缺血性脑卒中临床常用的治疗手段是血管内溶栓[1]，但是脑组织恢复血流灌注后常发生缺血/再灌注(ischemia-reperfusion，IR)损伤。脑IR损伤可以导致细胞水肿、坏死，其发病机制复杂，包括自由基增多、炎症反应、钙超载、自噬等[2]。AMPK是以上机制的交叉口，可被多种因素激活，活化的AMPK可启动AMPK/mTOR/ULK1信号通路，从而激活细胞自噬[3]。多项研究表明补阳还五汤可通过调控自噬发挥抗脑IR损伤作用[4-7]，但对于补阳还五汤是否可通过AMPK/mTOR/ULK1自噬信号通路发挥神经保护作用尚未见相关报道。本课题组经离体实验表明，补阳还五汤可通过该自噬信号通路减轻大鼠原代神经元缺氧缺糖/复氧复糖损伤；本研究基于AMPK/mTOR/ULK1自噬信号通路，探讨补阳还五汤抗大鼠脑IR损伤的机制。
1 材料 1.1 实验动物48只SPF级SD大鼠，♂，体质量(250-280) g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司(许可证号：SCXK(京)2016-0006)，饲养时温度、湿度适宜，适应性饲养7 d，自由摄食、饮水。
1.2 实验药品、试剂、仪器补阳还五汤内含黄芪120 g，赤芍5 g，当归6 g，红花、桃仁、川芎、地龙各3 g，水煎剂浓缩至100 mL，浓度1.43 mg·L-1(药材购自河北乐仁堂药业有限公司)；AMPK激动剂Metformin(HY-17471A)购自MCE公司；抗体AMPKa(#2532)、mTOR(#2972)、p-AMPKa(#2535)、p-mTOR(#5536)、p-ULK1(#14202)均购自CST；ULK1抗体(SAB2109080-100uL)、LC3B抗体(L7543-100 uL)均购自Sigma；β-actin抗体(GB11001)、二抗(GB23303)购自赛维尔；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(购自Beyotime)；PVDF膜(孔径0.45 μm和0.2 μm)购自美国Millipore公司；TUNEL试剂盒购自promega。多功能成像系统(Fusion FX5 Spectra)购自法国Vilber公司；leica显微镜拍照系统、正置荧光显微镜(DM5000B)均购自德国Leica公司。
2 方法 2.1 实验动物分组及给药方案将大鼠随机分为假手术组(Sham)、脑缺血/再灌注模型组(Model)、补阳还五汤组(BYHWD)、补阳还五汤+AMPK激动剂Metformin组(BYHWD+Met)。BYHWD和BYHWD+Met组大鼠术后24 h内予以补阳还五汤14.3 g·kg-1灌胃，BYHWD+Met组大鼠于线栓插入后即刻予Metformin 10 mg·kg-1腹腔注射，Sham和Model组大鼠予以等体积蒸馏水灌胃，连续应用3 d，神经功能评分完成后处死大鼠取材。
2.2 大鼠脑缺血/再灌注模型制作方法采用改良的线栓法制作大鼠大脑中动脉闭塞/再灌注(middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R)模型。应用1%戊巴比妥钠对大鼠进行腹腔注射(用量50 mg·kg-1)，将麻醉后的大鼠采用仰卧位固定于手术操作台上。对手术区域进行常规消毒，于大鼠颈部正中偏左侧行纵向切口，逐层对暴露的组织和血管进行钝性分离，并将两侧的组织利用拉钩进行固定扩大手术视野，分离左侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉。动脉夹暂时夹闭颈总动脉和颈内动脉，于颈外动脉远心端剪一“V”型切口，经此斜口插入线栓沿颈内动脉到达大脑前动脉起始端，入栓长度19 mm左右遇阻力则停止。2 h后拔出线栓，再灌注72 h后处死大鼠取材。Sham组仅分离血管，不插线栓。
2.3 神经功能缺失体征评分缺血/再灌注d 3参照Zea longa评分法对各组大鼠的神经功能缺失情况进行盲评。具体标准为：0分：无神经损伤症状；1分：悬尾实验不能完全伸展对侧前爪；2分：向对侧转圈；3分：向对侧倾倒；4分：无自主活动或陷入深度昏迷中。得分越高表明神经功能损伤越重。
2.4 TTC染色检测大鼠脑梗死体积再灌注72 h后，麻醉大鼠进行取脑，将其置于脑槽内并于-20 ℃中冻存15 min，取出后行2 mm厚度的冠状面切片，将各切片移至培养皿中加入TTC染液，放置在37 ℃恒温箱中避光孵育20 min，每10 min翻动1次。完成染色后，放入4%多聚甲醛中固定，4 ℃过夜后拍照。用Image Pro Plus 6.01图像分析软件进行统计，检测大鼠脑梗死体积。
