，阐明LRP6/Wnt1/β-catenin信号通路在VD中的作用及TSB的调控机制。
1 材料与方法 1.1 实验动物雄性C57BL/6小鼠，体质量(20~22)g，周龄6~8周，动物由安徽医科大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(皖)2017-001，该实验通过了动物实验医学伦理委员会批准。
1.2 药物与试剂丹参酮B(西安冠宇生物技术有限公司，纯度≥98，批号：112246-15-8)；盐酸多奈哌齐(donepezil，DP)粉末(SELLECK公司，纯度≥99，批号：120011-70-3)；苏木精-伊红(hematoxylin and eosin staining，HE)染色液(碧云天生物技术公司，批号：C0105S)；MDA、SOD以及GSH-Px测定试剂盒(南京建成生物工程共公司)；p-LRP6兔单克隆抗体(美国Cell Signaling Technology，批号：5583)；LRP6兔单克隆抗体(美国Cell Signaling Technology，批号：14220)；Wnt1小鼠单克隆抗体(美国Cell Signaling Technology，批号：15071)；β-catenin小鼠单克隆抗体(美国Cell Signaling Technology，批号：89477)；β-actin小鼠单克隆抗体(江苏碧云天生物技术公司，批号：5174)；一抗、二抗稀释液(江苏碧云天生物技术公司，批号：P0023A-100ml)；山羊抗小鼠(江苏碧云天生物技术公司，批号：A0286)；山羊抗兔(江苏碧云天生物技术公司，批号：A0277)；极超敏ECL发光试剂盒(江苏碧云天生物技术公司，批号：P0018FS)。
1.3 仪器G22-W型高速离心机(湖南湘仪实验室仪器有限公司)；SuPerMax 3000FA型多功能酶标仪(Thermo赛默飞世尔)；M371450型组织涡旋仪(武汉维塞尔生物科技有限公司)；TC-XDS-500C型荧光倒置显微镜(日本/奥林巴斯Olympus)；Western blot检测装置(美国Bio-Rad伯乐公司)；GoodLook-1000型成像系统(美国Bio-Rad伯乐公司)。
1.4 动物分组与处理60只雄性C57BL/6小鼠，按照随机数字表法分为对照组(Control组)、血管性痴呆模型组(VD组)、丹参酮B低剂量组(TSB 2 mg·kg-1)、丹参酮B中剂量组(TSB 4 mg·kg-1)、丹参酮B高剂量组(TSB 8 mg·kg-1)以及阳性药物组(盐酸多奈哌齐1 mg·kg-1)，每组各10只。采用小鼠双侧颈总动脉缩窄法构建VD模型[10]待造模成功10 d后，其中丹参酮低、中、高剂量组腹腔注射丹参酮B，阳性药物组腹腔注射盐酸多奈哌齐，每日1次，Control组以及VD组小鼠腹腔注射等量生理盐水，共计20 d。
1.5 Morris水迷宫行为学实验各组雄性C57BL/6小鼠于给药处理20 d后，采用Morris水迷宫实验检测小鼠的空间记忆能力。(1)定位航行实验：各组小鼠在第一象限入点处面向放入水中，实验记录在120 s内各组小鼠成功寻找并爬上平台的时间长短，即为逃避潜伏期，之后分别从其他3个象限入口处放入水中，持续训练5 d；(2)空间探索实验：在实验的d 6时，撤去平台，并将小鼠在第一象限入点处面向放入水中，记录小鼠60 s内的运动轨迹，计算各组小鼠通过目标象限的次数以及小鼠在原平台游泳时间占总游泳时间的比值大小。
1.6 MDA含量、SOD、GSH-Px活性测定将各组小鼠断头处理后快速去除全脑组织，在冰上分离大脑皮层以及海马组织，组织碾磨，BCA测定蛋白浓度并定量，按照各自试剂盒说明操作。
1.7 HE染色观察海马组织病理学形态各组小鼠乙醚麻醉后，迅速采用断头取脑，摘取视交叉至漏斗柄的脑片，采用4%的多聚甲醛固定各组小鼠海马组织，脱水、透明、包埋、石蜡切片，并按照HE染色试剂盒进行海马组织染色，显微镜下观察各组小鼠海马组织形态学变化。
1.8 Western blot实验检测海马组织p-LRP6、Wnt1以及β-catenin蛋白表达取各组小鼠海马组织，组织碾磨，裂解；BCA法测定蛋白质浓度；凝胶电泳；湿转转膜；上样；用5%脱脂牛奶室温封闭2 h，孵育对应p-LRP6兔单克隆抗体(1 ∶1 000)，LRP6兔单克隆抗体(1 ∶1 000)，Wnt1小鼠单克隆抗体(1 ∶1 000)、β-catenin小鼠单克隆抗体(1 ∶1 000)以及β-actin小鼠单克隆抗体(1 ∶2 000)，4 ℃过夜，孵育对应的山羊抗小鼠二抗或者山羊抗兔二抗((1 ∶5 000)1~2 h，；摇床摇晃上加TPBS洗涤3次，5 min/次，然后加入显影液，显影并拍照。p-LRP6、LRP6、Wnt1和β-catenin蛋白表达表达水平以目的蛋白条带灰度值与β-actin灰度值相比反映。
