2. 南京医科大学第一附属医院康复医学中心，江苏 南京 210029;
3. 南京中医药大学第一临床医学院，江苏 南京 210046
2. Rehabilitation Medical Center, First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China;
3. The First School of Clinical Medicine, Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210046, China
自然杀伤(natural killer，NK)细胞为机体固有免疫系统的重要组成，其于不同微环境刺激下，呈现出的分化倾向不一[1]。IL-12可诱导其分化为NK1型细胞，其以CD45RO等表型特征，分泌INF-γ等细胞因子，以协调免疫应答。NK细胞NK2型分化，则可分泌大量IL-4、IL-5等Th2型细胞因子，介导变应性炎症反应[2-3]。多项研究显示，变应性疾病状态下，NK细胞可向病变部位募集，并发生NK2主导型活化，促进局部Th2型细胞因子的表达[4-5]，即NK细胞NK2型活化与变应性疾病发展密切关联。故探讨NK细胞异常活化机制，调控其功能紊乱，对变应性疾病的治疗具有重要价值。
线粒体为调控细胞各项生命活动的动力元件，其通过频繁融合、分裂动态变化维持内部功能稳态[6-7]。这一动态平衡机制涉及多种蛋白，其中Drp1为调控线粒体分裂的关键分子。细胞内Drp1过度活化，可于线粒体外膜大量募集，通过压缩外膜加速线粒体分裂，并触发活性氧(reactive oxygen species，ROS)大量内生，以此调控Ca2+稳态、吞噬、炎症反应、凋亡等细胞诸多生命活动[6]。近年研究显示，NK细胞NK2型活化伴随着线粒体动态变化的失衡，存在线粒体过度分裂现象[8]，但两者内在关联尚不明确。基于此，本研究拟以线粒体分裂抑制剂Mdivi-1，探讨重建NK细胞线粒体动态平衡对NK细胞异常活化的影响，并揭示NK细胞异常活化的内在机制。
1 材料 1.1 主要仪器Herocell 180型CO2培养箱(美国Thermo公司)、ELX800型酶标仪(美国BioTek)、ChemiDoc XRS型化学发光凝胶成像仪、Accuri C6型细胞仪(美国BD)、Lecia DMI 3000B型倒置荧光显微镜(德国Leica公司)、Lecia SP8型激光共聚焦显微镜(德国Leica公司)。
1.2 主要药品与试剂线粒体分裂抑制剂1(mitochondrial division inhibitor，Mdivi-1, M0199)购自美国Sigma-Aldrich公司，重组人胸腺基质淋巴细胞生成素(thymus stromal lymphopoietin，TSLP，300-62)购自美国PeproTech公司，α-MEM培养基(11900024)、马血清(16050122)、胎牛血清(10100147)、巯基乙醇(614272)购自美国Gibco公司，肌醇(A600536)、叶酸(A610466)、磷酸盐(phosphate buffer saline，PBS)缓冲液粉末(B040100)购自生工生物工程股份有限公司，ROS检测荧光探针-二氢乙啶(dihydroethidium，DHE)试剂盒(KGAF019)购自南京凯基生物科技发展有限公司，MitoTracker Green(40742ES50)购自上海翊圣生物科技有限公司、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA，ST025)、BCA蛋白定量试剂盒(P0012)购自上海碧云天生物技术有限公司，PVDF膜(IPVH00010)购自美国Millipore公司，IL-4(70-EK104-96)、IL-5(70-EK105-96)、IFN-γ(70-EK180-48)酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒均购自杭州联科生物技术股份有限公司，MnSOD兔多克隆抗体(ab13534)、Drp1兔单克隆抗体(ab184247)、β-actin兔多克隆抗体(ab8227)均购自英国Abcam公司，p-Drp1兔多克隆抗体(3455S)购自美国CST公司，HRP标记山羊抗兔IgG(A0208)购自上海碧云天生物技术有限公司。
1.3 实验细胞人恶性非霍奇金淋巴瘤患者的自然杀伤细胞(NK-92MI，GOY-ATCC-0016)购自上海谷研实业有限公司。以含12.5%胎牛血清、12.5%马血清、0.2 mmol·L-1肌醇、0.1 mmol·L-1巯基乙醇、0.02 mmol·L-1叶酸的α-MEM培养基，于37 ℃ CO2培养箱中培养。