2.5 尼氏染色法观察神经细胞形态和数量将大鼠灌流取脑后制备石蜡切片，石蜡切片常规脱蜡(分别二甲苯Ⅰ 15 min、二甲苯Ⅱ 15 min)，乙醇脱水(浓度梯度分别100%、95%、90%、80%、70%各5 min)；蒸馏水冲洗3次，每次5 min；用甲苯胺蓝染液浸染组织，后用蒸馏水洗净染料，再依次置于70%、80%、95%和100%乙醇中脱水，二甲苯透明，最后中性树胶封片。正置显微镜下观察拍照，观察神经细胞形态，计数神经细胞数量。
2.6 TUNEL染色法检测细胞凋亡将大鼠灌流取脑后制备冰冻切片，冰冻切片置于4%多聚甲醛固定30 min，于PBS(pH 7.4)中清洗5 min，共3次；应用蛋白酶K工作液(原液∶ PBS=1 ∶ 9)修复22 min，洗涤、破膜，加入buffer常温孵育10 min；按照TUNEL试剂盒说明配置反应液覆盖组织，37 ℃恒温孵育2 h，后续进行DAPI复染细胞核、封片，应用荧光显微镜观察并拍照，观察神经细胞凋亡率。
2.7 Western blot检测相关蛋白表达取适量大鼠脑组织加入RIPA蛋白裂解液，经过研磨、离心、取上清、蛋白变性等步骤制备蛋白样。制备SDS-PAGE凝胶进行蛋白电泳分离，用湿法将目的蛋白转移至PVDF膜上。室温下用质量分数为5%BSA进行膜封闭2 h，孵育一抗并置于4 ℃过夜。次日洗膜，二抗孵育1 h，再次洗膜，最后显影成像，Image Lab软件(Bio-Rad)对结果进行灰度分析。
2.8 统计分析实验数据均以x±s表示，使用SPSS 19.0软件进行统计分析。组间实验数据进行单因素方差分析。使用GraphPad Prism 5.01软件作图。
3 结果 3.1 补阳还五汤对大鼠神经功能评分的影响Fig 1所示，Sham组大鼠无神经功能损伤，结果为0分。Model组较Sham组评分增加(P < 0.05)；BYHWD组较Sham组评分下降(P < 0.05)，BYHWD+Met组则评分较BYHWD组增加(P < 0.05)。
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| Fig 1 Neurological function score of rats (x±s, n=12) △P < 0.05 vs Sham group; #P < 0.05 vs Model group; *P < 0.05 vs BYHWD group. |
Fig 2A所示为脑梗死情况，左侧大脑缺血明显则可见白色梗死区，无损伤则大脑为鲜红色。Sham组未见梗死区，对比Sham组，Model组、BYHWD组和BYHWD+Met组左侧大脑缺血明显，可见白色梗死区。如Fig 2B所示，与Model组相比，BYHWD组大鼠脑梗死体积比率明显下降，差异具有显著性(P < 0.05)。AMPK激动剂则减弱了补阳还五汤的作用，脑梗死体积有所上升(P < 0.05)。
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| Fig 2 Infarct volume of rats(x±s, n=4) A: Images of TTC stained brain sections. B: Infarct volume ratio.△P < 0.05 vs Sham group; #P < 0.05 vs Model group; *P < 0.05 vs BYHWD group. |
Fig 3所示，Sham组大鼠皮层细胞形态结构完整，排列紧密，胞质、核仁清晰，有大量的神经细胞存在；与Sham组相比，Model组皮层中细胞数目明显减少(P < 0.05)，细胞排列紊乱，轮廓模糊不清；与Model组比较，BYHWD组皮层中细胞排列较整齐，细胞边界较清晰，完整神经细胞数量较Model组有增加(P < 0.05)；AMPK激动剂削弱补阳还五汤对神经细胞的保护作用(P < 0.05)。
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| Fig 3 Nissl staining of rats (×400) (x±s, n=4) △P < 0.05 vs Sham group; #P < 0.05 vs Model group; *P < 0.05 vs BYHWD group. |
