2. 山东中医药大学 附属医院生殖中心妇二科，山东 济南 250014
2. Dept of Gynecology, Reproductive Center, First Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, China
不孕症是指性生活正常, 一年未采取任何避孕措施而未成功妊娠者，是女性常见的生殖疾病。近些年随着二胎政策的全面开放，高龄女性的生育问题受到越来越多的关注。然而，先前的研究表明，女性的生育能力普遍会随着年龄的增长逐渐下降[1]，高龄人群只能借助辅助生殖技术以期获得妊娠。在助孕技术中，由于高龄患者卵巢反应低下、子宫内膜容受性较差、血流量不足，不能募集到优质卵母细胞，从而导致妊娠率降低而流产率升高。很多高龄女性寻求中西医联合治疗，以提高卵巢功能，改善内膜血流，提高受孕率。
中医认为，卵泡的生长发育和成熟均伴随着人体肾气、肾阴(肾精)的耗损，高龄女性肾之精气逐渐衰退，肝肾亏虚、气血不足、冲任虚衰，则孕育无能。二至天癸方组成包括菟丝子、女贞子、枸杞子、旱莲草、熟地、当归、白芍、川穹、香附、甘草。十味之方联合使肾气足、精血旺、冲任畅顺，在多卵泡发育中有针对性的补肾益阴, 增加肾阴癸水的储备。连方等[2]通过临床试验证明，二至天癸方能提高高龄人群的卵子质量，有效抑制颗粒细胞的凋亡，改善肾虚状态，提高胚胎的种植率。
网络药理学是一种新兴的生物信息学研究方法，可以根据目标分子、生物功能和生物活性化合物等生成复杂的相互作用网络，研究中药复方作用机理，解释生物系统与药物之间的复杂关系，筛选多种药物的协同效应[3]。分子对接是基于受体和配体的空间结构的对接, 能快速预测中药活性成分与靶点之间的结合力。为此，本研究基于网络药理学方法，探讨二至天癸方治疗女性不孕症的分子机制，同时将筛选出的主要化学成分与Mfn-1和Mfn-2进行分子对接结合验证，为中医药治疗高龄女性不孕症提供先导信息和基础。
1 材料与方法 1.1 二至天癸方相关靶点筛选利用TCMSP数据库(http://tcmspw.com/tcmsp.php)寻找中药化学组成成分，根据口服利用度OB≥30%，且类药性DL≥0.18进行活性成分初步筛选，并结合相关文献以获得活性化合物及其作用的蛋白质靶点。筛选结束后，统一在Uniprot蛋白质数据库(https://www.uniprot.org)标准化蛋白质靶点信息。
1.2 女性不孕症相关靶点筛选以“Female infertility”为关键词，检索GeneCards数据库(https://www.genecards.org)、TTD数据库(http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd)、OMIM数据库(http://www.omim.org)中治疗女性不孕症的作用靶点，进入DRUGBANK数据库(https://www.drugbank.ca)寻找治疗女性不孕症的临床一线西药作用靶点。由于Genecards数据库中靶点太多，取Score分值大于中位数的靶点为治疗女性不孕症的潜在靶点。将4个疾病数据库靶点合并删除重复值之后，获得女性不孕症靶点。
1.3 成分-疾病靶点PPI网络构建为明晰二至天癸方药物相关靶点与女性不孕症靶点间的相互作用，应用联川生物图文工具(https://www.omicstudio.cn/tool)将二者靶点取交集并绘制韦恩图。而后将筛选出的交集靶点导入STRING11.0b数据库(https://string-db.org)，设定生物种类为人类，最小互相作用阈值设定>0.9，其他设置均默认，构建PPI网络。
1.4 “药物-成分-靶点-疾病”网络图的构建将药物活性成分及“1.3”得到的交集靶点分别导入CytoScape3.8.0，得到“药物-成分-靶点-疾病”网络，利用插件内置的“Network Analyzer”分析有效成分，图中节点越大代表度值越大，依据结点的度值分析发挥药物作用的核心靶点和主要有效成分。
1.5 二至天癸方成分-女性不孕症靶点功能与通路的富集分析Metascape数据库(http://metascape.org/gp/index.html)具有全面的注释靶点信息功能，并每月更新基因注释数据。将获得的交集靶点录入Metascape数据库，设定P < 0.01进行富集分析，保存数据结果并采用微生物图文工具(http://www.bioinformatics.com.cn)对数据进行可视化，得到GO和KEGG富集分析的柱状图、气泡图和通路图，分析其参与的主要生物学通路及代谢过程。并在MCODE模块对网络进行聚类分析，得到密度较高的区域，通过研究其参与的主要生物学过程分析其功能。
1.6 分子对接验证分子对接结果可显示中药活性成分与重要靶蛋白之间的结合活性, 对网络药理的分析结果起到一定的验证作用。从TCMSP数据库下载二至天癸方主要活性成分的mol2结构文件，从PDB数据库下载高分辨率Mfn-1(PDBID：5GOF)和Mfn-2(PDBID：6JFK)。然后用Pymol2.5.0对蛋白分子去水、加氢、计算电荷，保存成pdbqt文件。应用Autodock 4.2.6对接小分子和蛋白质，选用获得最高分的构象，整理结果并通过Pymol 2.5.0进行可视化。