1.9 统计学分析采用SPSS 20.0软件统计，结果以x±s表示，多组间比较采用单因素方差(One-way analysis of variance，ANOVA)分析，组间两两比较采用t检验。
2 结果 2.1 TSB对VD小鼠行为学的影响Morris水迷宫实验定位航行实验显示，与Control组小鼠相比，VD组小鼠定位航行的潜伏期明显延长(P < 0.01)。与VD组小鼠相比，TSB不同剂量组小鼠定位航行的潜伏期均不同程度性缩短(P < 0.05或P < 0.01)，表明TSB能够明显改善VD小鼠学习记忆功能(Fig 1)。Morris水迷宫实验探索实验显示，与Control组小鼠相比，VD组小鼠穿越平台次数、目标象限(第四象限)停留时间百分比均明显减少(P < 0.01)。与VD组小鼠相比，TSB组小鼠不同剂量组穿越平台次数、目标象限(第四象限)停留时间百分比均明显增加(P < 0.05或P < 0.01)(Fig 2)。
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| Fig 1 Effect of TSB on escape latency of mice (x±s, n=6) **P < 0.01 vs control, #P < 0.05, ##P < 0.01 vs VD. |
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| Fig 2 Effect of TSB on latency of mouse water maze space exploration experiment (x±s, n=6) **P < 0.01 vs control, #P < 0.05, ##P < 0.01 vs VD. |
与Control组相比，VD组小鼠大脑皮层和海马组织MDA含量明显增加(P < 0.01)，GSH-Px和SOD活性均明显降低(P < 0.01)。与VD组小鼠相比，TSB组小鼠大脑皮层和海马组织MDA含量明显降低(P < 0.05或P < 0.01)，GSH-Px和SOD活性均明显升高(P < 0.05或P < 0.01)，且呈剂量依赖性(Fig 3、Fig 4)。
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| Fig 3 Comparison of MDA content, SOD and GSH-Px activity in cerebral cortex of mice in each group (x±s, n=6) **P < 0.01 vs control.#P < 0.05, ##P < 0.01 vs VD. |
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| Fig 4 Comparison of MDA content, SOD and GSH-Px activity in hippocampus of mice in each group (x±s, n=6) **P < 0.01 vs control.#P < 0.05, ##P < 0.01 vs VD. |
与Control组相比，VD组小鼠海马齿状回处颗粒状细胞核明显固缩，CA1以及CA3区域海马神经元数量均明显减少，细胞排列紊乱、细胞大部分皱缩、部分神经元细胞核固缩、染色质出现明显聚集等。与VD组相比，TSB不同剂量组和DP组小鼠海马齿状回处、CA1以及CA3区病理性损伤明显减轻(Fig 5~Fig 7)。
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| Fig 5 Histopathological changes of hippocampal CA1 of mice in each group (HE, ×200) |
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| Fig 6 Histopathological changes of hippocampal CA3 of mice in each group (×200) |
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| Fig 7 Histopathological changes in hippocampal dentate gyrus of mice in each group (HE, ×200) |
