2. 郑州大学第五附属医院药学部，河南 郑州 450052
2. Dept of Pharmaceutics, the Fifth Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, China
胶质瘤属中枢神经系统最常见肿瘤，发病率、死亡率都较高，且目前临床上治疗效果不佳[1]。程序性死亡因子配体1(programmed death ligand 1，PD-L1)水平升高是多种肿瘤细胞逃避T细胞杀伤的重要机制[2]，在胶质母细胞瘤中，抑制PD-L1上调可阻断T细胞杀伤的敏感性[3]。肝素结合表皮生长因子(heparin-binding epidermal growth factor，HBEGF)在胶质母细胞瘤中表达和功能研究于1988年首次报道，在胶质母细胞瘤中高表达，体外实验验证HBEGF可以促进胶质瘤细胞的增殖，并诱导HBEGF mRNA表达，提示HBEGF可能以自分泌的方式促进胶质瘤进展[4]；目前研究发现，HBEGF表达与肝细胞癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、结肠癌、黑素瘤、神经胶质瘤和成胶质细胞瘤的形成有关，但具体机制有待进一步确定[5]。白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)与白介素-6类似，作为免疫调节因子，可通过自分泌方式影响免疫功能[6]，研究发现，LIF在前列腺癌细胞中可能通过激活蛋白酪氨酸激酶1/信号转导子与激活子3通路上调PD-L1基因表达，从而发挥癌细胞转移和免疫功能[7]；子宫中HBEGF与LIF存在协同作用，促进子宫内膜建立受容性[8]。但胶质母细胞瘤中HBEGF、LIF、PD-L1三者之间关系尚不清楚。因此，本研究以U251、U87细胞作为研究对象，探讨三者之间的关系，以期为临床上治疗胶质母细胞瘤提供一定依据。
1 材料与方法 1.1 细胞株与试剂星形胶质瘤细胞系U251、U87均购自中国科学院细胞库，目录号分别为：TCHu 58、TCHu 138。一抗LIF、PD-L1、β-actin抗体和GAPDH、HBEGF、LIF中和抗体均购自荷兰Hycult Biotech公司，批号分别为：HC4537、HC7584、HC1052、HM1022、HM4258、HM2015；HBEGF购自美国Abnova公司，批号：063201。规律间隔的短回文重复序列/核酸内切酶9(CRISPR/Cas9)基因组编辑技术构建HBEGF基因敲除U251、U87细胞系(已鉴定，购自英国abcam公司)。
1.2 仪器7500型RT-qPCR仪由美国ABI公司提供；Tanon 4100型全自动凝胶成像分析系统由上海Tanon科技有限公司提供。
1.3 细胞培养与分组U251使用含10%胎牛血清的改良Eagle培养基、U87使用含10%胎牛血清的低限量Eagle培养基置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，每天观察细胞状态，待细胞密度达90%时1 ∶ 3传代培养，部分细胞置于液氮中保种，部分进行实验。实验1：在正常U251、U87细胞中，实验分为空白组(NC group，不做处理)、抗GAPDH组(anti-mGAPDH group，添加GAPDH中和抗体)、抗HBEGF组(anti-hHBEGF group，添加HBEGF中和抗体)(正常细胞密度至90%时1 ∶ 3传代，收集此时细胞记为passage 0，添加抗GAPDH组添加终浓度为10 μg·L-1 GAPDH中和抗体，抗HBEGF组添加终浓度为10 μg·L-1 HBEGF中和抗体培养细胞，每天观察细胞状态，细胞密度90%时1 ∶ 3比例传代，传代1次记为passage 1，2次为passage 2，3次为passage 3，检测细胞中LIF、PD-L1 mRNA和蛋白水平)；实验2：实验分为空白组(NC group，正常细胞)、HBEGF对照组(mock group，正常细胞转染空载体mock)、HBEGF敲除组(HBEGF KD group，HBEGF敲除细胞)，分别在上述细胞基础上添加HBEGF(HBEGF对照组使用HBEGF敲除的阴性对照稳定细胞系，HBEGF敲除组使用敲除HBEGF的细胞系。