DNA损伤修复是保障基因组稳定性，并将遗传信息准确无误地传给子代细胞的关键。损伤一旦发生后，细胞启动一系列损伤监控和修复机制，即所谓的DNA损伤应答(DNA damage response，DDR)。作为最为严重的DNA损伤形式——DNA双链断裂(double-strand breaks，DSBs)，细胞采取两种修复途径，即同源重组(homologous recombination，HR)和非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)。决定这两条途径选择性进行的关键步骤是末端切除及切除的核苷酸长度。HR途径中，DSBs一条链末端5′→3′方向首先被切除掉上千个碱基，另一条链则形成较长的3′突出单链DNA(single-stranded DNA，ssDNA)尾，这一过程被称为末端切除(end resection)[1]。乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1)与其它核心蛋白(BARD等)形成复合体促进末端切除，BRCA2负责与重组酶RAD51结合并将其招募至3′单链DNA末端，形成RAD51单链DNA纤维(RAD51 filament)，侵入姐妹染色单体中的同源序列完成修复过程；NHEJ则是将断裂的DNA末端直接相连，利用损伤区域微同源序列形成粘性末端，通过碱基互补配对，无需切除或只需切除末端小片段非同源ssDNA，再将断裂的DNA重新连接。NHEJ包括3条途径，异二聚体Ku依赖的经典途径(canonical NHEJ，c-NHEJ)，Ku非依赖的替代性途径(alternative NHEJ，a-NHEJ)与及单链退火途径(single-strand annealing，SSA)。这3种NHEJ途径的主要区别在于微同源序列的长度不同。c-NHEJ只需0-5 bp的同源序列，a-NHEJ需5-25 bp的同源序列，而SSA则需要>30 bp的同源序列[2]。因此，限制或保护DNA断端不被大范围切除，即可将HR修复途径转向NHEJ途径。DNA断端保护介导的DSBs修复途径转换机制一直是DNA损伤修复研究的国际前沿问题[3]。
1 Shieldin的发现作为HR与NHEJ修复途径选择的决定因子，p53结合蛋白(p53 binding protein 1，53BP1)，通过招募另一染色质支架蛋白RIF1(Rap1 interacting factor)竞争性抑制BRCA1依赖的末端切除，将DSBs修复引导至NHEJ途径[4]。但是53BP1-RIF1通路抑制末端切除机制的下游效应因子仍不清楚。2015年，DNA聚合酶ζ的小亚基REV7(又称为MAD2L2或MAD2B)被鉴定为53BP1-RIF1限制末端切除的一个下游因子[5-6]。2018年，丹麦哥本哈根大学研究团队在利用亲和纯化与质谱偶联的邻近标记技术绘制了53BP1参与DNA损伤修复的蛋白互作网络，发现了与REV7直接互作的CTC-534A2.2，并揭示其促进NHEJ的生物功能，命名为RINN1，同时发现另外两种协作蛋白FAM35A与C20orf196，分别命名为RINN2与RINN3。作者首次将REV7、RINN1、RINN2与RINN3组成的复合物命名为Shieldin。顾名思义，Shieldin具有DNA末端防卫、保护的寓意，取自于端粒保护复合体Shelterin[7]。
根据协同致死作用，BRCA1/2突变的HR缺陷肿瘤对PARP(poly (ADP-ribose) polymerase)抑制剂格外敏感[8]，而去除53BP1使肿瘤恢复了HR修复能力而产生PARP抑制剂抵抗。加拿大多伦多大学研究团队基于这一实验表型，利用CRISPR/Cas9技术筛选53BP1遗传互作分子，也发现了FAM35A、C20orf196与CTC-534A2.2在促进NHEJ并抑制HR功能中的作用，并将C20orf196重新命名为SHLD1(RINN3)，FAM35A重新命名为SHLD2(RINN2)，CTC-534A2.2重新命名为SHLD3(RINN1)[9]。与此同时，国际上其它多个课题组也相继证实了Shieldin复合体是53BP1-RIF1下游效应因子，引发了Shieldin研究热潮[10-14]。