2 结果 2.1 二至天癸方活性成分靶点的获取在TCMSP数据库中经筛选，并结合文献数据[4]，获得活性化合物及其作用的蛋白质靶点。其中女贞子成分8种，作用靶点194个；枸杞子成分36种，作用靶点199个；川芎成分6种，作用靶点29个；白芍成分8种，作用靶点89个；熟地黄成分2种，作用靶点31个；甘草成分88种，作用靶点228个；当归成分2种，作用靶点52个；香附成分16种，作用靶点221个；菟丝子成分10种，作用靶点210个；旱莲草成分10种，作用靶点176个。合并去重后共获得中药活性成分159种，蛋白质靶点283个。
2.2 女性不孕症相关靶点的获取从Genecards平台共获得1 994个作用靶点，取Score分值大于中位数6.95的1 001个靶点作为治疗女性不孕症目标靶点。合并TTD数据库靶点5个、OMIM数据库靶点132个、DRUGBANK数据库靶点30个，去重后最终得到女性不孕症靶点1 078个。
2.3 药物-成分-靶点-疾病网络图的构建将筛选的二至天癸方中药成分靶点与女性不孕症疾病靶点取交集，利用联川生物图文工具绘制韦恩图，得到交集靶点104个，见Fig 1。在CytoScape软件中导入二至天癸方的中药成分和104个交集靶点，去除与靶点无相互作用的成分，得到“药物-成分-靶点-疾病”网络。通过CytoScape3.8.0内置的Network Analyzer分析二至天癸方治疗女性不孕症网络拓扑学参数，度值越大说明该成分越重要, 在154个相互作用活性成分的网络中，槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)、山奈酚(kaempferol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、芒柄花素(formononetin)、柚皮素(naringenin)、金合欢素(acacetin)、异鼠李素(isorhamnetin)、7-甲氧基-2-甲基异黄酮(7-Methoxy-2-methyl isoflavone)均能与15个以上的靶点相连接，推测这9个成分是二至天癸方治疗女性不孕症的核心成分，见Tab 1。在“药物-成分-靶点-疾病”网络中PTGS2的连接度为111，介度为0.151 9，紧密度为0.571 4，预测PTGS2为二至天癸方调治女性不孕症的最主要靶点。ESR1、HSP90AA1、AR、NOS2、PPARG、NCOA2、CCNA2、PRKACA、ADRB2等均可作用于30种以上的成分，亦为相对重要的靶点。故二至天癸方可能同时作用于多个靶点共同治疗女性不孕症。
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| Fig 1 Ingredients of Erzhi Tiangui formula-target of female infertility Venn diagram |
| MOLID | Compound name | Degree | Betweenness | Closeness |
| MOL000098 | Quercetin | 77 | 0.146 845 | 0.538 153 |
| MOL000006 | Luteolin | 36 | 0.031 572 | 0.433 657 |
| MOL000422 | Kaempferol | 34 | 0.042 616 | 0.455 782 |
| MOL000358 | Beta-sitosterol | 22 | 0.026 214 | 0.442 244 |
| MOL000392 | Formononetin | 20 | 0.009 604 | 0.396 45 |
| MOL004328 | Naringenin | 18 | 0.011 495 | 0.392 962 |
| MOL001689 | Acacetin | 18 | 0.009 066 | 0.408 537 |
| MOL000354 | Isorhamnetin | 16 | 0.005 913 | 0.408 537 |
| MOL003896 | 7-Methoxy-2-methyl isoflavone | 16 | 0.002 4 | 0.406 061 |
将靶点提交至STRING11.0b平台，得到二至天癸方治疗女性不孕症的PPI网络，见Fig 2。在STRING网络图中STAT3、HSP90AA1、VEGFA、ESR1、AR、PRKACA、PPARG、NCOA2、PTGS2、NOS2度值均大于中位数6，将两图的主要靶点相互映射，推测二至天癸方的有效成分可能通过HSP90AA1、ESR1、AR、PRKACA、PPARG、NCOA2、PTGS2、NOS2等靶点发挥治疗女性不孕症的作用。一种活性成分可以对多个靶点发挥作用，而同一靶点又可同时受多种成分的调控，体现了二至天癸方系统、综合、复杂的调节能力。
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| Fig 2 PPI network of Erzhi Tiangui prescription-female infertility target |
