2. 陕西省中药饮片工程技术研究中心, 陕西 咸阳 712046
2. Engineering Technology Research Center of Shaanxi Administration of Chinese Herbal Pieces, Xianyang Shaanxi 712046, China
类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种常见的慢性、侵蚀性、进行性自身免疫性疾病，以关节滑膜炎及血管翳为病理特征，临床表现为以小关节受累为主的对称性多关节炎，常以发作期、缓解期交替出现为临床特点，病情反复难以遏制，致残率高，严重影响生活质量，其发病原因及发病机制至今尚不能完全明确[1]。现临床常用的慢作用抗风湿药(slow-acting antirheu matic drugs，SAARDs)、非甾体类抗炎药(non-steroidal antiinflammatory drugs, NSAIDs)、糖皮质激素、生物制剂等均能有效控制RA病情，缓解疼痛，但同时会导致胃肠道反应、肝肾功能损害及骨髓抑制等[2]。自古医案记载及现代研究表明，中医外治法作为重要的辅助手段，在缓解RA关节疼痛、肿胀、晨僵方面疗效显著，经皮给药剂型可避免因胃肠道吸收而导致的不良反应，具有起效快、作用直接、增强疗效等优势[3]。
祖师麻(Cortex Daphnes)，这一名称最早记载于《陕西中药志》，为瑞香科(Thymelaeaceae)植物黄瑞香(Daphne giraldii Nitsche)、唐古特瑞香(Daphne tangutica Maxim)及凹叶瑞香(Daphne retusa Hemsl)的干燥茎皮及根皮，同科属的结香也作祖师麻入药，性温，味辛苦，有小毒，具有祛风除湿，散瘀止痛之功效。《中国药典》(1977年版)收载“祖师麻来源为瑞香科植物黄瑞香、陕甘瑞香、凹叶瑞香的干燥茎皮及根皮，其性温、味辛苦，具有祛风湿，活血止痛之功效。”《湖北中草药》记载，金腰带这一草药来源为唐古特瑞香和尖瓣瑞香，并且记录了唐古特瑞香又称祖师麻、夜梦花。有舒筋通络，活血止痛的功效。用于胃痛、风湿疼痛、腰疼、跌打损伤、骨折等症[4]。
虽然祖师麻治疗RA的疗效比较明确，但其具体的分子机制仍需进一步研究，本研究通过网络药理学的方法，对祖师麻治疗RA的通路进行预测，并应用分子对接技术验证预测结果。
1 材料与方法 1.1 祖师麻活性成分获取通过TCMSP(https://tcmspw.com/tcmsp.php)数据库，筛选条件OB(口服生物利用度)≥30%, 且DL(类药性)≥0.18和TCMIP(http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/Login/login.html)、BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm.)等数据库筛选、结合PubMed进行相关文献检索，确定其活性成分。
1.2 祖师麻化学成分靶点的获取将文献中整理补充的活性成分在Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，获得成分的SMILES结构式，在蛋白质数据库Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)，筛选成分对应的靶基因并与数据库中筛选的靶点基因整理去重后作为祖师麻有效成分的靶点，供后续分析。
1.3 风湿关节痛疾病靶点预测在GeneCards(https://www.genecards.org/)数据库中，用“rheumatoid arthritis”作为关键词，检索与RA相关的疾病靶点，将数据整合即得。
1.4 药物-疾病基因交集将祖师麻活性成分的靶点与RA的靶点取交集，并绘制venny图，可以清晰的得到药物与疾病靶点的交集靶点。交集显示出的靶点则为祖师麻活性成分作用于RA的靶点。
1.5 蛋白相互作用(PPI)网络的构建String数据库(https://string-db.org)是一个可以检索已知蛋白之间和预测靶点蛋白质之间互相作用的系统。将1.4项下得到的交集靶点导入String数据库，以Homo sapiens为分析条件，得到活性成分治疗RA相关靶点的互作关系。
1.6 GO富集和KEGG通路分析对筛选好的交集靶点导入DAVID数据库进行GO富集分析和KEGG通路分析。通过GO富集分析可以粗略了解差异基因富集在哪些生物学功能、途径或者细胞定位[5]。得到生物过程、细胞组分、分子功能、KEGG通路富集分析并绘制气泡图，其中，节点的大小和颜色表示富集到的靶点数量。