5 μL HBEGF质粒DNA、10 μL Lipofectamine 2000分别用250 μL无血清、无抗生素细胞培养液稀释，室温静置15 min后二者混合形成DNA-Lipofectamine 2000混合物，将混合物添加上述空白组、HBEGF对照组、HBEGF敲除组37 ℃，5% CO2培养箱中孵育6 h，6 h后更换为完全培养液，继续培养24 h，不添加DNA-Lipofectamine 2000混合物以及添加DNA-Lipofectamine 2000混合物各组检测细胞中LIF、PD-L1 mRNA和蛋白水平)；实验3：在HBEGF敲除细胞系中，实验分为对照组(control group，不做处理)、HBEGF组(HBEGF group，添加HBEGF)、HBEGF+抗GAPDH组(HBEGF+anti-mGAPDH group，添加HBEGF和GAPDH中和抗体)、HBEGF+抗LIF组(HBEGF+anti-LIF group，添加HBEGF和LIF中和抗体)(HBEGF敲除细胞系中密度至80%时，HBEGF+抗GAPDH组和HBEGF+抗LIF组分别添加终浓度为10 μg·L-1的GAPDH、HBEGF中和抗体，细胞传代3代。除对照组外，其余各组添加HBEGF DNA-Lipofectamine 2000混合物孵育6 h，更换为对应培养液继续培养24 h，收集细胞，检测细胞中PD-L1 mRNA和蛋白水平)。每个实验重复孔均为6个，实验重复4次。
1.4 RT-qPCR检测细胞中LIF、PD-L1 mRNA水平TRIzol法提取细胞中总RNA，cDNA第一条链合成试剂盒合成cDNA，RT-qPCR仪检测细胞中HBEGF、LIF、PD-L1 mRNA水平。LIF F 5′-CCGCATAGTCGTGTACCTT-3′、R 5′-ATTTGGGTTTAGCGATGC-3′，PD-L1 F 5′-GGTGGTGCCGACTACAA-3′、R 5′-TAGCCCTCAGCCTGACAT-3′，β-actin F 5′-CCCAGCACAATGAAGAAGATCAA-3′、R 5′-GATCCACACGGAGTACTTG-3′。20 μL反应体系：10 μL 2×SYBR qPCR Mix，1 μL cDNA(50 mg·L-1)，F/R(均为10 μmol·L-1)各0.5 μL，8 μL ddH2O；反应条件：94 ℃、60 s；95 ℃、30 s，(HBEGF：61 ℃、40 s，LIF：58 ℃、60 s，PD-L1：60 ℃、20 s)，40个循环；72 ℃、5 min。2-ΔΔCt法计算HBEGF、LIF、PD-L1相对表达水平。
1.5 蛋白免疫印迹实验检测细胞中LIF、PD-L1蛋白水平收集细胞至离心管中，蛋白裂解液冰上裂解细胞10 min，4 ℃ 12 000 r·min-1离心20 min，上清液为收集细胞总蛋白。每孔上样蛋白20 μg、上样体积20 μL，凝胶电泳分离蛋白、经聚偏氟乙烯膜转膜、5%脱脂奶粉室温封闭膜2 h后，对应加入一抗LIF、PD-L1、β-actin，4 ℃孵育过夜；加入对应二抗室温孵育1 h；DAB显色试剂盒避光显色，全自动凝胶成像分析系统拍照和定量分析。
1.6 统计学分析统计学软件SPSS 25.0、GraphPad 8.0对数据进行分析。xena browser获取GDC TCGA-GBM数据集，Pearson分析原发性胶质瘤样本中HBEGF、LIF和PD-L1 mRNA相关性。计量数据以x±s描述，多组间比较行单因素方差分析，进一步两两比较行SNK-q法。
2 结果 2.1 基于GDC TCGA-GBM数据集分析HBEGF、LIF和PD-L1 mRNA相关性本次包含155例胶质母细胞瘤样本转录组测序数据。通过xena browser获取GDC TCGA-GBM数据集中样本类型为原发性胶质瘤的样本中HBEGF、LIF和PD-L1 3个基因的mRNA表达数据。Pearson分析发现，胶质母细胞瘤组织中HBEGF与LIF、HBEGF与PD-L1、LIF与PD-L1 mRNA两两间均呈正相关性(r=0.525、0.404、0.501，P均＜0.05)，如Fig 1。
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| Fig 1 Correlation analysis of HBEGF, LIF and PD-L1 mRNA based on GDC TCGA-GBM data set A: HBEGF was related to LIF; B: HBEGF was related to PD-L1; C: LIF was related to PD-L1 |
传代(0、1)代，空白组、抗GAPDH组、抗HBEGF组U251和U87细胞中LIF、PD-L1 mRNA和蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05)。传代2代，在U87细胞中，分别与空白组、抗GAPDH组相比，抗HBEGF组PD-L1 mRNA和蛋白、LIF蛋白水平降低(P＜0.05)。传代3代，在U251和U87细胞中，分别与空白组、抗GAPDH组相比，抗HBEGF组LIF、PD-L1 mRNA和蛋白水平降低(P＜0.05)。见Fig 2、3, 提示HBEGF对胶质母细胞瘤U251、U87中LIF、PD-L1表达起到维持作用。