通过Metascape数据库对二至天癸方治疗女性不孕症交集靶点进行生物通路过程分析，应用微生物网站对结果可视化。主要参与的生物学过程包括细胞对有机环化合物的响应、对无机物的反应、活性氧代谢过程、对氧化应激的反应、细胞对氧化应激的反应、对活性氧的反应，对细胞增殖的负调控，见Fig 3A。参与治疗的有关通路主要有PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、以及内分泌抵抗等，见Fig 4。生物通路过程富集靶点见Tab 2。
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| Fig 3 Enrichment analysis of potential targets of main components in Erzhi Tiangui prescription A: GO-BP analysis; B: GO-CC analysis; C: GO-MF analysis |
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| Fig 4 Bubble diagram of KEGG pathway |
| Pathway name | Enrichment target |
| Pathways in cancer | AKT1, FASLG, AR, BAX, BCL2, BCL2L1, CASP3, CASP8, CDKN1A, NQO1, E2F1, EGF, EGFR, ERBB2, ESR1, ESR2, FOS, GSTM1, GSTP1, HMOX1, HSP90AA1, IFNG, IGF2, IL2, IL4, IL6, CXCL8, JUN, MDM2, MMP1, MMP2, MMP9, MYC, NOS2, PPARG, PRKACA, MAPK1, PTEN, PTGS2, RAF1, STAT1, STAT3, TGFB1, TP53, VEGFA, RASSF1 |
| Proteoglycans in cancer | AKT1, FASLG, CASP3, CAV1, CDKN1A, EGFR, ERBB2, ESR1, IGF2, IL6, KDR, MDM2, MMP2, MMP9, MYC, PLAU, PRKACA, MAPK1, RAF1, STAT3, TGFB1, TNF, TP53, VEGFA, HPSE |
| PI3K-Akt signaling pathway | AKT1, FASLG, BCL2, BCL2L1, CDKN1A, EGF, EGFR, ERBB2, HSP90AA1, IGF2, IL2, IL4, IL6, INSR, KDR, MCL1, MDM2, MYC, NOS3, MAPK1, PTEN, RAF1, TP53, VEGFA |
| Hepatitis B | AKT1, FASLG, BAX, BCL2, CASP3, CASP8, CCNA2, CDKN1A, E2F1, FOS, IL6, CXCL8, JUN, MMP9, MYC, MAPK1, PTEN, RAF1, STAT1, STAT3, TGFB1, TNF, TP53 |
| MicroRNAs in cancer | BCL2, CASP3, CDKN1A, CYP1B1, E2F1, EGFR, ERBB2, HMOX1, MCL1, MDM2, MMP9, ABCC1, MYC, PLAU, MAPK1, PTEN, PTGS2, RAF1, STAT3, TP53, VEGFA, RASSF1, SIRT1 |
| human cytomegalovirus infection | AKT1, FASLG, BAX, CASP3, CASP8, CDKN1A, E2F1, EGFR, IL1B, IL6, CXCL8, MDM2, MYC, PRKACA, MAPK1, PTGS2, RAF1, CCL2, STAT3, TNF, TP53, VEGFA |
| MAPK signaling pathway | AKT1, FASLG, CASP3, EGF, EGFR, ERBB2, FOS, IGF2, IL1B, IL6, INSR, JUN, KDR, MYC, PRKACA, MAPK1, RAF1, TGFB1, TNF, TP53, VEGFA |
| human papillomavirus infection | AKT1, FASLG, BAX, CASP3, CASP8, CCNA2, CDKN1A, E2F1, EGF, EGFR, IRF1, MDM2, PRKACA, MAPK1, PTEN, PTGS2, RAF1, STAT1, TNF, TP53, VEGFA |
| Hepatitis C | AKT1, FASLG, BAX, CASP3, CASP8, CDKN1A, E2F1, EGF, EGFR, IFNG, CXCL8, IRF1, MYC, MAPK1, RAF1, STAT1, STAT3, TNF, TP53 |
