2. 重庆央都生物研究院药学部, 重庆 408000;
3. 重庆医科大学北碚附属医院, 重庆 400700;
4. 重庆市中医院药剂科，重庆 400011;
5. 重庆医科大学附属第一医院皮肤科, 重庆 400016
2. Dept of Pharmacy, Chongqing Yangdu Biology Institute, Chongqing 408000, China;
3. Beibei Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400700, China;
4. Dept of Pharmacy, Chongqing Traditional Chinese Medicine Hospital, Chongqing 400011, China;
5. Dept of Dermatology, the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China
炎症是天然免疫反应的关键因素，可以减轻组织损伤。但是炎症持续时间过长，组织损伤程度会加重[1-2]。研究表明LPS是革兰氏阴性菌外膜内毒素的致病成分，能够激活多种信号通路，如免疫和炎症反应的紊乱等[3]。白藜芦醇苷(piceid，PD)是从传统中药虎杖中提取的单体化合物，近年来研究发现，PD具有多种重要的生物学功能，如抗氧化、抗血栓形成等。以PD作为主要活性成分的虎黄烧伤搽剂(生产厂家：重庆喜旋生物科技有限公司，规格：50 mL/瓶，批准文号：国药准字Z20010151)能够促进创面愈合，调控机体免疫能力。然而其在抗炎作用中的研究机制尚未阐明。本研究旨在探究PD在LPS引起的炎症反应中的影响及分子机制，为揭示PD的治疗机制以及其在临床用药中的运用提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 材料PD(批号: 09042022)购自美国LKT实验室，用二甲基亚砜(DMSO)(购自国药集团化学试剂有限公司)溶解配制成10 mmol·L-1的贮存液储藏于-20 ℃冰箱。抗体Anti-JNK1/2兔抗人单克隆抗体、Anti-ERK1/2鼠抗人单克隆抗体购自Abcam公司，Anti-p38MAPK、Anti-p-JNK1/2、Anti-p-ERK1/2和Anti-p-p38MAPK兔抗人单克隆抗体购自美国Cell Signaling公司。ELISA试剂盒购自Abcam公司；RPMI 1640培养液、DMEM培养液和胎牛血清均购自美国Gibco公司，BCA蛋白定量检测试剂盒购自Bio-Rad公司，细胞裂解液RIPA购自碧云天生物技术有限公司。羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG均购自美国Santa Cruz公司，引物序列由上海生物工程有限公司合成。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养RAW264.7(小鼠巨噬细胞)细胞系来自中国科学院细胞库。细胞系在DMEM高糖正常培养基(包括10% FBS、100 kU·L-1青霉素和100 g·L-1链霉素)在加湿5% CO2 37 ℃培养箱中培养。
1.2.2 MTT采用MTT法测定细胞活力。将1×105 RAW264.7细胞接种于96孔板中，培养过夜，然后用PD(0、1.0、3.0、5.0 μmol·L-1)处理48 h，每孔加入MTT(5 g·L-1)，培养3 h。然后去除培养基，用DMSO(100 μL/孔)溶解结晶紫，最后用酶标仪在570 nm处测定。
1.2.3 Western blot将RAW264.7细胞接种，过夜培养。LPS(1 mg·L-1)诱导2 h，在指示时间点PD(20、40、80 μmol·L-1)进行预处理。用RIPA (1% PMSF和1% DTT)提取总细胞蛋白，提取细胞质和核蛋白。采用BCA蛋白试剂盒测定蛋白质浓度，变性蛋白用SDS-PAGE凝胶分离并转移到PVDF膜。用5%脱脂牛奶室温封闭PVDF膜1 h，PVDF膜与一抗(1 ∶ 1 000)4 ℃过夜孵育。之后用TBST洗涤，并与二抗(1 ∶ 5 000)在室温下孵育2 h。利用Bio-Rad发光试剂盒与Chemi DocTMMP成像系统采集图像。
1.2.4 流式细胞仪检测密度为1.5×105 RAW264.7细胞接种于24孔板过夜。用PD预处理细胞1 h，然后用LPS(1 mg·L-1)处理2 h。用不同的探针检测相应的指标，包括NO检测器DAF-FM (5 μmol·L-1，1 h)，ROS检测器DCFH2-DA(10 μmol·L-1，30 min)，Ca2+检测器Fluo-3/AM(1 μmol·L-1，1 h)或MMP检测器JC-1(10 mg·g-1，30 min)。探针孵育后，用流式细胞仪(BD，美国)采集细胞并进行检测。
