类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种发病机制未知、对多个关节有影响的慢性、全身性自身免疫反应的疾病，主要病理表现为持续性的、慢性的滑膜炎性增生和形成的大量血管翳，导致关节损伤及不可逆性破坏，最终使得关节功能丧失[1]。在RA的发病过程中，涉及多种类型细胞之间的相互作用，其中成纤维样滑膜细胞起关键作用。该细胞可异常增殖、迁移、侵袭至血管及关节，也能在炎症环境下发生能量代谢异常，反过来促进其活化和滑膜炎症[2-3]。因此，抑制成纤维样滑膜细胞的活力，阻止其被活化，是治疗RA的关键，对RA药物的开发具有重要作用。
化合物Q-1来源于苗药铁筷子，是ACX库中未发现的全新化合物Q-1，课题组初步研究发现其具有抗炎、有效控制人RA成纤维滑膜细胞增殖的作用[4-5]。因此，本研究采用人RA成纤维样滑膜细胞株(MH7A)为研究对象，建立TNF-α引起的细胞炎症模型，基于NF-κB和MAPK信号通路来探索化合物Q-1的作用及机制，为化合物Q-1开发为RA的治疗药物提供理论支撑和实验依据。
1 材料 1.1 细胞人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞株(MH7A)，购自吉妮欧生物公司。
1.2 药物、试剂与仪器化合物Q-1为实验室自制(纯度为98%以上)，甲氨蝶呤(MTX)(Sigma公司，批号BCBN2516V)；胎牛血清(FBS)(BI公司，批号2033119)；DMEM高糖培养基(Gibico公司，批号8120500)；二甲亚枫(DMSO)(Solarbio公司，批号1012D031)；人TNF-α重组蛋白(Peprotech公司，批号041525E1319)；CCK-8试剂盒(Bioss公司，批号AI04156754)；TNF-α和IL-6 ELISA试剂盒、兔抗人p38蛋白抗体(Abcam公司，批号分别为GR3323551-1，GR3336678-1，GR3215674-8)；兔抗人p-p38、IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK和p-JNK蛋白抗体(CST公司，批号分别为4511T，4812S，2859T，8242T，3033T，4695T，4370T，9252T，4668T)；兔抗人GADPH蛋白抗体(杭州贤至公司，批号AB-P-R 001)；山羊抗兔HRP二抗(Bioss公司，批号019116)。二氧化碳培养箱、1510全自动酶标仪(Thermo Fisher Scientic)；SM-CJ-2F超净工作台(苏州安泰空气技术公司)；TS-100倒置成像显微镜、BX53F电子显微镜(OLYMPUS)；ST16R台式冷冻离心机(Thermo)；CT100R离心机(天美科技有限公司)；Western Blot装置(BIO-RAD)；超灵敏多功能化学发光成像系统曝光机(Bio-Rad ChemiDocTMTouch)。
2 方法 2.1 细胞培养MH7A细胞在含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基、37 ℃、5% CO2的培养箱里培养，湿度为100%。当细胞长到培养瓶80%以上时，常规传代，取5-10代细胞用于实验。
2.2 CCK-8法检测化合物Q-1对MH7A细胞增殖-毒性影响将MH7A细胞接种于96孔板，每孔10 000个，设空白孔(无细胞组)、对照孔(不加药物组)和药物组，37 ℃、5% CO2培养过夜后，每孔加入不同浓度化合物Q-1及MTX [6]，每组设5个复孔。24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，放入培养箱继续孵育1 h。用酶标仪测定450 nm处的各孔吸光度(OD)值。计算MH7A细胞存活率和抑制率：细胞存活率/%=(OD实验孔-OD空白孔)/(OD对照孔-OD空白孔)× 100%，细胞抑制率/%=(OD对照孔-OD实验孔)/(OD对照孔-OD空白孔)× 100%。