| Endocrine resistance | AKT1, BAX, BCL2, CDKN1A, E2F1, EGFR, ERBB2, ESR1, ESR2, FOS, JUN, MDM2, MMP2, MMP9, PRKACA, MAPK1, RAF1, TP53 |
| Prostate cancer | AKT1, AR, BCL2, CDKN1A, E2F1, EGF, EGFR, ERBB2, GSTP1, HSP90AA1, MDM2, MMP3, MMP9, PLAU, MAPK1, PTEN, RAF1, TP53 |
| hepatocellular carcinoma | AKT1, BAX, BCL2L1, CDKN1A, NQO1, E2F1, EGFR, GSTM1, GSTP1, HMOX1, IGF2, IL6, MYC, MAPK1, PTEN, RAF1, TGFB1, TP53 |
| kaposi sarcoma- associated herpesvirus infection | AKT1, BAX, CASP3, CASP8, CDKN1A, E2F1, FOS, IL6, CXCL8, JUN, MYC, MAPK1, PTGS2, RAF1, STAT1, STAT3, TP53, VEGFA |
| Breast cancer | AKT1, BAX, CDKN1A, E2F1, EGF, EGFR, ERBB2, ESR1, ESR2, FOS, JUN, MYC, PGR, MAPK1, PTEN, RAF1, TP53 |
| Bladder cancer | CDKN1A, E2F1, EGF, EGFR, ERBB2, CXCL8, MDM2, MMP1, MMP2, MMP9, MYC, MAPK1, RAF1, TP53, VEGFA, RASSF1 |
| HIF-1 signaling pathway | AKT1, BCL2, CDKN1A, EGF, EGFR, ERBB2, HMOX1, IFNG, IL6, INSR, NOS2, NOS3, SERPINE1, MAPK1, STAT3, VEGFA |
| foxo signaling pathway | AKT1, FASLG, CAT, CDKN1A, EGF, EGFR, IL6, IL10, INSR, MDM2, MAPK1, PTEN, RAF1, STAT3, TGFB1, SIRT1 |
| JAK-STAT signaling pathway | AKT1, BCL2, BCL2L1, CDKN1A, EGF, EGFR, IFNG, IL2, IL4, IL6, IL10, MCL1, MYC, RAF1, STAT1, STAT3 |
| Pancreatic cancer | AKT1, BAX, BCL2L1, CDKN1A, E2F1, EGF, EGFR, ERBB2, MAPK1, RAF1, STAT1, STAT3, TGFB1, TP53, VEGFA |
| EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance | AKT1, BAX, BCL2, BCL2L1, EGF, EGFR, ERBB2, IL6, KDR, MAPK1, PTEN, RAF1, STAT3, VEGFA |
相关靶点治疗女性不孕症的功能主要富集于细胞因子受体结合、细胞因子活性、受体调节活性、受体配体活性、生长因子受体结合，生长因子活性等，见Fig 3C。
利用Metascape数据平台的MCODE模块，获得网络中的高度连通区域(子网)，进行模块划分，见Fig 5。根据P值, 筛选出3个生物学进程，见Tab 3。
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| Fig 5 Erzhi Tiangui formula-subnet in network of female infertility targets |
| GO | Description | Log10(P) |
| GO: 0008210 | estrogen metabolic process | -14.1 |
| GO: 0045860 | positive regulation of protein kinase activity | -11.5 |
| GO: 0033674 | positive regulation of kinase activity | -11.1 |
分子对接配体与受体间，若结合能小于0提示可自发结合。且结合能越低，其结合构象越稳定，小分子化合物与蛋白越有可能产生作用。一般认为分值小于-5 kJ·mol-1时，分子与靶点可以较好结合。依据“药物-成分-靶点-疾病”网络图的节点度值排名并查阅相关文献, 课题组将齐墩果酸与9种主要活性成分作为研究对象，分子对接结果显示：齐墩果酸、β-谷甾醇、芒柄花素、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、山奈酚等与Mfn-1对接分数较高，β-谷甾醇、齐墩果酸，金合欢素等与Mfn-2对接分数较高，见Tab 4。