Fig 4所示，对比Sham组，Model组大鼠缺血侧脑组织神经细胞凋亡率明显升高，与Model组相比，BYHWD组大鼠神经细胞凋亡率明显降低，差异均具有统计学意义(P < 0.05)；增加AMPK激动剂处理后，补阳还五汤的作用受到拮抗，细胞凋亡率有所增加(P < 0.05)。
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| Fig 4 Neuron apoptosis of rats(×200) (x±s, n=4) △P < 0.05 vs Sham group; #P < 0.05 vs Model group; *P < 0.05 vs BYHWD group. |
Fig 5A展示了补阳还五汤对自噬蛋白LC3表达的影响。与Sham组相比较，Model组大鼠缺血侧脑组织的LC3Ⅱ/Ⅰ升高(P < 0.05)；与Model组比，BYHWD组LC3Ⅱ/Ⅰ有所下降(P < 0.05)。如Fig 5B所示，与Sham组相比，Model组p-AMPK/AMPK比值明显升高(P < 0.05)，与Model组比较，BYHWD组p-AMPK/AMPK比值下降(P < 0.05)。Fig 5C、D所示与Sham组比较，Model组p-mTOR/mTOR和p-ULK1/ULK1比值降低；与Model组相比，BYHWD组p-mTOR/mTOR和p-ULK1/ULK1比值明显升高(P < 0.05)；在AMPK激动剂的作用下，使补阳还五汤对上述各项指标的影响下降，并均具有统计学意义(P < 0.05)。
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| Fig 5 Relative expression of proteins(x±s, n=4) A: LC3;B: p-AMPK/AMPK; C: p-mTOR/mTOR; D: p-ULK1/ULK1. △P < 0.05 vs Sham group; #P < 0.05 vs Model group; *P < 0.05 vs BYHWD group. |
缺血性脑卒中病理机制复杂，针对发病机制的各种神经保护治疗效果不够理想[8]，有效的溶栓治疗受到严格的时间窗限制，探寻中医药的治疗可能是一有效手段。补阳还五汤用于脑卒中治疗历史久远，可发挥补气活血，化瘀通络之功，多项基础和临床研究表明补阳还五汤具备抗脑IR损伤的作用[9-10]。我实验室前期研究也表明补阳还五汤可上调Notch1、Hes1、Hes5的表达，对脑IR损伤大鼠神经干细胞移植后的脑保护功能起到促进作用[11]。赵欣等[5]发现补阳还五汤可通过调节自噬、稳定线粒体功能发挥神经保护作用。
自噬是细胞内的“清道夫”，可对内环境进行监视，及时清除老化的细胞器、损伤蛋白质，脑缺血发生后自噬呈上调趋势[12]。自噬早期可起到保护性作用，24 h应用自噬抑制剂3-MA进行干预会增加神经元死亡率；但是48和72 h后自噬抑制剂的介入可显著保护神经元免于死亡[13]。通过侧脑室注射3-MA可显著抑制模型组LC3Ⅱ的升高，抑制缺血半暗带神经元的迟发性死亡，缩小脑缺血损伤病变范围[14]。Wang等[15]发现葛根素通过AMPK/mTOR/ULK1信号通路抑制自噬，保护脑IR损伤大鼠神经功能。
当细胞能量充足时，AMPK处于失活状态，mTOR处于活化状态，活化的mTOR对ULK1的Ser757位点进行磷酸化，并防止ULK1的其他位点被AMPK直接激活，自噬受到抑制。在脑IR损伤能量迅速消耗甚至衰竭的情况下，AMPK催化亚基位点Thr172磷酸化激活，抑制mTOR，使ULK1位点Ser757磷酸化受到抑制；并且AMPK直接对ULK1其他位点磷酸化活化，最终解除mTOR的负性调节作用，发挥AMPK的促进作用，启动自噬[16]。
本研究对补阳还五汤介导AMPK/mTOR/ULK1自噬信号通路抗大鼠脑IR损伤机制进行探讨。通过建立大鼠MCAO模型，选择再灌注72 h进行观察。在自噬过程中，LC3的羧基末端脂质修饰即LC3Ⅱ的增加是自噬体形成所需的特征性表现，在本实验中补阳还五汤抑制了LC3Ⅱ的表达，同时AMPK的磷酸化水平降低，活化的mTOR和ULK1 Ser757磷酸化增加，而AMPK激动剂则逆转了补阳还五汤的上述作用，表明补阳还五汤通过AMPK/mTOR/ULK1信号通路抑制自噬，使大鼠神经功能评分、脑梗死体积、神经细胞凋亡率下降，缺血侧脑组织病理损伤程度减轻，发挥神经功能保护性作用。
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