1.2.5 免疫荧光染色RAW264.7细胞以1.5×108个·L-1的密度接种到共聚焦培养皿中过夜，用PD预处理4 h，并用LPS刺激(1 mg·L-1)预处理2 h。固定、打孔、封闭后，将培养皿中的细胞与抗体在4 ℃下孵育过夜。最后将细胞与Alexa Fluor 594二抗孵育1 h。Hoechst 33342染色显示细胞核。在共聚焦显微镜系统(Leica，Wetzlar，德国)下收集荧光图像。
1.2.6 ELISA按照说明书准备所有试剂，工作标准液和样品。将50 μL所有样品或标准液加到适当的孔中。在每个孔中加入50 μL抗体混合物。密封板并在设置为400 r·min-1的振荡器上于室温孵育1 h。用350 μL 1×Wash buffer PT清洗3次。晾干以除去多余的液体。每孔中加入100 μL TMB显影液，并在避光中在设置为400 r·min-1的平板振荡器上孵育10 min。每孔中加入100 μL终止溶液。在平板振荡器上将平板摇晃1 min以进行混合记录450 nm处的OD。
1.2.7 荧光测定RAW264.7细胞以4×108个·L-1的密度过夜接种于96孔板中。用PD预处理细胞1次，然后在有或没有LPS的情况下再孵育2 h。用JC-1(10 mg·L-1)和DCFH2-DA(100 μmol·L-1)染色30 min。最后通过荧光显微镜捕获荧光图像。
1.2.8 统计学分析所有数据以x±s表示，所有实验数据重复3次，而后采用GraphPad Prism 6.0软件通过单向方差分析或Student's t检验进行分析。
2 结果 2.1 PD减少LPS引起的炎症反应利用MTT试验, 计算不同浓度的PD(1.0、3.0、5.0和7.0 μmol·L-1)处理后的细胞生存率，结果提示不同浓度的PD处理细胞48 h后，细胞的存活率分别为(98.56%、96.51%、96.56%、87.24%)。因此，在后续实验中将选用浓度1.0-5.0 μmol·L-1。
利用流式细胞术检测PD对于上述指标的影响，发现PD预处理呈剂量依赖性的方式抑制LPS刺激的亚硝酸盐水平和iNOS蛋白的表达。如Fig 1所示，LPS处理的细胞亚硝酸盐水平急剧升高。流式细胞术检测表明，PD可以减少细胞NO生成。COX-2蛋白的表达无影响。
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| Fig 1 PD reduced LPS-induced inflammatory response (x±s, n=3) A: PD cytotoxicity in RAW264.7 cells; B: PD reduced the inflammatory response; C: Effect of PD on the expression of COX-2 and iNOS; D: Flow cytometry detection and analysis. *P＜0.05 vs LPS group |
利用ELISA检测PD处理后相关因子的水平，结果显示，LPS诱导促炎细胞因子TNF-α和IL-6的产生(Fig 2)。同时，用PD预处理可明显抑制LPS处理后TNF-α和IL-6的产生。
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| Fig 2 PD reduced expression of LPS-induced pro-inflammatory cytokines (x±s, n=3) A、B：ELISA of TNF-α and IL-6 levels; C：Flow cytometry analysis of Fluo-3/AM labeled cells. *P＜0.05 vs LPS group |
利用蛋白印记方法检测MAPK和Nrf2/HO-1通路相关蛋白表达，如Fig 3所示，PD明显抑制p-JNK1/2、p-ERK1/2和p-p38MAPK的蛋白水平，但对JNK1/2、ERK1/2和p38MAPK总量的表达无影响。
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| Fig 3 Effect of PD on MAPK and Nrf2/HO-1 pathways (x±s, n=3) *P＜0.05 vs LPS group |
利用DCFH2-DA检测ROS的产生，结果表明，PD明显抑制LPS诱导的RAW264.7细胞ROS生成(Fig 4A)。另外还采用免疫荧光法和细胞内ROS试剂盒检测细胞内ROS的产生。结果表明，PD降低了细胞内ROS水平(Fig 4B、C)。LPS破坏线粒体膜电位(MMP)的稳定性，不利于维持细胞正常的生理功能。本研究利用免疫荧光染色发现通过LPS刺激(绿色染色)增加JC-1单体，但PD的预处理降低了JC-1单体，使其恢复为聚集体(红色荧光)(Fig 4D)。