2.3 Transwell迁移实验① 均匀接种MH7A细胞于T25培养瓶，随机分为5组，孵育过夜。给药干预24 h后，分别消化细胞，用无血清培养基调整细胞浓度为2×108 L-1。②在Transwell小室的下室加入20% FBS培养基800 μL，上室加入150 μL细胞悬液，继续培养24 h，每组设3个复孔。③取出Transwell小室，PBS洗净，甲醇固定15 min。④0.1%结晶紫染液染色30 min，清水反复清洗多次后，用湿棉签轻轻擦去上室底部膜表面上的细胞。⑤利用手术刀片摘取Transwell膜，将底部朝上瞭干。放于载玻片上，加入中性树胶封片，在高倍镜(100×)下选取中间和四周5个视野拍照。⑥采用ImageJ软件计数，计算穿过小室下室膜的细胞数，取平均值，计算迁移率，细胞迁移率/%=实验组迁移细胞数平均值/对照组迁移细胞数平均值× 100%。
2.4 酶联免疫吸附测定(ELISA)将MH7A细胞以5×107个·L-1密度均匀接种在24孔板，随机分为6组，放入37 ℃、5% CO2培养箱24 h，加入相应药物干预24 h，收集细胞上清液-20 ℃保存备用。按照试剂盒说明书进行测定。将相关样品加入酶板，贴上覆膜，室温避光振摇1 h。之后洗板3次，加入TMB显影液，避光摇10 min，加入终止液，酶标仪450 nm处测定。
2.5 蛋白质印迹检测① 细胞总蛋白提取：均匀接种MH7A细胞于T75培养瓶，随机分为6组。培养过夜，加入相应药物干预24 h，按照分组加或不加TNF-α溶液使终浓度为10 μg·L-1，刺激30 min。用预冷的PBS清洗细胞2次，消化，离心，得细胞沉淀，加入混合裂解液(2% Triton100 ∶PMSF ∶蛋白酶抑制剂∶磷酸酶抑制剂=99 ∶1 ∶1 ∶1)，在冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r·min-1条件下离心25 min，所得上清即为蛋白原液。②BCA法测定蛋白浓度，稀释到同一浓度并分装，保存在-80 ℃冰箱。③凝胶电泳：使用BIO-RAD的免染胶，恒压100 V进行电泳。④转膜：半干转法。在25 V、2.5 A条件下转膜6 min。⑤封闭：5% BSA溶液室温下封闭1 h。⑥抗体孵育：加入相对应的一抗溶液，放在4 ℃冰箱孵育过夜，d 2回收一抗，1×TBST洗膜3次，每次10 min。加入二抗溶液室温下孵育1 h。同样方法洗膜洗3次。⑦ECL显影，得到蛋白条带。采用Bio-Rad ChemiDocTM Touch系统的Image Lab分析软件对蛋白条带进行灰度分析。以GADPH作为标准，将各组蛋白的灰度值均一化。使用均一化后的灰度值计算，得到蛋白相对表达水平，即蛋白相对表达水平＝各组蛋白灰度值/正常组蛋白灰度值。
2.6 统计学分析所有数据分析均采用SPSS 17.0统计软件，采用单因素方差分析，组间差异使用多重比较，若方差齐性选用LSD，若方差不齐选用Tamhane，结果用x±s表示。
3 结果 3.1 CCK-8法检测化合物Q-1对MH7A细胞增殖-毒性影响结果如Tab 1所示，与空白组相比，MH7A细胞的存活率随着化合物Q-1浓度增加而明显降低，抑制率随着化合物Q-1浓度增加而明显升高(P < 0.05)。为确保化合物Q-1对细胞活力有抑制作用且无毒，选择100、50、25 mg·L-1浓度的化合物Q-1和5 μmol·L-1 MTX作为后续实验的浓度。
| Group | Cell viability/% | Cell inhibition/% | |
| Control | 100 | 0 | |
| Q-1 200 mg·L-1 | 65.73±3.95* | 52.56±9.29* | |
| Q-1 100 mg·L-1 | 73.28±6.31* | 37.28±11.93* | |
| Q-1 50 mg·L-1 | 81.84±7.09* | 22.91±11.07* | |
| Q-1 25 mg·L-1 | 88.02±3.84* | 13.75±4.85* | |
| MTX 5 μmol·L-1 | 82.07±7.81* | 22.72±11.46* | |
| *P < 0.05 vs control group | |||
如Tab 2、Fig 1所示，与空白组比较，各给药组的迁移细胞数明显减少，细胞迁移率明显下降(P < 0.01)，提示化合物Q-1和MTX对MH7A的迁移能力有抑制作用。
| Group | Number of migration cells | Migration index/% |
| Control | 119±29.17 | 1.00 |
| MTX | 63±4.16* | 54.00±3.49*# |
| Q-1 100 mg·L-1 | 47±4.11* | 39.20±3.45* |
| Q-1 50 mg·L-1 | 64±25.39* | 53.67±21.29 |