1.7 祖师麻活性成分-RA-靶点-通路网络的构建把“1.4”项下中获取的交集靶点，在Excel中分别建立活性成分-靶点、疾病-靶点之间的对应关系[6]。以及通过KEGG通路富集得到的主要通路-靶点，将其导入Cytoscape 3.7.2软件中，制作出祖师麻成分-疾病-靶点-通路的信息网络[7]，在网络中风湿关节炎、祖师麻有效成分、蛋白靶点和通路由节点表示。节点之间的相互关系用边表示。
1.8 活性成分与关键靶点的分子对接验证分子对接是通过匹配原则，计算并预测配体与受体的相互作用模式，常用于病毒表位蛋白设计及现代疫苗和药物开发中[8]。将筛选出的祖师麻活性成分采用Chem Draw19.0画出化合物的结构，然后用Chem 3D 19.0转化为三维结构，并使用MM2力场进行优化，输出mol2结构，通过Atoudocktool-1.5.6软件转变为.pdbqt格式。在RCSB蛋白质数据库(www.rcsb.org)，下载具有蛋白质-配体复合物的晶体，通过Atoudocktool-1.5.6及其附带的激动剂化合物确定作用位点的三维坐标。在Atoudocking vina 1.1.2软件中进行分子对接[9]。选取结合自由能最小的构象用Discovery Studio 2016 Client进行结果分析。
2 结果 2.1 祖师麻活性成分的获取通过筛选整理，祖师麻活性成分22个。分别为7-8-二羟基香豆素(7-8-dihydroxycoumarin)、2, 4, 6-三羟基苯甲酸乙酯(2, 4, 6-trihydroxybenzoic acid ethyl ester)、4-甲基-7-羟基香豆素(4-methyl-7-hydroxycoumarin)、7-8-二甲氧基香豆素(7-8-dimethoxycoumarin)、7-羟基-8甲氧基香豆素(7-hydroxy-8-methoxycoumarin)、7-羟基香豆素(7-hydroxycoumarin)、β-谷甾醇(β - sitosterol)、白桦酸(betulinic acid)、刺五加苷E(eleutheroside E)、大黄素甲醚(Physcion)、丁香树脂酚(syringaresinol)、对羟基苯甲酸(P-hydroxybe)、胡萝卜苷(carotene)、木犀草素(luteolin)、齐墩果酸(oleanolic acid)、芹菜素(apigenin)、瑞香苷(daphnin)、山奈酚(kaempferol)、双白瑞香素(daphnoretin)、樱花苷(sakuranin)、芫花素(genkwanin)、芫花烯(genkwadaphnin)等。
2.2 祖师麻活性成分靶点的获取将筛选出的活性成分导入Swiss Target Prediction数据库中，获取各活性成分的靶点基因427个。
2.3 疾病靶点的预测结果在GeneCards数据库中将疾病的靶点进行整理，最终获取4 329个与RA有关的疾病相关靶点。
2.4 药物-疾病交集结果将427个活性成分靶点与4 329个疾病靶点取交集，结果显示，交集靶基因共有273个。并制作韦恩图，发现祖师麻对RA的靶点基因映射率为6.1%，提示祖师麻对治疗RA有一定的特异性治疗，见Fig 1。
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| Fig 1 Wayne diagram of active components of Zushima and targets of rheumatoid arthritis |
将交集基因导入String(https://string-db.org/)数据库中，构建蛋白相互作用网络，经拓扑参数分析展示Degree值较高的前十位核心靶点，见Tab 1。AKT1(RAC-α丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶) 是3种AKT之一，包括新陈代谢、细胞存活和血管生成。MAPK3(丝裂原活化蛋白激酶3), MAPK/ERK级联通过调控转录、翻译、细胞骨架重排等多种生物学功能，调节细胞生长、黏附和分化等生物学功能。TNF(肿瘤坏死因子)主要由巨噬细胞分泌，可诱导某些肿瘤细胞死亡。VEGFA(血管内皮生长因子A)在血管生成和内皮细胞生长中起着重要的作用。STAT3(信号转导和转录激活因子3)通过调节初生CD4(T细胞表面糖蛋白)的分化来调节炎症反应。
| Number | Core target | Uniprot ID | Degree |
| 1 | AKT1 | P31749 | 128 |
| 2 | MAPK3 | P27361 | 110 |
| 3 | TNF | P01375 | 110 |
| 4 | VEGFA | P15692 | 109 |
| 5 | STAT3 | P40763 | 100 |
| 6 | EGFR | P00533 | 97 |