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| Fig 2 Effect of HBEGF neutralizing antibody treatment on levels of LIF and PD-L1 mRNA in cells (x±s, n=6) A: LIF mRNA; B: PD-L1 mRNA. 0:passage 0, 1:passage 1, 2:passage 2; 3:passage 3. *P < 0.05; **P < 0.01 vs NC or anti-mGAPDH group. |
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| Fig 3 Effect of HBEGF neutralizing antibody treatment on levels of LIF and PD-L1 protein in cells (x±s, n=6) A: LIF, PD-L1 protein expression in U251 cells; B: LIF PD-L1 protein level in U87 cells. 0:passage 0, 1:passage 1, 2:passage 2; 3:passage 3. *P < 0.05, **P < 0.01 vs NC or anti-mGAPDH group. |
分别在U251、U87细胞中敲除HBEGF，敲除HBEGF细胞中HBEGF蛋白表达水平降低(P＜0.05), 见Fig 4。在U251细胞中，在HBEGF外显子3中敲除5′-ATTCCAGCCGCCTGTTCTTC-3′，20个碱基, 见Fig 5。
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| Fig 4 Effect of knocking out HBEGF on levels of HBEGF protein in cells (x±s, n=6) **P < 0.01 vs NC group. |
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| Fig 5 Sanger sequencing results of knocking out HBEGF gene in U251 cells |
在U251、U87细胞中，分别与空白组、HBEGF对照组相比，HBEGF敲除组细胞中LIF、PD-L1 mRNA和蛋白水平降低(P＜0.05)；在空白组、HBEGF对照组、HBEGF敲除组中添加HBEGF后，LIF、PD-L1 mRNA和蛋白水平升高(P＜0.05)。Fig 6、7提示，敲除HBEGF后胶质母细胞瘤U251、U87中LIF、PD-L1表达降低，而添加HBEGF后可促进LIF、PD-L1的表达。
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| Fig 6 Effect of knocking out HBEGF on levels of LIF and PD-L1 mRNA in cells (x±s, n=6) *P < 0.05 vs mock group; #P < 0.05 vs HBEGF WT group; &P < 0.05 vs HBEGF KD group. |
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| Fig 7 Effect of knocking out HBEGF on levels of LIF and PD-L1 protein in cells (x±s, n=6) *P < 0.05 vs mock group; #P < 0.05 vs HBEGF WT group; &P < 0.05 vs HBEGF KD group. |
与对照组相比，HBEGF组PD-L1 mRNA和蛋白水平升高(P＜0.05)；与HBEGF组、HBEGF+抗GAPDH组相比，HBEGF+抗LIF组PD-L1 mRNA和蛋白水平降低(P＜0.05)，见Fig 8、9。提示LIF中和抗体处理可部分削减HBEGF处理对HBEGF敲低的胶质母细胞瘤细胞中PD-L1表达的诱导作用，HBEGF诱导LIF是HBEGF诱导并维持PD-L1表达的一个中间过程。