2 方法 2.1 实验分组NK-92MI细胞分为空白组、TSLP组、1 μmol·L-1 Mdivi-1组、5 μmol·L-1 Mdivi-1组、10 μmol·L-1 Mdivi-1组。TLPS组细胞以20 μg·L-1 TSLP刺激24 h，诱导NK细胞NK2分化。Mdivi-1组以20 μg·L-1 TSLP联合相应浓度Mdivi-1孵育24 h。
2.2 上清细胞因子分析回收各组细胞上清，于500×g，4 ℃条件下离心10 min，获取上清。据ELISA试剂盒说明书，经标准样、待测样加样，震荡、洗涤，检测抗体、HRP标记的链霉亲和素、底物孵育后，以酶标仪进行双波长扫描，测定各组上清IL-4、IL-5、IFN-γ水平。
2.3 蛋白印迹分析回收细胞样本，经裂解、匀浆、静置、离心后，获取蛋白上清。BCA法测定蛋白浓度，调整终浓度，高温变性后-80 ℃冻存备用。取蛋白样品经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳并转移至PVDF膜上，5% BSA的TBST室温封闭后，分别加入以1% BSA稀释的IL-4、IFN-γ、p-JAK2、JAK2、p-STAT6、STAT6、β-actin抗体，4 ℃孵育过夜。次日孵育HRP标记山羊抗兔IgG。滴加ECL曝光液，以Bio-rad化学发光检测仪显影，拍照保存。图像以ImageJ软件分析。
2.4 细胞ROS检测离心收集处理后细胞，以含25 μmol·L-1 DHE的α-MEM培养基重悬，CO2培养箱中孵育1 h。离心，PBS洗涤，弃上清。500 μL PBS重悬，Accuri C6流式细胞仪检测荧光强度。
2.5 线粒体形态观察离心收集处理后细胞，以含37 ℃预热的100 nmol·L-1 MitoTracker Green α-MEM培养基，于CO2培养箱中孵育30 min。离心，PBS洗涤，弃上清。α-MEM培养基重悬，接种于激光共聚焦皿，激光共聚焦显微镜下拍照。
2.6 统计学方法所有实验数据采用Graphpad prism 7.0.1软件行统计学分析，各组数据均采用x±s表示，以单因素方差分析进行比较分析。
3 结果 3.1 Mdivi-1对NK-92MI细胞上清IL-4、IL-5、IFN-γ水平的影响NK细胞NK2型活化以表达、分泌IL-4、IL-5因子为特征，而IFN-γ则为NK细胞NK1活化标志性因子。如Fig 1所示，与对照组比较，TSLP组NK-92MI细胞上清中IL-4、IL-5水平明显升高，IFN-γ水平下调，差异具有统计学意义(P < 0.05)。与TSLP组比较，5、10 μmol·L-1 Mdivi-1组细胞上清IL-4、IL-5水平降低，10 μmol·L-1 Mdivi-1组IFN-γ浓度则有所回升，差异具有统计学意义(P < 0.05)。
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| Fig 1 Levels of IL-4, IL-5 and IFN-γ in supernatant of each group (x±s, n=3) *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs TSLP group. |
ROS为诸多变应性疾病的重要病理信号，调控着NK细胞功能状态[9-10]。如Fig 2、3所示，与对照组比较，TSLP组NK-92MI细胞ROS水平明显升高，差异具有统计学意义(P < 0.05)。与TSLP组对比，5、10 μmol·L-1 Mdivi-1组ROS水平降低，差异具有统计学意义(P < 0.05)。
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| Fig 2 DHE staining of NK-92MI cells in each group (x±s, n=3) A: Control; B: TSLP; C: 1 μmol·L-1 Mdivi-1;D: 5 μmol·L-1 Mdivi-1;E: 10 μmol·L-1 Mdivi-1; Scale bar=100 μm |
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| Fig 3 Flow cytometric quantitative analysis of DHE staining of NK-92MI cells in each group (x±s, n=4) **P < 0.01 vs control group; ##P < 0.01 vs TSLP group. |
线粒体过度分裂可触发ROS大量生成，为变应性炎症、免疫细胞功能紊乱的重要因素[6, 11]。如Fig 4所示，对照组NK-92MI细胞内线粒体主要呈长管状，散布于胞质。TSLP刺激后，NK-92MI细胞内大量圆球状线粒体生成。而Mdivi-1干预后，有效减少了TSLP刺激下球状线粒体的生成。