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| Fig 4 PD inhibited production of reactive oxygen species and reduced mitochondrial membrane potential (x±s, n=3) A、B、C：Immunofluorescence and intracellular ROS kit to detect intracellular ROS production; D：JC-1 probe to detect cell mitochondrial membrane potential (MMP). *P＜0.05 vs LPS group. |
研究表明，LPS可激活巨噬细胞中的Nrf2信号通路。在本研究检测PD对Keap1-Nrf2信号通路的影响。如Fig 5所示，LPS刺激可诱导Keap1表达上调，而PD预处理则Keap1蛋白表达略有下调。用PD预处理可增加RWA264.7细胞中Nrf2和HO-1蛋白的表达。与NC和LPS刺激组相比，PD的预处理提高了细胞核中Nrf2蛋白水平，但降低了细胞质中的蛋白水平。
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| Fig 5 Effect of PD on Keap1-Nrf2 signaling pathway (x±s, n=3) A: Keap1, Nrf2y and HO-1 level detection; B: Nuclear and cytoplasmic Nrf2 level detection; C: Quantitative analysis of differences in Keap1, Nrf2y and HO-1 level of each group). *P＜0.05 vs LPS group |
在多个细胞上特异性发现的TLR4在炎症过程中起着重要的作用。在LPS和MD2存在下，TLR4二聚，调节NF-κB、MAPK和其他信号级联，通过促炎细胞因子释放诱导病原体特异性天然免疫反应。为了评价TLR4是否参与PD的抗炎过程，采用蛋白印迹检测不同浓度PD处理后TLR4的表达情况。我们的结果表明，PD减弱了LPS诱导的TLR4的表达(Fig 6)。
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| Fig 6 Toll-like receptors involved in anti-inflammatory process of resveratrol glycosides (x±s, n=3) *P＜0.05 vs LPS group |
炎症反应是生命中常见的病理反应，存在于各种组织和器官中[1]。炎症与许多疾病的发生和发展过程有关，包括中风、关节炎、神经退行性疾病和心血管疾病等[2]。因此，抑制炎症在炎症相关疾病治疗中起关键作用。PD具有多种重要的生物学功能，如抗氧化、抗血栓形成等，然而其抗炎作用的研究还相对较少。基于传统中药研究的经验，PD的药用价值使其被添加到越来越多的成药中。具有代表性的成药虎黄烧伤搽剂，以PD为主要活性成分，其治疗烧伤效果显著，主要的适应症为严重烧伤引起的休克和细菌感染等。本文旨在进一步探索PD抗炎作用的分子机制，为拓展其临床应用打下理论基础。
本研究采用LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型，发现PD减少LPS引起的炎症反应，并减少LPS诱导的促炎细胞因子的表达。而且大量证据表明与TLR4结合的LPS可以激活许多炎症途径，如MAPKs途径[2-6]。据报道TLR4和MAPKs信号通路参与炎症反应[6]。在LPS诱导的RAW264.7细胞中增强JNK1/2、p38、ERK1/2的磷酸化[7]。本研究显示PD明显抑制了JNK1/2、p38、ERK1/2的磷酸化，而没有改变总JNK1/2、p38、ERK1/2蛋白质水平的激活。此外，我们的结果表明TLR4参与PD的抗炎过程。综上所述，PD通过介导NF-κB和MAPKs途径表现出抗炎作用。
文献报道ROS的产生介导了各种炎症信号通路，从而促进了炎症反应[8]。MMP以及ROS45也是重要的炎症反应信号。因此抑制ROS或促进MMP可能也是炎性疾病最重要的治疗靶点[9]。本研究发现，PD明显降低了ROS的产生并恢复了线粒体膜电位，从而减轻了炎症反应。
越来越多的证据表明，HO-1是一种抗氧化酶，在血红素降解中起着至关重要的作用，是氧化应激和炎症细胞病理生理条件的重要机制[8]。本研究结果表明，用PD预处理可降低Keap1表达，促进Nrf2核易位并在体外诱导HO-1。更有文献报道Nrf2作为调节HO-1表达的主要蛋白，通常与Keap1一起分布在细胞质中。但是，当Keap1在氧化应激下降解时，Nrf2释放并迁移到细胞核，然后诱导HO-1表达[9-11]。