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| Fig 8 Effect of LIF neutralizing antibody treatment on level of PD-L1 mRNA in HBEGF-treated HBEGF knockout cells (x±s, n=6) *P < 0.05 vs HBEGF KO group; #P < 0.05 vs HBEGF KO+HBEGF group; &P < 0.05 vs HBEGF KO+anti-mGAPDH group. |
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| Fig 9 Effect of LIF neutralizing antibody treatment on level of PD-L1 protein in HBEGF-treated HBEGF knockout cells (x±s, n=6) *P < 0.05 vs HBEGF KO group; #P < 0.05 vs HBEGF KO+HBEGF group; &P < 0.05 vs HBEGF KO+anti-mGAPDH group. |
胶质母细胞瘤是中枢神经系统中最恶性肿瘤，具有高度异质性，由肿瘤细胞及成胶质细胞瘤干细胞组成，这些细胞易存在耐药性且存在肿瘤复发性，治疗具有一定难度。临床上常用药物为替莫唑胺，替莫唑胺作为一种烷基化学治疗剂，可诱导DNA链断裂，但使用患者通常表现出耐药性，为治疗胶质母细胞瘤增加难度[9]。免疫治疗颠覆传统治疗方法，成为目前研究热点，可以提高血液中T细胞比例，延长中位生存时间，具有巨大潜力，但仍处于初步阶段[10]。PD-L1作为一种重要的免疫抑制蛋白，可在癌细胞中高表达，通过细胞介导癌细胞免疫逃逸。PD-L1或PD-1或二者的特异性阻断剂可恢复T细胞功能并导致癌细胞死亡，但受肿瘤异质性以及肿瘤微环境影响，在许多类型的实体瘤中，PD-L1免疫抑制检查点治疗受到限制[11]。
HBEGF具有与表皮生长因子(epithelial growth factor，EGF)相似的生物活性，可促进细胞分裂、促进癌细胞存活或生长，参与癌细胞转移、入侵过程，且分布广泛，可作为临床上靶向因子，是临床上恶性肿瘤治疗的新途径[12]。HBEGF可能以自分泌的方式促进胶质瘤进展[13]。抗HBEGF抗体作为活性成分的癌症治疗剂和增殖抑制剂，可用于治疗胃癌、食管癌、肝癌、卵巢癌、脑瘤等多种癌细胞，抗HBEGF抗体对于癌细胞增殖、迁移、浸润具有强烈的抑制作用，且已申请专利；在结肠癌中，EGF促进结肠癌干细胞中PD-L1的产生和运输[14]。LIF是一种多生物学功能趋化性细胞因子，为白介素-6家族成员之一，因最早发现可促进小鼠M1型白血病细胞分化并抑制其增殖而命名[15]，具有广泛的生物学活性，在胶质瘤中作为生长因子，其水平升高可促进胶质瘤细胞分化[16]。且LIF调控PD-L1的表达，进而影响肿瘤迁移、侵袭过程[17]。本研究通过分析GDC-TCGA GBM数据集发现，HBEGF基因在胶质母细胞瘤组织中的mRNA表达水平与PD-L1及LIF的mRNA表达水平，显示HBEGF与LIF正相关系数为0.525、HBEGF与PD-L1正相关系数为0.404、LIF与PD-L1正相关系数为0.501，P均＜0.000 1，相关系数在0.3-0.7之间具有良好的相关性，且与PD-L1相比，LIF与HBEGF相关性更强；与HBEGF相比，LIF与PD-L1相关性强，提示HBEGF与LIF关系紧密通过PD-L1发挥作用。HBEGF中和抗体处理后U251、U87细胞中LIF、PD- L1 mRNA和蛋白水平随着细胞传代次数的增加而逐渐降低，提示HBEGF通过自分泌方式影响LIF、PD-L1的表达。敲除HBEGF后可显著降低LIF、PD-L1 mRNA和蛋白的表达，而进一步添加HBEGF后LIF、PD-L1 mRNA和蛋白表达升高，提示HBEGF处理可显著恢复HBEGF敲低的胶质母细胞瘤细胞中PD-L1和LIF的表达水平。LIF中和抗体处理后PD-L1水平降低，提示HBEGF处理后升高的PD-L1水平可被LIF中和抗体降低，但却不能完全改变PD-L1。以上结果显示，HBEGF可能部分通过诱导LIF表达/分泌来维持胶质母细胞瘤中PD-L1的表达水平。
综上所述，在胶质母细胞瘤中，HBEGF部分通过LIF上调PD-L1的表达，本文首次验证了胶质母细胞瘤中HBEGF、LIF、PD-L1三者之间的关系，为临床上治疗胶质母细胞瘤提供一定参考。
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