| 7 | SRC | P12931 | 94 |
| 8 | CASP3 | P42574 | 92 |
| 9 | JUN | P05412 | 88 |
| 10 | MAPK8 | P45983 | 83 |
| Category | GO |
Term |
P |
| GOTERM_CC_FAT | GO: 0044459 | plasma membrane part | 5.98E-14 |
| GOTERM_CC_FAT | GO: 0005887 | integral to plasma membrane | 4.92E-15 |
| GOTERM_CC_FAT | GO: 0031226 | intrinsic to plasma membrane | 1.42E-14 |
| GOTERM_MF_FAT | GO: 0000166 | nucleotide binding | 1.11E-07 |
| GOTERM_MF_FAT | GO: 0001882 | nucleoside binding | 1.92E-13 |
| GOTERM_MF_FAT | GO: 0001883 | purine nucleoside binding | 1.21E-12 |
| GOTERM_BP_FAT | GO: 0007166 | cell surface receptor linked signal transduction |
3.42E-16 |
| GOTERM_BP_FAT | GO: 0007242 | intracellular signaling cascade | 4.75E-25 |
| GOTERM_BP_FAT | GO: 0006796 | phosphate metabolic process | 4.11E-32 |
将交集基因导入DAVID(https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp)数据库中进行GO富集分析和KEGG通路分析。GO富集分析共得到1 376个富集结果，如Fig 2-4所示。其中包含生物过程(biological process，BP) 1 128项，细胞组分(cellular component，CC) 89项，分子功能(molecular function，MF) 159项。根据count值由大到小排序，在BP、CC、MF中挑选出排名前10的条目。其中，生物过程主要涉及细胞表面受体连接信号转导、细胞内信号级联、磷酸盐代谢过程等。细胞组分主要涉及质膜部分、与质膜整合、质膜固有等。分子功能主要涉及核苷酸结合、核苷结合、嘌呤核苷结合等。
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| Fig 2 Bubble diagram of cell components (TOP10) 1:plasma membrane part; 2:integral to plasma membrane; 3:intrinsic to plasma membrane; 4:cytosol; 5:cell traction; 6:membrane－enclosed lumen; 7:organelle lumen; 8:insoluble fraction; 9:membrane fraction; 10:plasma membrane |
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| Fig 3 Molecular function bubble diagram (TOP10) 1:nucleotide binding; 2:nucleoside binding; 3:purine nucleoside binding; 4:transition metal ion binding; 5:purinen ucleotide binding; 6:adenyl nucleotide binding; 7:ribonucleotide binding; 8:purinen ribonucleotide binding; 9:ATP binding; 10:adenyl ribonucleotide binding |