| Q-1 25 mg·L-1 | 84±7.85*# | 70.02±6.56*# |
| *P < 0.05 vs control group; #P < 0.01 vs Q-1 100 mg·L-1 group | ||
|
| Fig 1 Effect of compound Q-1 on migration of MH7A A. Control group B. MTX group C. Q-1 100 mg·L-1 group D. Q-1 50 mg·L-1 group E. Q-1 25 mg·L-1 group |
结果见Tab 3，与空白组相比，TNF-α组细胞上清液中的TNF-α、IL-6含量均升高(P < 0.01)，说明炎症因子释放增加，造模成功；与TNF-α组相比，各给药组明显降低TNF-α、IL-6含量(P < 0.01)，且呈浓度依赖性。
| Group | TNF-α /ng·L-1 | IL-6 /ng·L-1 |
| Control | 417.28±8.82 | 435.09±27.96 |
| TNF-α | 695.65±26.93* | 897.41±12.41* |
| TNF-α+MTX | 530.27±9.61*# | 340.97±5.50*# |
| TNF-α+Q-1/mg·L-1 | ||
| 100 | 467.49±2.10*#△ | 281.57±8.36*#△ |
| 50 | 470.69±22.54*#△ | 322.02±12.19*# |
| 25 | 537.59±19.26*# | 333.49±23.41*# |
| *P < 0.01 vs control group; #P < 0.01 vs TNF-α group; △P < 0.01 vs MTX group | ||
结果见Tab 4、Fig 2，经TNF-α诱导后，p65、p-p65、IκBα、p-IκBα蛋白表达均有所增加。给予药物干预后，以上蛋白表达均有所下降，其中MTX和25 mg·L-1的化合物Q-1可明显下调p-p65的表达(P < 0.05)，100、50 mg·L-1的化合物Q-1可明显降低p65、p-p65、p-IκBα蛋白的表达(P < 0.05)，但所有给药组对于IκBα蛋白的表达水平无明显影响(P > 0.05)。提示化合物Q-1主要通过抑制磷酸化后p65和IκBα蛋白表达，有效抑制NF-κB通路的异常激活，阻止炎症反应的发生。
| Group | p65 | p-p65 | IκBα | p-IκBα |
| Control | 1 | 1 | 1 | 1 |
| TNF-α | 1.40±0.27* | 1.21±0.21 | 1.40±0.16 | 1.20±0.06 |
| TNF-α+MTX | 1.11±0.14 | 0.73±0.11*# | 1.31±0.26 | 0.79±0.18 |
| TNF-α+Q-1/mg·L-1 | ||||
| 100 | 0.81±0.14# | 0.16±0.06*#△ | 0.85±0.50 | 0.59±0.13# |
| 50 | 0.97±0.34# | 0.40±0.18*#△ | 0.87±0.49 | 0.76±0.05*# |
| 25 | 1.04±0.22 | 0.48±0.20*#△ | 1.15±0.60 | 0.95±0.23 |
| *P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 vs TNF-α group; △P < 0.05 vs MTX group | ||||
|
| Fig 2 Effect of compound Q-1 on protein expression levels of p65, p-p65, IκBα and p-IκBα in MH7A induced by TNF-α |
结果如Tab 5、Fig 3如示，在TNF-α的刺激下，p38、p-p38、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK蛋白的表达均有所增加。各给药组可降低TNF-α诱导的MH7A细胞p38、p-p38蛋白表达水平(P < 0.05)，对ERK、p-ERK、JNK、p-JNK蛋白表达水平影响不大(P > 0.05)。提示化合物Q-1可能主要对p38、p-p38蛋白表达起作用，从而抑制MAPK通路的激活，减轻MAPK通路介导的炎症反应。