| Compounds and targets | Protein-ligand interactions of the docking pose |
Score/ kJ·mol-1 |
| Oleanolic acid, MFN1 |  |
-6.74 |
| Beta-sitosterol, MFN1 |  |
-6.44 |
| Formononetin, MFN1 |  |
-5.92 |
| 7-Methoxy-2-methyl isoflavone, MFN1 |  |
-5.73 |
| Kaempferol, MFN1 |  |
-5.71 |
| Beta-sitosterol, MFN2 |  |
-6.54 |
| Oleanolic acid, MFN2 |  |
-5.95 |
| Acacetin, MFN2 |  |
-5.66 |
随着年龄的增长，妇女体内能量代谢过程渐趋失调，糖、脂代谢受损，炎症和氧化应激的发生率逐渐增加。本研究通过“药物-成分-靶点-疾病”网络初步筛选出二至天癸方调治女性不孕症的活性成分为齐墩果酸、槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、芒柄花素等。现代药理研究表明，齐墩果酸能调节内分泌环境，改善胰岛素抵抗，降低四氧嘧啶糖尿病大鼠的MDA水平，发挥明显的抗氧化作用[5]。槲皮素具有抗炎、镇痛、抗癌、抗缺氧损伤、抗血小板凝聚、降血压、保护动脉粥样硬化等功能[6]，有利于改善卵细胞的质量以及促进胚胎的着床与发育。木犀草素具有抗氧化、抗炎及免疫调节等多种作用，促进妊娠[7]。山萘酚可抑制AGE的形成并消除自由基, 其强大的抗氧化作用，可防止细胞内脂质和DNA的氧化损伤[8]。β-谷甾醇可增强酪氨酸磷酸酶活性, 减小促炎因子和趋化因子活性, 抑制NF-κB因子向细胞核迁移发挥抗炎功效，并通过抑制胆固醇合成酶HMGCoA的表达, 减少机体胆固醇合成[9]。芒柄花素具有植物雌激素样作用，能够在体外条件下增强T47D细胞ERα表达, 还可以调节体内血脂代谢[10]。分子对接结果亦表明齐墩果酸、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、芒柄花素均能与Mfn-1较好结合，齐墩果酸、β-谷甾醇、芒柄花素均能与Mfn-2较好结合, 一定程度上验证了这项研究的结果。
该研究结果表明，二至天癸方治疗女性不孕症的主要作用靶点为PTGS2，而ESR1亦发挥了重要作用。卵丘细胞中PTGS2的高表达与人类卵母细胞能力获得和更高级别胚胎的获得有关；同时PTGS2编码COX-2酶，在卵丘细胞中的COX-2水平被证实可以扩张卵丘和成熟卵母细胞, 因此PTGS2与卵母细胞质量密切相关[11]。ESR1基因编码雌激素受体，雌激素及其受体在生殖器官的发育和成熟及生殖功能中发挥极其重要的作用[12]。
高龄女性卵泡液蛋白质组学代谢功能总体趋势是细胞凋亡加剧，增殖与分化修复能力下降，从而导致卵泡凋亡加速、卵细胞质量下降，使高龄女性受孕率降低而自然流产率升高。二至天癸方调治女性不孕症的通路主要有PI3K-Akt信号通路(hsa04151)、MAPK信号通路(hsa04010)等。PI3K/AKT途径参与卵母细胞生长、原始卵泡发育、颗粒细胞增殖和凋亡。Bax和Bcl-2是线粒体凋亡路径中的关键蛋白，已被证明调节卵巢中的凋亡[13]。Bax蛋白位于细胞质中，可以转运到线粒体膜上，形成线粒体孔道，促进细胞色素C释放，导致细胞凋亡。Bcl-2表达上调可拮抗Bax促凋亡的作用，并抑制颗粒细胞凋亡[14]。caspase-3是多种凋亡途径的共同作用点, 也是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路, 被认为是凋亡的最终执行者[15]。二至天癸方可能通过抑制PI3K/AKT途径抑制Bax、caspase-3，促进Bcl-2的上调抑制凋亡路径。
MAPK信号通路在细胞生长、迁移、增殖、分化和凋亡方面发挥着关键作用。MAPK超家族包括经典的MAPK(又称ERK)、JNK和p38 3个成员。有学者发现，JNK参与过氧化氢处理后FoxO4中T451和T447的磷酸化，并且可促进氧化应激中FoxO1的核转位诱导的mGCS细胞(小鼠卵泡颗粒细胞)凋亡[16]。ERK和p38αMAPK也在卵母细胞减数分裂成熟[17]和卵母细胞激活[18]中起重要作用，靶向该途径可成为治疗高龄女性不孕症的有效策略。
综上所述，本研究通过采用网络药理学探索二至天癸方中活性成分、潜在靶点、通路过程，并运用分子对接技术分析了主要活性成分与Mfn-1、Mfn-2的结合能力。从整体性、系统性来分析二至天癸方多成分、多途径、多靶点协同作用原理，为高龄女性不孕症的中医药治疗提供了先导信息和基础。本研究的不足之处在于, 未考虑各味中药的量以及煎煮时发生的化学反应及体内的代谢过程。同时分子对接也是计算机结果，还不能取代实验数据，后期可用实验加以验证。
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