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| Fig 4 Bubble diagram of biological process (TOP10) 1:cell surface receptor linked signal transduction; 2:intracellular signaling cascade; 3:phosphorus metabolic process; 4:phosphate metabolic process; 5:regulation of cell proliferration; 6:phosphorylation; 7:protein amino acid phosphorylation; 8:response to organic substance; 9:homestatic process; 10:positive regulation of molecular function |
在KEGG通路分析结果中涉及58条信号通路，去除比较广泛的通路，挑选出排名前10的信号通路为主要生物学通路。结果如Fig 5，节点的颜色由红色至绿色表明P值由大到小，因此绿色节点越大该条信号通路的重要性越高。主要涉及细胞的焦点黏附(focal adhesion)通路，在细胞-细胞外基质接触点，形成了特殊的结构，称为焦点黏连。黏着斑复合物(FAC)与多种炎症性疾病的发病机制有关，包括IBD、RA和多发性硬化症[10]。细胞基质黏附在细胞运动、细胞增殖、细胞分化、基因表达调控和细胞存活等重要生物学过程中起着重要作用；趋化因子信号通路，炎症性免疫反应要求在外来侵袭时将白细胞聚集到炎症部位，而趋化因子是一种小的趋化肽，为细胞的转运提供方向线索，因此对保护性宿主反应至关重要；MAPK信号通路，丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)参与细胞的增殖、分化和迁移等多种功能，见Tab 3。
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| Fig 5 Bubble chart of KEGG pathway analysis (TOP10) 1:focal adhesion; 2:chemokine signaling pathway; 3:MAPK signaling pathway; 4:calclum signaling pathway; 5:neurotrophin signaling pathway; 6:T cell receptor signaling pathway; 7:regulation of actin cytoskeleton; 8:JAK-STAT signaling pathway; 9:fcepsilon RI signaling pathway; 10:VEGF signaling pathway |
| Pathway | ID | Count | Gene | P-value |
| Focal adhesion | hsa04510 | 29 | ERBB2, SRC, AKT1, IGF1R, PTK2, BCL2, PIK3CA, PIK3R1, PIK3CG, EGFR, FLT1, MAP2K1, BRAF, PIK3CB, FLT4, PIK3CD, MET, MAPK10, BAD, KDR, CCND1, FYN, JUN, GSK3B, VEGFA, MAPK3, PDGFRA, PDGFRB, MAPK8 | 1.74×10-8 |
| Chemokine signaling pathway |
hsa04062 | 23 | PIK3CG, MAP2K1, LYN, FGR, BRAF, PIK3CB, CCR1, PIK3CD, CXCR1, NFKB1, CXCR2, PRKCD, STAT3, AKT1, PTK2, CCR6, PTK2B, GSK3B, MAPK3, GRK6, PIK3CA, JAK2, PIK3R1 | 1.16×10-5 |
| MAPK signaling pathway | hsa04010 | 23 | EGFR, TNF, MAP2K1, BRAF, HSPA1A, NFKB1, MAPK10, CDC25B, AKT1, RPS6KA3, CASP3, JUN, MAP3K8, MAPK3, NTRK2, PDGFRA, PLA2G1B, PDGFRB, MAPK8, FGF1, MAP3K14, FGF2 | 4.25×10-3 |
| Neurotrophin signaling pathway |
hsa04722 | 21 | PIK3CG, MAP2K1, BRAF, PIK3CB, PIK3CD, NFKB1, BAD, MAPK10, PRKCD, PTPN11, AKT1, RPS6KA3, PSEN1, GSK3B, JUN, BCL2, NTRK2, MAPK3, PIK3CA, MAPK8, PIK3R1 | 1.97×10-7 |