2 Shieldin的分子结构与组装机制Shieldin复合物4个亚基中的REV7是编码211个氨基酸，分子量大小为24 ku的适配蛋白，中间含有1个HORMA结构域，C端含有1个被称之为“安全带”的结合模序(Seatbelt-binding motif，SBM)，是连接SHLD2和SHLD3的桥梁分子。SHLD1C20orf196位于20号染色体，编码205个氨基酸，分子量为23 ku，位于复合体信号链末端；SHLD2FAM35A位于10号染色体，编码835个氨基酸，分子量为92 ku，其C端含有3个寡核苷酸/寡糖结合折叠(OB-fold)结构域(OBA/OBB/OBC)，使Shieldin复合物定位并组装在断裂DNA末端单链DNA上，C端OBC上的两个CXXC模序与SHLD1绑定，N端与REV7绑定。SHLD3CTC-534A2.2位于5号染色体，编码250个氨基酸，分子量为29 ku，其N端含有两个预测的REV7结合模序(PxxxpP，REV7-binding motif，RBM)，C端含有翻译延长因子EIF4E样结构域。同其它含有RBM模序的REV7结合蛋白相同，SHLD3通过自身的RBM与REV7上的SBM绑定在一起，位于复合体信号链最上游(Fig 1A)。综上，Shieldin复合物自上而下的工作顺序为SHLD3-REV7-SHLD2-SHLD1[15]。
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| Fig 1 Subunits and model of Shieldin complex A: Subunits and domains of Shieldin complex; B: Assembly mechanisms of Shieldin complex. |
2020年，中国科学院生物物理研究所周政课题组首次解析了SHLD3结合REV7的高级结构SHLD3-RBD(REV7-binding domain)。SHLD3-RBD形似长柄勺，通过N端loop勺柄及其C端α-螺旋勺体与REV7的SBM拴在一起[16]。同年，北京大学尹玉新课题组成功制备并解析了含SHLD3-REV7-SHLD2三元复合物的高分辨率晶体结构，发现SHLD3-SHLD2结合2个REV7分子，分别呈现关闭(Closed)C-REV7和开放(Open)O-REV7的两种构象，即C-REV7-O-REV7构象二聚体(conformational dimer)，重新定义了SHLD3-REV7-SHLD2复合物实为四聚体结构，且REV7构象二聚体为NHEJ效率所必需[17]。Clairmont等[18]也通过冷冻电镜技术证实了REV7构象二聚体的存在，发现C-REV7为结合态/激活态而O-REV7为松弛态/失活态，进一步明确C-REV7与SHLD3通过SBM绑定在一起(Fig 1B)。REV7二聚化依赖HORMA结构域[19]，Sarangi等[20]发现C-REV7向O-REV7转变不仅依赖TRIP13(下文介绍)，还依赖于p31comet适配蛋白，该蛋白自身也包含一个HORMA结构域，具体的机制还有待解析。
3 Shieldin抑制HR修复的分子机制Shieldin抑制HR修复存在两种机制，一是限制HR上游末端切除的进行(末端切除前)，其二是限制HR下游BRCA2/RAD51的加载(末端切除后)。一方面，Shieldin通过招募一种单链DNA保护蛋白——端粒结合蛋白复合物CST(Ctc1、Stn1、Ten1)作为聚合酶α/引物酶辅助因子(polymeraseα/primase accessory factor)，通过合成新的ssDNA填充断裂DNA末端缺口，从而防止末端切除的发生。互作分析发现，SHLD1与CST复合物中的Ctc1强烈结合，提示SHLD1是Shieldin招募CST的主导者[11]。另一方面，Shieldin抑制HR修复还存在末端切除后机制。BRCA1缺陷细胞替代性利用E3泛素连接酶RNF168招募乳腺癌易感基因相关蛋白PALB2与BRCA2而启动RAD51纤维形成。Shieldin复合物中的SHLD3可以抑制该通路，减少RAD51纤维而阻断HR修复途径，使得BRCA1/53BP1双突变细胞中发生末端切除正常而无RAD51加载的现象[13]。此外，在BRCA1/53BP1双敲除细胞中，SHLD2完整的OB折叠结构域与ssDNA的结合作为BRCA2/RAD51物理屏障对抑制HR途径十分关键[18]。末端切除后机制的发现也从侧面证实了HR途径中RAD51加载可以与末端切除解耦联。