LPS诱导其下游通路的活化可导致细胞分泌大量的炎症因子，同时使iNOS和NO表达增加。然而MAPKs在LPS诱导的细胞反应中起重要作用，研究发现LPS能够诱导激活MAPK通路。此外HO-1对于降低促炎COX-2和iNOS水平至关重要，这有助于减少COX-2衍生的PGE2和iNOS衍生的NO的产生[12]。HO-1是由Nrf2介导的，通过调节抗氧化反应，Nrf2在改善细胞氧化应激和炎症损伤方面起着至关重要的作用。在正常情况下，Nrf2位于细胞质中，其抑制蛋白是Keap1[13-14]。在应激条件下，Nrf2与Keap1解离，转运到细胞核中，与抗氧化反应元件结合，从而诱导Ⅱ期解毒酶和细胞保护基因，如HO-1[11, 15-17]。综上，PD可能通过MAPK和Nrf2/HO-1通路对RAW264.7细胞表现出抗炎和抗氧化作用。因此，PD可以作为研究和开发炎性疾病的潜在药物。
| [1] |
成鹏, 黄帅, 杨宇, 等. 网络药理学挖掘丹参-苦参药对提取物的抗炎药效及分子机制研究[J]. 中国药理学通报, 2021, 37(2): 270-6. Cheng P, Huang S, Yang Y, et al. Network pharmacology to explore the anti-inflammatory effects and molecular mechanism of Danshen-Sophora flavescens on extracts[J]. Chin Pharmacol Bull, 2021, 37(2): 270-6. doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2021.02.022 |
| [2] |
Reuter S, Gupta S C, Chaturvedi M M, et al. Oxidative stress, inflammation, and cancer How are they linked?[J]. Free Radical Biol Med, 2010, 49(11): 1603-16. doi:10.1016/j.freeradbiomed.2010.09.006 |
| [3] |
Cheng N, Liang Y R, Du X P, et al. Serum amyloid A promotes LPS clearance and suppresses LPS-induced inflammation and tissue injury[J]. EMBO Reports, 2018, 19(10): e45517-21. |
| [4] |
薛彬. 谷胱甘肽S-转移酶P1在细菌脂多糖引起的炎症反应中的调控作用[D]. 南京: 南京大学, 2006. Xue B. The regulatory role of glutathione S-transferase P1 in the inflammatory response caused by bacterial lipopolysaccharide[D]. Nanjing: Nanjing Univ, 2006. |
| [5] |
曹承华, 贺雅静, 高荧苒, 等. LPS介导的炎症反应过程及作用机制[J]. 河南大学学报(医学版), 2017, 36(1): 70-6. Cao C H, He Y J, Gao Y R, et al. LPS-mediated inflammatory response process and mechanism[J]. J Henan Univ (Med Edit), 2017, 36(1): 70-6. |
| [6] |
Choi Y H, Kang H J. Fructus sophorae attenuates secretion of proinflammatory mediators and cytokines through the modulation of NF-kappa B and MAPK signaling pathways in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages[J]. Gen Physiol Biophys, 2016, 35(3): 323-31. |
| [7] |
Kim J B, Han A R, Park E Y, 等. Inhibition of lPS-induced iNOS, COX-2 and cytokines expression by poncirin through the NF-κB inactivation in RAW 264.7 macrophage cells[J]. Korean J Pharmacogn, 30(12): 2345-51. |
| [8] |