| Calcium signaling pathway | hsa04020 | 21 | EGFR, PTGER1, DRD1, NOS1, ADORA2B, CYSLTR1, ADORA2A, ERBB2, GRM5, AGTR1, CD38, P2RX7, PTK2B, CHRM2, HRH2, PDGFRA, PDGFRB, NOS3, CHRNA7, NOS2, HTR2A | 4.97×10-5 |
| T cell receptor signaling pathway |
hsa04660 | 20 | PIK3CG, PTPRC, PTPN6, TNF, MAP2K1, PIK3CB, PIK3CD, NFKB1, CDK4, AKT1, FYN, GSK3B, JUN, LCK, MAP3K8, MAPK3, PIK3CA, MAP3K14, PIK3R1, IL2 | 9.71×10-8 |
| Regulation of actin cytoskeleton |
hsa04810 | 17 | EGFR, PIK3CG, BRAF, MAP2K1, LIMK1, PIK3CB, PIK3CD, PTK2, CHRM2, F2, MAPK3, PDGFRA, PDGFRB, PIK3CA, FGF1, FGF2, PIK3R1 | 2.04×10-2 |
| VEGF signaling pathway | hsa04370 | 16 | PIK3CG, MAP2K1, PTGS2, PIK3CB, PIK3CD, BAD, SRC, KDR, AKT1, PTK2, VEGFA, MAPK3, PLA2G1B, PIK3CA, NOS3, PIK3R1 | 4.09×10-7 |
| Fc epsilon RI signaling pathway |
hsa04664 | 16 | PIK3CG, TNF, MAP2K1, LYN, PIK3CB, PIK3CD, MAPK10, PRKCD, AKT1, FYN, MAPK3, PLA2G1B, PIK3CA, MAPK8, PIK3R1, SYK | 6.99×10-7 |
| JAK-STAT signaling pathway | hsa04630 | 16 | PIK3CG, PTPN6, PIK3CB, PIK3CD, BCL2L1, STAT3, PTPN11, AKT1, TYK2, CCND1, EP300, JAK1, PIK3CA, JAK2, PIK3R1, IL2 | 2.33×10-3 |
通过Cytoscape3.7.2构建祖师麻活性成-RA-靶点-通路的作用网络。经网络图分析可知网络图中包含节点(node)308个，节点与节点之间的作用关系用边(edge)表示，共有633条边。其中焦点黏附、趋化因子信号通路、MAPK信号通路(、神经营养因子信号通路、钙信号通路等均涉及AKT1、MAPK3、MAP2K1、BRAF、MAPK8、MAPK10、JUN、EGFR等众多基因，与祖师麻中活性成分的作用靶点高度对应，体现了祖师麻在治疗RA的过程中多成分，多靶点的作用机制。
2.8 分子对接验证结果将筛选后祖师麻的22个活性成分作为配体分子与风湿关节炎相关的靶蛋白TNF、AKT1、MAPK3、VEGFA、STAT3、EGFR、SRC、CASP3、JUN、MAPK8等核心靶点作为受体蛋白进行分子对接，用配体分子与受体蛋白的对接结合能的值绘制热图，见Fig 6。其中，结合能 < -5.0(kJ·mol-1)，则表明结合性能良好，< -7(kJ·mol-1)，则表明结合性能较好[11]。结合能越小，对接结果越好。热图结果显示祖师麻中22个活性成分能均能与核心靶蛋白有较好的结合，其中双白瑞香素、瑞香苷、大黄素甲醚等成分显示出相对较好的对接结果。
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| Fig 6 Thermal map of molecular docking results |
利用Discovery Studio 2016 Client对结合性最好的双白瑞香素与MAPK3、SRC等10个可信靶蛋白结果进行分析，由Fig 7靶点蛋白与成分的2D结构可知，双白瑞香素均与MAPK3、AKT1、EGFR等靶蛋白中的PHEA氨基酸的残基有相互作用，其与MAPK3中的PHEA：346、348氨基酸残基，AKT1中的PHEA：55，EGFR中的PHEA：795氨基酸残基之间存在范德华力，还与EGFR中的PHEA：997氨基酸残基形成pi-堆积作用。与MAPK3、SRC、TNF、STAT3、EGFR等靶蛋白中的THRA氨基酸的残基有相互作用，其与MAPK3中的THRA：347，SRC中的THRA：508，EGFR中的THRA：847氨基酸残基间形成范德华力；TNF中的THRA：77，STAT3中的THRA：440氨基酸残基间形成氢键。