4 Shieldin信号的灭活机制为进一步理解Shieldin介导的末端保护与促进NHEJ修复途径的负向调控机制，Clairmont等从REV7结合蛋白组中又鉴定了新的靶蛋白TRIP13(thyroid hormone receptor interacting protein 13)。TRIP13是甲状腺激素受体相互作用蛋白，属于AAA-ATPase家族。研究显示TRIP13通过负向调控纺锤体组装检查点和DNA修复促进染色体不稳定性，从而促进肿瘤的发生与发展。与敲除REV7产生RARP抑制剂抵抗效应相反，敲除TRIP13可以增强PARP抑制剂敏感性，因此推测TRIP13可以负向调控REV7。根据TRIP13催化其已知底物纺锤体组装检查点蛋白MAD2从关闭构象(C-MAD2)转为开放构象(O-MAD2)，研究同样证实了REV7构象二聚体现象，且其中的C-REV7通过SBM与SHLD3结合，TRIP13可以使C-REV7-SHLD3解聚从而拮抗REV7功能，促进末端切除与HR修复，使BRCA1缺失肿瘤对PARP抑制剂的敏感性降低[21-22]。最近，Xie等[22]解析了TRIP13去组装Shieldin的结构机制，发现TRIP13利用其六聚分子马达介导的孔道旋转动力促进C-REV7的N端未折叠肽段拉入至TRIP13中心孔道，实现C-REV7从Shieldin复合物中分离。
5 Shieldin与肿瘤的关系及其临床价值一方面，去除Shieldin复合物的任何一个亚基均使BRCA1缺陷的肿瘤产生PARP抑制剂抵抗，Shieldin功能丧失可以挽救BRCA1缺陷肿瘤HR活性，诱导PARP抑制剂耐药的发生。在BRCA1缺失的临床肿瘤样本的PDX(patient-derived xenografts)模型小鼠中，SHLD1/2的表达水平与PARP抑制剂的敏感性成正相关性[18]。因此，针对革命性抗肿瘤药物PARP抑制剂耐药的临床困境，Shieldin复合物及其分子互作可以为解析PARP抑制剂耐药机制提供新的视角。另一方面，与易错修复的NHEJ相比，HR是一种精准无误的修复途径，Shieldin是负向调控HR且正向调控NHEJ的终末效应因子，因此Shieldin信号过度活跃可以诱导突变的积累与基因组不稳定性，从而促进肿瘤的发生发展。在荷瘤小鼠模型中，敲除Shieldin中的SHLD1或SHLD2能够增加BRCA1缺失肿瘤对铂类化疗药物与电离辐射(IR)的敏感性，提示在BRCA1缺失肿瘤中靶向Shieldin与放化疗疗效之间存在协同关系[18]。因此，深入探讨Shieldin复合物的分子间交互或旁路交互机制对BRCA1突变/缺失肿瘤的分类治疗具有转化医学意义。
Shieldin结构生物学研究的更新进一步提供了针对该复合物设计可药靶的结构位点。REV7的安全带结构是其与多种互作蛋白结合的结构基础[23]。在SHLD3-REV7互作界面上，除了设计干扰REV7安全带结构从而促进SHLD3解绑的小分子调节剂外，最新研究提出SHLD3疏水性氨基酸残基(38-FIPWF-42)覆盖的REV7-β转角界面，又称为site-S，是一个更为理想的药物靶位。由于site-S还部分存在于REV7-REV1互作界面，而靶向REV7-REV1互作，可以抑制跨损伤DNA合成(translesion DNA synthesis, TLS)带来的基因组突变与放化疗抵抗。因此，设计针对site-S的小分子药物，实现NHEJ与TLS的双重抑制而增强放化疗敏感性，具有一定的应用前景[22]。
6 结语与展望Shieldin是近3年DNA损伤修复的新兴热点方向，其研究处于起步上升阶段。我们课题组前期研究发现[24]，中药三萜类活性分子可以诱导DSBs，在抑制53BP1功能的同时上调细胞核内RAD51的加载，提示三萜活性分子可以调控53BP1与RAD51互为拮抗的作用。作为53BP1下游直接阻断RAD51加载的调控分子，Shieldin的发现对进一步在药理学上阐明中药活性分子干预两种修复途径转换机制提供了新的科学依据。鉴于其结构复杂程度，特别是REV7构象二聚体在调控Shieldin复合物活性发挥DSBs修复途径的选择性机制仍不明晰。同时，Shieldin对肿瘤生物学与放化疗、靶向治疗的响应产生重要影响，对病人预后的评估提供新的参考或治疗机遇，并在病人肿瘤样本中证实Shieldin的临床价值，开发特异性阻断Shieldin复合物分子内互作(C-REV7-SHLD3)或旁路互作(C-REV7-TRIP13或SHLD1-CST)的小分子调节剂可能为肿瘤的精准治疗带来曙光。此外，除了DSBs修复，Shieldin在抗体类别转换重组、端粒保护以及停滞复制叉等其它生物学过程发挥重要功能[15]，是今后需要开辟与延续的研究方向。
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