| Group | p38 | p-p38 | ERK | p-ERK | JNK | p-JNK |
| Control | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| TNF-α | 1.18±0.12 | 1.40±0.31 | 2.14±0.52 | 1.25±0.28 | 2.12±0.99 | 1.08±0.14 |
| TNF-α+MTX | 0.67±0.11*# | 0.72±0.21 | 1.67±0.67 | 1.10±0.23 | 1.86±0.58 | 1.00±0.33 |
| TNF-α+Q-1/mg·L-1 | ||||||
| 100 | 0.50±0.21*# | 0.26±0.09*# | 1.48±1.26 | 0.81±0.36 | 1.68±0.79 | 0.99±0.19 |
| 50 | 0.74±0.18*# | 0.37±0.07*# | 1.56±0.64 | 1.17±0.29 | 1.90±0.63 | 1.14±0.24 |
| 25 | 0.92±0.12# | 0.56±0.23# | 1.67±1.00 | 1.24±0.18 | 1.91±1.28 | 1.01±0.28 |
| *P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 vs TNF-α group | ||||||
|
| Fig 3 Effect of compound Q-1 on protein expression levels of p38, p-p38, ERK, p-ERK, JNK, p-JNK in MH7A induced by TNF-α |
RA发病机制复杂，成纤维样滑膜细胞以及促炎细胞因子(TNF-α、IL-6等)在疾病进展中起着非常重要的作用，主要体现为促进RA免疫系统激活、滑膜炎和关节破坏。在促炎细胞因子刺激下，滑膜细胞异常增殖活化，并表现出肿瘤样行为，包括迁移、侵袭，是造成RA患者滑膜组织增生和关节被破坏的主要原因[7]。与此同时，成纤维样滑膜细胞可以分泌各种促炎细胞因子，反过来促进其增殖和释放炎症因子，让更多的免疫细胞进入炎症微环境，这样就会形成一种恶性循环，持续促进RA滑膜炎的发展进程，从而导致软骨损伤和关节破坏[8]。本研究表明，化合物Q-1可明显抑制MH7A细胞的增殖和迁移，减少TNF-α、IL-6的表达，控制RA滑膜炎症，减缓RA病程进展。
NF-κB信号通路炎症研究的经典通路之一，在RA病理过程中发挥重要作用，早已被大家重视并得到公认。NF-κB信号通路可以调控炎性细胞因子的表达，并在炎性细胞因子刺激下持续激活，从而介导炎症反应[3]。在正常情况下，NF-κB受到IκB家族蛋白的抑制，在受到细胞外信号刺激如TNF-α等刺激后，导致IκBα上游激酶如IKK的活化，激活的IKK可磷酸化IκBα，使其被泛素化降解，释放NF-κB进入细胞核启动转录，诱导促炎细胞因子的产生[9]。抑制NF-κB途径的主要效应单位NF-κB p65和IκBα可以减轻炎症反应，改善RA进程[10-11]。Western blot结果显示，化合物Q-1可显著下调由TNF-α引起的NF-κB p65、IκBα以及磷酸化的NF-κB p65、IκBα表达水平，表明化合物Q-1可能通过调控NF-κB信号通路的激活而阻止炎症介质的转录启动，从而发挥抗RA作用。
MAPK信号通路也是炎症信号转导通路之一，其中的经典三条途径是p38、JNK、ERK，可以调节成纤维样滑膜细胞的生长、凋亡和分化，在RA滑膜炎症和关节破坏至关重要[12-13]。MAPK途径经TNF-α刺激活化，引起通路上相关蛋白磷酸化而介导炎症反应[14]。本研究结果显示，化合物Q-1可下调由TNF-α引起的p38及其磷酸化p38的蛋白表达水平，但对JNK和ERK以及磷酸化的JNK和ERK的表达蛋白无明显影响，提示化合物Q-1主要通过调控p38、p-p38蛋白的表达而抑制MAPK信号通路激活，从而减少炎症的发生起到抗RA作用。
综上所述，化合物Q-1可能通过调控p65、IκBα介导的NF-κB信号通路和p38介导的MAPK信号通路，抑制MH7A细胞增殖、迁移，减少炎症因子TNF-α、IL-6的分泌从而减少炎症的发生，减轻RA的症状改善RA进程。
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