与MAPK3、SRC、MAPK8等靶蛋白中GLNA氨基酸的残基有相互作用，其与MAPK8中的GLNA：37，SRC中的GLNA：497氨基酸残基间形成范德华力，与MAPK3中的GLNA：90氨基酸残基间形成氢键。与SRC、VEGFA等靶蛋白中GLUA、ALAA氨基酸的残基有相互作用, 其与SRC中的GLUA：510，ALAA：514氨基酸残基间形成pi-阳离子键和pi-聚酰胺烷基键，与VEGFA中的GLUA：67，ALAA：61、104氨基酸残基间形成范德华力，GLUA：64氨基酸残基间形成pi-阴离子键。与SRC、TNF、AKT1、EGFR等靶蛋白中的PROA氨基酸的残基有相互作用，其与，SRC中的PROA：507，TNF中的PROA：90，EGFR中的PROA：741，AKT1中的PROA：388氨基酸残基间形成范德华力，还与AKT1中的PROA：51间形成碳氢键，EGFR中的PROA：794氨基酸残基间形成pi-σ键。AKT1中的ARGA: 328间形成pi-阳聚酰胺烷基键, MAPK3中的ARGA: 74间形成pi-阳离子键等。
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| Fig 7 Molecular docking results |
经过文献挖掘，发现7-8-二羟基香豆素、瑞香苷、双白瑞香素、刺五加苷E、山奈酚、β-谷甾醇等22种具有潜在抗RA的成分，其涉及到治疗的机制包括细胞表面受体连接信号转导、细胞内信号级联、磷酸盐代谢过程、质膜部分、核苷酸结合、蛋白激酶活性的调节、神经系统过程、细胞内稳态等。
根据KEGG通路分析得知祖师麻可能通过焦点黏着通路发挥抗RA作用，通路中的一部分信号分子参与了膜受体与肌动蛋白细胞骨架之间的结构联系，另一部分信号分子参与触发信号传导。肌动蛋白纤维束通过连接斑蛋白的多分子复合物靶向定位在整合素家族的跨膜受体上，整合素信号又依赖于FAK(黏着斑激酶)和SRC(原癌基因酪氨酸蛋白激酶)的非受体酪氨酸激酶的活化和FAK、SRC和SHC(转化蛋白)的适配功能，从而启动下游信号事件。这些信号事件最终导致肌动蛋白细胞骨架的重组，这是改变细胞形状和运动能力以及基因表达的先决条件，类似的形态改变和基因表达的调控是由生长因子与其各自受体的结合引起的[12]。由此可知，细胞中的黏着复合物和生长因子介导的信号分子与祖师麻抗RA有密切的关联。
此外，在RA发病过程中，成纤维细胞样滑膜细胞(FLS)通过侵袭关节细胞外基质发挥重要作用。FAK信号通路是RA- FLS异常行为的重要因素[13]。RA-FLS表现为被动的促炎反应和自我导向的攻击性反应，如促炎介质的产生、细胞凋亡的减少和滑膜增厚的形成。有证据表明，Janus激酶(JAK)-信号转导子和转录激活因子(STAT)信号在被动反应中的作用，但RA-FLS的攻击行为尚不清楚[14]。TNF基因也非常重要，TNF-α因子可以诱导负责多种生物钟基因的表达，造成类风湿患者症状出现昼夜反复的情况[15]故以此条通路为切入点进一步寻找祖师麻治疗风湿关节炎的作用机制。表皮生长因子受体(EGFR)信号转导在RA发病机制中起重要作用[16]。血管生成在RA的发展中起着重要作用，它增加了对滑膜的营养物质、细胞因子和炎症细胞的供应。在RA患者的血清中，VEGF和IL-6水平与滑膜炎严重程度成正比，血管生成细胞因子PlGF和VEGF代表了US评估RA滑膜炎症的严重程度。在接受B-DMARD治疗的患者中，血清VEGF可能比CRP更能反映治疗反应[17]。
采用“1.8”项下的方法获取核心靶蛋白的原配体，并进行分子对接。结果为TNF(-6.2 kJ·mol-1)、AKT1(-6.3 kJ·mol-1)、MAPK3(-6.2 kJ·mol-1)、STAT3(-6.2 kJ·mol-1)、EGFR(-6.3 kJ·mol-1)、SRC(-6.3 kJ·mol-1)、CASP3(-6.3 kJ·mol-1)、JUN(-6.2 kJ·mol-1)、MAPK3(-6.2 kJ·mol-1)。与本实验得到的结果相比较，发现多数化合物与靶蛋白都有良好的结合能，其中双白瑞香素、瑞香苷、大黄素甲醚、刺五加苷E等活性成分与靶蛋白的结合能都低于原配体，显示出较好的对接结果。
本实验分子对接验证结果与文献报道相符[18]。通过相关网络图的构建可直观的显示出祖师麻治疗类风湿关节痛的多成分、多靶点、多途径等共同作用的特点。通过分子对接的方法对网络药理学靶点预测的可靠性进行验证，为后续研究奠定了一定的基础。但所得出的结果只是理论上的预测，祖师麻的体内作用机制仍需要进一步的动物实验验证。
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