与Control组相比，VD组小鼠海马组织p-LRP6、Wnt1以及β-catenin蛋白表达均明显下调(P < 0.01)。与VD组相比，TSB中剂量组小鼠海马组织p-LRP6、Wnt1蛋白表达明显上调(P < 0.05或P < 0.01)，β-catenin蛋白表达无差异(P>0.05)，TSB高剂量组以及DP组小鼠海马组织p-LRP6、Wnt1以及β-catenin蛋白表达均明显上调(P < 0.01)，TSB低剂量组小鼠海马组织p-LRP6、Wnt1以及β-catenin蛋白表达均无差异(P>0.05)(Fig 8)。
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| Fig 8 Effect of TSB on LRP6/Wnt1/β-catenin pathway related proteins in hippocampus of VD mice (x±s, n=6) A: The bands of p-LRP6, LRP6, Wnt1, β-catenin protein. B: Quantification of p-LRP6, LRP6, Wnt1, β-catenin protein.**P < 0.01 vs control, #P < 0.05, ##P < 0.01 vs VD. |
VD是脑血管损伤导致的认知功能障碍，主要表现为神经活动、语言、学习以及记忆能力的障碍。脑部血流长期灌流不足会导致中枢胆碱功能障碍、神经元氧化应激损伤是学习和记忆能力下降的重要原因[10]。因此，本研究首先通过双侧颈总动脉缩窄法构建VD小鼠模型。Morris实验结果显示与Control组相比，VD组小鼠定位航行的潜伏期明显延长、穿越平台次数、目标象限(第四象限)停留时间百分比均显著性减少；HE染色显示VD组小鼠海马齿状回处颗粒状细胞核明显固缩，CA1以及CA3区域海马神经元数量均明显减少，细胞排列紊乱、细胞大部分皱缩、部分神经元细胞核固缩、染色质出现明显聚集等。以上结果表明，双侧颈总动脉缩窄法构建VD小鼠模型构建成功，可用于后续药物疗效实验。
目前临床上有关VD患者的治疗主要有药物治疗和特殊方式治疗等。其中药物包括神经保护剂、脑组织代谢改善剂等，神经递质的替代治疗是特殊方式治疗的关键[11]。但是由于费用昂贵以及治疗疗效不佳使得患者依从性不高。因此，积极探寻有效的治疗药物对于改善VD患者的生活治疗尤为关键。TSB是丹参酮ⅡA的结构类似物，具有和丹参酮ⅡA相似的药理学活性。研究证实丹参酮ⅡA能够通过抑制VD小鼠氧化应激，降低脑组织炎症反应、抑制Caspase-3、促进Bcl-2表达降低海马神经元凋亡等途径发挥神经保护作用[12-13]。本研究通过VD小鼠腹腔注射不同剂量的TSB，观察其治疗效果，结果发现TSB能够缩短定位航行的潜伏期、增加穿越平台次数、目标象限(第四象限)停留时间百分比、减轻海马齿状回处、CA1以及CA3区病理性损伤。以上结果表明TSB对VD小鼠具有治疗效果。那么有关TSB是如何发挥VD小鼠的神经保护作呢？氧化应激性损伤在神经退行性病变中发挥重要作用。在脑部血流长期灌流不足时会导致MDA含量升高、SOD以及GSH-Px活性降低。本研究结果显示TSB能够降低VD小鼠大脑皮层和海马组织中MDA水平，增强SOD以及GSH-Px活性。Wnt信号通路在VD中发挥重要作用，参与调节神经元生长、发育、分化、氧化应激、凋亡以及增殖等。Wnt信号通路可以概括为经典信号通路、非经典信号通路。其中Wnt经典型号通路又被称为Wnt/β-catenin信号通路[14]。既往研究表明，在VD大鼠中，激活Wnt/β-catenin传导能够明显改善大鼠海马神经损伤[15]。另外在帕金森病大鼠模型中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白Wnt1、β-catenin表达下调，GSK-3β、p-GSK-3β蛋白表达上调，抑制Wnt1能够减轻MPP+诱导的PC12凋亡[16]。低密度脂蛋白受体相关蛋白6(low-density lipoprotein receptor-related protein6，LRP6)属于低密度脂蛋白受体超家族成员之一[17]。既往研究表明，电针治疗能够通过调节海马组织LRP6影响Wnt/β-catenin信号通路，减少细胞凋亡，从而促进海马神经细胞修复。本实验研究发现与VD组相比，TSB中、高剂量组小鼠海马组织p-LRP6蛋白表达明显升高。该研究结果表明TSB能够通过调控p-LRP6，激活Wnt/β-catenin信号通路改善VD小鼠认知功能障碍。
综上所述，本研究通过研究丹参酮B对血管性痴呆小鼠认知功能障碍的保护作用及其调控机制。结果显示TSB能够改善VD小鼠认知功能障碍，其机制可能与激活海马组织LRP6/Wnt1/β-catenin通路，进而抑制小鼠大脑皮层和海马神经元氧化应激有关。该研究结果将有助丰富VD的发生机制以及为其药物靶点治疗提供新的可能。
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