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| Fig 4 Mitochondrial morphology of each group by confocal fluorescence microscopy (x±s, n=5) **P < 0.01 vs control group; ##P < 0.01 vs TSLP group. Scale bar=10 μm. |
Drp1为调控线粒体分裂的关键因子，线粒体功能的紊乱伴随着氧化应激防御因子MnSOD表达的下调[7, 12]。如Fig 5所示，与对照组比较，TSLP组NK-92MI细胞p-Drp1水平明显上调，而MnSOD表达下降，差异具有统计学意义(P < 0.05)。而Mdivi-1干预后，有效逆转了上述分子表达变化，且该效应随着药物剂量上调呈增强趋势。
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| Fig 5 Expression of p-Drp1 and MnSOD in each group (x±s, n=3) A: Electrophoretogram of p-Drp1 and MnSOD in each group. B: Quantitative analysis of p-Drp1 and MnSOD expression. **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs TSLP group. |
线粒体为高度动态的网管状细胞器，其动态平衡机制调节着细胞系列生命活动，而与多种生理病理变化密切关联[6-7]。NK细胞是参与机体肿瘤免疫、变态反应等活动的重要细胞[5]。近年研究示，NK细胞功能紊乱，常伴随着线粒体功能的失常，以及线粒体过度分裂现象[8, 13]。然而粒体功能与NK细胞状态间是否存在关联尚不明确。本研究则立于“线粒体功能紊乱-细胞异常活化”这一视角，探讨NK细胞NK2活化的内部机理，为NK细胞异常活化机制及潜在干预靶点这一研究盲区提供参考。
NK细胞NK2型活化，释放IL-4、IL-5、IL-10等细胞因子，介导变应性炎症反应，参与变应性鼻炎、特应性皮炎、哮喘等疾病的发生发展[2, 14]。TSLP可有效诱导T细胞Th2型分化、NK细胞NK2活化，为加剧体内外变应性炎症反应的重要分子[15]。研究显示，TSLP刺激后，NK-92MI细胞上清中IL-4、IL-5水平显著升高，IFN-γ水平下调，符合NK细胞NK2型活化表征。而5、10 μmol·L-1 Mdivi-1干预后，细胞上清IL-4、IL-5水平下调，IFN-γ浓度亦有所回升，提示Mdivi-1能有效抑制TSLP刺激所诱导的NK细胞Th2反应相关因子的分泌。
Mdivi-1为调节Drp1活性以特异性逆转线粒体分裂事件的化学分子[16]。近年来，Mdivi-1已广泛运用于线粒体动态变化与肿瘤、神经退行性、心血管疾病等关联的探索之中[16-17]。线粒体荧光探针MitoTracker染色示，TSLP刺激后，大量球状线粒体分布于NK细胞胞质内，提示线粒体分裂亢进，这一现象与其他其他文献报道相符[6, 8]。而Mdivi-1干预后，TSLP诱导下NK细胞线粒体过度分裂现象得到显著改善，其线粒体长度亦有所回归。蛋白印迹分析示，Mdivi-1干预可有效抑制NK细胞异常活化状态下线粒体分裂调控因子Drp1的活化。提示Mdivi-1抗NK细胞NK2型活化作用可能与其抑制线粒体过度分裂，重建线粒体动态平衡相关。
线粒体过度分裂可触发大量内生ROS的生成[6]，而后者与T、B、NK细胞等异常活化密切关联[9, 18]。DHE染色及流式分析显示，TSLP刺激下NK细胞内生ROS水平明显升高。而Mdivi-1干预则能有效下调TSLP刺激下NK细胞ROS内生，且该效应与Mdivi-1浓度呈正相关态势。同时，蛋白印迹分析亦显示，TSLP刺激下NK细胞MnSOD这一氧化应激防御因子表达的下调，亦于Mdivi-1干预后得到一定程度逆转。综上，Mdivi-1调节NK细胞ROS水平，可能是其抑制线粒体分裂以改善NK细胞NK2型活化的效应环节之一。
本次试验存在一些问题：(1)鉴于原代NK细胞培养难度较大，本研究以NK92MI细胞株作为实验对象，研究结果可能存在一定偏倚；(2)本研究未能选择Drp1基因沉默技术调节线粒体分裂，从抑制剂及基因敲降两个层面同步验证实验结果；(3)Mdivi-1抑制线粒体分裂后，具体通过哪些分子机制链影响NK细胞分化未进一步深入探索，这是我们下一步研究的重要方向。
综上，通过Mdivi-1抑制线粒体过度分裂，重建线粒体动态变化，可有效抑制TSLP刺激下NK细胞NK2型活化。线粒体动态失衡是NK细胞异常活化的内在机制之一，其可能为改善NK细胞NK2型活化介导的变应性炎症反应的重要靶点。
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