米靖. 白藜芦醇通过上调SOCS-1蛋白调节牙髓卟啉单胞菌脂多糖引起的成骨细胞氧化应激反应的实验研究[D]. 北京: 中国医科大学, 2019. Mi J. Resveratrol regulates the oxidative stress response of osteoblasts induced by Porphyromonas dental pulp by up-regulating SOCS-1 protein[D]. Beijing: Chin Med Univ, 2019. |
| [9] |
Christopher S W, Moss M, Raymond N D. The role of cyclooxygenases in inflammation, cancer, and development[J]. Oncogene, 1999, 18(55): 7908-16. doi:10.1038/sj.onc.1203286 |
| [10] |
Otterbein L E, Bach F H, Alam J, et al. Carbon monoxide has anti-inflammatory effects involving the mitogen-activated protein kinase pathway[J]. Nat Med, 2000, 6(4): 422-8. doi:10.1038/74680 |
| [11] |
Ferris C D, Jaffrey S R, Sawa A, et al. Haem oxygenase-1 prevents cell death by regulating cellular iron[J]. Nat Cell Biol, 1999, 1(3): 152-7. doi:10.1038/11072 |
| [12] |
Suh G Y, Jin Y, Yi A K, et al. CCAAT/Enhancer-Binding protein mediates carbon monoxide-induced suppression of cyclooxygenase-2[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2006, 35(2): 220-6. doi:10.1165/rcmb.2005-0154OC |
| [13] |
Baird L, Dinkova-Kostova A T. The cytoprotective role of the Keap1-Nrf2 pathway[J]. Archives Toxicol, 2011, 85(4): 241-72. doi:10.1007/s00204-011-0674-5 |
| [14] |
Ye M, Wang Q, Zhang W F, et al. Oroxylin A exerts anti-inflammatory activity on lipopolysaccharide-induced mouse macrophage via Nrf2/ARE activation[J]. Biochem Cell Biol, 2014, 92(5): 337-48. doi:10.1139/bcb-2014-0030 |
| [15] |
Kensler T W, Wakabayashi N, Biswal S. Cell survival responses to environmental stresses via the Keap1-Nrf2-ARE pathway[J]. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 2007, 47: 89-116. doi:10.1146/annurev.pharmtox.46.120604.141046 |
| [16] |
Choi H G, Lee D S, Li B, et al. Santamarin, a sesquiterpene lactone isolated from Saussurea lappa, represses LPS-induced inflammatory responses via expression of heme oxygenase-1 in murine macrophage cells[J]. Int Immunopharmacol, 2012, 13(3): 271-9. doi:10.1016/j.intimp.2012.04.016 |
| [17] |
Francesca O, Yessica Z C, Elisa B, et al. Polydatin and resveratrol inhibit the inflammatory process induced by urate and pyrophosphate crystals in THP-1 cells[J]. Foods, 2019, 8(11): 560. doi:10.3390/foods8110560 |